Instituto Federal do Rio de Janeiro
Campus Rio de Janeiro
Relatório Técnico de Estágio
Nome: Arthur Lima e Silva
Curso: Bi...
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complexos multienzimáticos
Empr...
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I. Introdução --------------------------------------------------- p.1
II. Objetivo -----------------------------------...
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atraente devido seus benefícios ambie...
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grupos de enzimas industriai...
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os como matérias-primas para ferm...
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- Meio malte 35g/L. Marca: Himedia RM004B-500G
- Shaker. Marca: New Brunswick Scientific/ Innova 42R
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- Água destilada
- Erlenmeyer 250 mL
- Bastão de vidro
- Centrífuga. Marca: Jouan A14N1.11174614
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- pHâmetro . Marca: Mettler Toledo – Seven Easy
Após o procedimento de extração, introduziu-se no erlenmeyer o eletrodo...
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- Banho 40ºC. Marca: Kacil BM-02
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5 minutos de reação. Em seguid...
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4.1.1 Cálculo da contagem de esporos
4.1.1.1 Aspergillus oryzae
 Média da contagem: 75,2 esporos
 Diluição: 1x (sem ...
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Amostra Tempo
(h)
Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das
Atividades
T.Babaçu 24 1 0,061 0,028 0,083 1,01 ...
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Uxg-1
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inoculado/ (Vol. Amostra ...
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Uxg-1
= média [FAN] x (Vol. de líquido inoculado/ Massa de matéria-prima pesada)/ Tempo de
reação
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(Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido
inoculado/ (Vol. Amostra x Massa ...
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 Média da contagem: 102,9 esporos
 Diluição: 2x
 Volume de líquido entre a câmara e
a lamínula: 25 µL
 Fator de cor...
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4.2.3 Cálculo atividade Celulolítica
 Cálculo:
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4.2.4 Cálculo atividade Proteolítica
 Cálculo:
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4.2.5 Cálculo atividade Xilanolítica
 Cálculo:
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4.2.6 Teor de água e pH
Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pH
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Soja
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4.3 Casca de soja
4.3.1 Cálculo da contagem de esporos
 Média da contagem: 36,2 esporos
 Diluição: 10x
 Volume de lí...
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4.3.2 Cálculo da atividade Celulolítica
 Cálculo:
(Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) ...
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4.3.3 Cálculo da atividade Proteolítica
 Cálculo:
(Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) ...
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4.3.4 Cálculo da atividade Xilanolítica
 Cálculo
(Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x...
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4.3.5 Teor de água e pH
Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pH
Casca de
Soja
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5. Discussão
A contagem de esporos para Aspergillus oryzae indicou 1,88 x 107
esporos/mL. Já a
contagem de esporos para...
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6. Considerações Finais
O Aspergillus awamori esporula melhor e realiza maior produção enzimática em relação
ao Aspergi...
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Relatório Final de Estágio - Arthur Lima 2-1

