1. Optimización de métodos para la producción de proteínas recombinantes en E. coli

2. Una de las mayores limitaciones para la utilización de estrategias de alto desempeño en el estudio de proteínas es nuestra baja capacidad para predecir los niveles de acumulación de los péptidos, ya sea usando sistemas libres de células o en E. coli.

3. Ruta molecular de producción de proteínas

4. Procedimiento general para la expresión de proteínas en E. coli Los genes de interés son clonados en un vector de expresión adecuado y transformados en la cepa apropiada de E. coli Las células se crecen en un medio que induzca la expresión del gene de interés La biomasa del cultivo se cosecha por centrifugación , se lisan las células y la proteína de interés se purifica de los lisados celulares. CADA UNO DE ESTOS PASOS PUEDE SER LIMITANTE Y POR LO TANTO ES SUSCEPTIBLE DE OPTIMIZACIÓN

5. Parámetros optimizables

6. Estrategias para optimización Expresión de la proteína y niveles de solubilidad Diseño de medios de cultivo bacterianos Diseño de vectores de expresión Diseño factorial de condiciones de cultivo

7. Optimización de la transcripción

8. Iniciación de la transcripción en E. coli

9. Secuencias consenso

10. Expresión de una proteína soluble a partir de un promotor consenso 1 y 2 – Sin inducir 3, 5 y 7 – Inducido con IPTG 4, 6 y 8 – Inducido con Lactosa 9 - Marcador de peso molecular

11. ¿Porqué IPTG? LACTOSA PURA [500 g] $ 33.18 IPTG [500 g] $ 47, 409.00

12. Represión catabólica

13. Otros inductores: Arabinosa

14. Sistema de expresión T7

15. Expresión de una proteína fluorescente soluble a partir de un promotor T7 Marcador de peso molecular 1 -- Antes de la inducción 2 -- Inducido con IPTG por 4 horas

16. Optimización de la traducción

17. Uso de codones en genes de E. coli

18. Comparación de uso de codones entre Arabidopsis y E. coli Arabidopsis E. coli

19. Predicción de eficiencia de una proteína de Arabidopsis en E. coli

20. Plan A

21. Efecto del pRare en la expresión de una proteína de Arabidopsis en E. coli

22. Plan B

23. Estrategia experimental

24. Otros parámetros En cuanto a las condiciones de cultivo, los factores que han sido optimizados con mayor frecuencia son la temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, la densidad celular en el punto de inducción y la concentración de inductor La composición del medio de cultivo también es un factor de gran interés, ya que los componentes del medio pueden afectar la producción basal de proteína recombinante, generar alta producción bajo condiciones no-inducidas o provocar liberación de la proteína al medio extracelular

25. Crecimiento del cultivo al momento de la inducción con IPTG

26. Modificación del medio de cultivo

27. Concentración del inductor (IPTG)