  1. 1. Instituto Federal do Rio de Janeiro Campus Rio de Janeiro Relatório Técnico de Estágio Nome: Arthur Lima e Silva Curso: Biotecnologia Conclusão do curso: 2011/ 2 (semestre) Data do Seminário: 2012 /1 (semestre) Rio de Janeiro 2012
  2. 2. ii Valorização de resíduos obtidos na produção de biocombustíveis pela produção fúngica de complexos multienzimáticos Empresa/Instituição: Fundação COPPETEC Endereço: Rua Moniz Aragão no : 360 complemento: Bloco 1 Bairro: Ilha do fundão / Cidade Universitária Cidade: Rio de Janeiro CEP: 21941- 972 UF: RJ Setor (es) da empresa/instituição: Laboratório de Biotecnologia Microbiana – LaBiM Responsável da Empresa/Instituição pelo Estágio: Denise Maria Guimarães Freire Cargo: Professor pesquisador Professor Orientador no IFRJ: Leila Pontes Matrícula: 1152476 Sumário
  3. 3. iii I. Introdução --------------------------------------------------- p.1 II. Objetivo ------------------------------------------------------ p.3 III. Material e Métodos -------------------------------------p.3 IV. Resultados -------------------------------------------------- p.9 IV. Discussão --------------------------------------------------- p.24 VI. Considerações Finais ------------------------------------ p.25 VII. Bibliografia --------------------------------------------------p.25 1. Introdução
  4. 4. iv O uso do biodiesel como combustível vem se tornando uma alternativa cada vez mais atraente devido seus benefícios ambientais e pelo fato de ser originado de recursos renováveis. O custo do biodiesel é a principal dificuldade da comercialização do produto. Óleos das mais diversas procedências são utilizados como matérias-primas. A transesterificação é o processo realizado com mais frequência para a produção de biodiesel. Consiste em uma reação química entre óleos vegetais, tais como o de mamona, dendê, girassol, babaçu, amendoim, pinhão manso e soja, bem como gorduras animais, com etanol ou metanol. Durante a obtenção dos óleos vegetais, são obtidos co-produtos, como tortas e farelos, que podem agregar valor à cadeia de produção do biocombustível. Na tentativa da valorização de co-produtos, inocula-se esporos de fungos filamentosos em diversas tortas de oleaginosas, promovendo assim fermentações em estado sólido (FES). Enzimas degradadoras de matéria-prima podem então ser produzidas. Os microorganismos são os mais importantes produtores enzimáticos. Os fungos filamentosos Aspergillus são organismos de importância considerável para muitas indústrias biotecnológicas. Muitas espécies de Aspergillus, tais como A. awamori e A. oryzae são utilizadas para a produção enzimática. Essas espécies produzem grande variedade de enzimas extracelulares, nas quais, amilases e proteases possuem grande importância industrial. Os fungos A. awamori IOC-3914 e A oryzae 30103 são capazes de produzir um complexo multienzimático contendo pelo menos cinco diferentes grupos de enzimas: endo- e exoamilases, proteases, xilanases e celulases, usando torta de babaçu, farelo de soja, torta de Fermentação no estado sólido Torta fermentada Processo global Pre-inóculo Enzimas Matéria-prima Glicose, xilose e nutrientes Autólise do fungo Nutrientes Hidrólise enzimática
  5. 5. v mamona, dentre outros substratos. O complexo amilolítico representa um dos mais importantes grupos de enzimas industriais atualmente. Ele atua na hidrólise de resíduos e apresenta inúmeras aplicações na indústria alimentícia, têxtil, de bioetanol, dentre outras. Esse complexo é composto por um grupo de enzimas que atuam sinergicamente na quebra de amilose (unidades de glicose unidas linearmente)e amilopectina (homopolímero de glicose com ligações lineares e ramificações) em glicose. Trabalhos mais recentes têm mostrado que tortas residuais obtidas na extração de óleos vegetais são excelentes substratos para a produção de complexos multienzimáticos por fermentações no estado sólido. Além disso, essas tortas residuais podem ser hidrolisadas pelo complexo amilolítico, liberando glicose, e pelas hidrolases acessórias, incluindo celulases, xilanases e proteases. Tendo em vista os interesses econômicos e ambientais, a produção enzimática utilizando resíduos agroindustriais apresenta muitas vantagens sobre as demais matérias- primas. No Brasil, uma matéria-prima residual abundante é a torta de babaçu., que é originada no processo de obtenção do óleo de babaçu para a indústria de biocombustíveis. 2. Objetivos
  6. 6. vi Reaproveitar resíduos vegetais obtidos na cadeia de produção do biodiesel utilizando- os como matérias-primas para fermentações no estado sólido com fungos do gênero Aspergillus. Dessas fermentações, obtém-se um extrato multienzimático que pode ser utilizado para hidrolisar, em baixas temperaturas, as mesmas matérias-primas e originar monossacarídeos e aminoácidos fundamentais para a produção de meios de cultura, síntese de etanol, biopolímeros, dentre outros. Esse trabalho visa também a investigação do potencial fúngico de produção de amilases e outras hidrolases em fermentações no estado sólido de baixos custos utilizando diferentes resíduos agroindustriais gerados no Brasil. 3. Material e Métodos 3.1 Resíduos utilizados (Provenientes da Petrobras Biocombustíveis) - Torta de babaçu - Farinha de babaçu - Casca de soja - Farelo de soja Os resíduos foram moídos, peneirados, pesados em becher de 50 mL (2,5g) e autoclavados, originando biorreatores em escala laboratorial (bécher + resíduo) - Moinho - Peneira. Marca: Granutest/Tyler 14 - Balança analítica. Marca: Gahaka BK 2000 - Autoclave. Marca: Tripoli 3.2 Preparo do pré-inóculo - Água estéril - Placa de Petri com Aspergillus awamori IOC-3914 e Aspergillus oryzae 30103 mantidos em ágar Batata-Dextrose (PDA) a 30ºC por 7 dias - Pipeta automática P1000. Marca: LabMate - Fluxo laminar Vertical. Marca: Quimis 216F21R - Tubos Falcon - Vortex. Marca: Biomatic 00/09/03 - Câmara de Neubauer. Marca: Bolco germany/ Bright line - Microscópio óptico. Marca: Zeiss Axioskop 40
  7. 7. vii - Meio malte 35g/L. Marca: Himedia RM004B-500G - Shaker. Marca: New Brunswick Scientific/ Innova 42R - Tubo tipo eppendorf Sob condições estéreis, em fluxo laminar, pipetou-se 4 mL de água estéril sobre o fungo crescido em placa de Petri. Com o tip da pipeta, raspou-se o fungo do ágar. Esse procedimento foi repetido quatro vezes. Após a raspagem, recolheu-se o líquido em tubo falcon e em tubo eppendorf. Armazenou-se o tubo falcon em geladeira. Sob condições não- estéreis, dilui-se o conteúdo do tubo eppendorf e realizou-se a contagem de esporos em câmara de Neubauer. A contagem foi efetuada em relação a cinco quadrantes da câmara superior e cinco quadrantes da câmara inferior. Multiplicou-se a média da contagem dos dez quadrantes por 25, pela diluição realizada e por 104 , encontrando-se número de células por mL contidos na solução. Em seguida, dividiu-se a quantidade inicial de células por mL desejada (2,25x107 ) pela encontrada, obtendo-se o volume a inocular, em µL. Inoculou-se o volume calculado em meio malte 35 g/L, que foi incubado em shaker por 28 horas a 30ºC/200rpm (pré-inóculo). 3.3 Inóculo -Fluxo laminar Vertical . Marca: Quimis 216F21R - Pipeta automática P10.000. Marca: LabMate - Câmara climática. Marca: Nova Ética 420/CLD-300 Para obter-se uma umidade final de 62%, pipetou-se 4,1mL do pré-inóculo nos biorreatores em escala laboratorial, sob condições estéreis, homogeneizou-se o sistema e incubou-se os mesmos em câmara climática a 30ºC e 90% de umidade. Para obter-se uma umidade final de 57%, pipetou-se 3,3mL do pré-inóculo nos biorreatores em escala laboratorial, sob condições estéreis, homogeneizou-se o sistema e incubou-se os mesmos em câmara climática a 30ºC e 90% de umidade. Para cada análise, utilizou-se dois biorreatores em escala laboratorial no intuito de tornar os resultados mais confiáveis. 3.4 Extração
  8. 8. viii - Água destilada - Erlenmeyer 250 mL - Bastão de vidro - Centrífuga. Marca: Jouan A14N1.11174614 - Shaker. Marca: New Brunswick Scientific/ Innova 42R - Pipeta automática P1000. Marca: LabMate - Tubo tipo eppendorf Transferiu-se o conteúdo fermentado do biorreator em escala laboratorial para um erlenmeyer de 250 mL juntamente com 25 mL de água destilada (10 mL de água por grama de matéria-prima). Masserou-se o conteúdo com bastão de vidro e incubou-se o erlenmeyer em shaker por 30 minutos a 37ºC/200rpm. Posteriormente, pipetou-se 3,0 mL do conteúdo do erlenmeyer para dois tubos eppendorf. Centrifugou-se os tubos por 10 minutos/10.000 rpm. Recolheu-se os sobrenadantes em um terceiro tubo. Rotulou-se e armazenou-se em geladeira para serem dosadas as atividades enzimáticas. 3.5 Análises 3.5.1 Teor de água - Equipamento: AquaLab – Series 3TE - Recipientes plásticos circulares - Água destilada - Balança analítica. Marca: Gahaka BK 2000 Introduziu-se, no equipamento, um recipiente plástico circular contendo apenas água destilada com a finalidade de calibrar o mesmo. Posteriormente, pesou-se 0,5 grama do conteúdo fermentado do biorreator em escala laboratorial em recipiente plástico circular , antes do procedimento de extração, e introduziu-se o mesmo no equipamento. Após o tempo necessário, é informado no visor o teor de água do material. 3.5.2 pH
  9. 9. ix - pHâmetro . Marca: Mettler Toledo – Seven Easy Após o procedimento de extração, introduziu-se no erlenmeyer o eletrodo do pHâmetro. Após o tempo necessário, é informado no visor do equipamento o pH do material. 3.5.3 Atividade Exoamilolítica - Banho 40ºC. Marca: Kacil BM-02 - Banho 100ºC . Marca: Novatecnica NT248 - Espectrofotômetro. Marca: Biospectro SP-22 - Cubetas de poliestireno - Pipetas p20,100,1.000. Marca: Eppendorf - Tips para pipeta - Presilhas para eppendorf. Marca: Sigma – Aldrich - Solução de amido 1%. Marca: Vetec - Reativo de GOD-POD. Marca: Katal Em uma estante, colocou-se 4 eppendorfs para cada amostra, sendo 1 branco e 3 réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Posteriormente, adicionou-se 90 µL da solução de amido 1,0% somente nas triplicatas em seguida levou-se ao banho-maria à 40ºC por 15 minutos. Em seguida, inativou-se as enzimas levando-as ao banho-maria à 100ºC durante 5 minutos (usou-se presilhas nas tampas dos eppendorfs para eles não abrirem durante a incubação). Ao retirar deste banho-maria, adicionou-se 90µL de solução de amido 1%, apenas nos brancos de cada tempo e adicionou-se 1mL do reativo de GOD-POD em todos eppendorfs. Feito isto, levou-se ao banho de 40ºC por 10 minutos para que o reativo enzimático possa interagir com a reação para então fazer a leitura. A leitura foi feita em cubeta de poliestireno a 505 nanômetros (nm) no espectrofotômetro. 3.5.4 Atividade Celulolítica
  10. 10. x - Banho 40ºC. Marca: Kacil BM-02 - Banho 100ºC . Marca: Novatecnica NT248 - Espectrofotômetro. Marca: Biospectro SP-22 - Cubetas de poliestireno - Pipetas p20,100,1.000. Marca: Eppendorf - Tips para pipeta - Presilhas para eppendorf. Marca: Sigma – Aldrich - Solução de carboxi-metil celulose (CMC). Marca: Sigma - Reativo de GOD-POD. Marca: Katal Em uma estante, colocou-se 4 eppendorfs para cada amostra, sendo 1 branco e 3 réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Posteriormente, adicionou-se 90 µL da solução de CMC somente nas triplicatas em seguida levou-se ao banho-maria à 40ºC por 10 minutos. Em seguida, inativou-se as enzimas levando-as ao banho-maria à 100ºC durante 5 minutos (usou-se presilhas nas tampas dos eppendorfs para eles não abrirem durante a incubação). Ao retirar deste banho-maria, adicionou-se 90µL de solução de CMC, apenas nos brancos de cada tempo e adicionou-se 1mL do reativo de GOD-POD em todos eppendorfs. Feito isto, levou-se ao banho de 40ºC por 10 minutos para que o reativo enzimático possa interagir com a reação para então fazer a leitura. A leitura foi feita em cubeta de poliestireno a 505 nanômetros (nm) no espectrofotômetro. 3.5.5 Atividade Proteolítica - Banho 40ºC. Marca: Kacil BM-02 - Espectrofotômetro. Marca: Biospectro SP-22 - Cubetas de poliestireno - Pipetas p100,1.000. Marca: Eppendorf - Tips para pipeta - Solução de azocaseína 5g/L pH=5,0 - Solução de HCl 1M Em uma estante, colocou-se 4 eppendorfs para cada amostra, sendo 1 branco e 3 réplicas. Adicionou-se 50µL da amostra em todos os eppendorfs. Para os brancos das amostras, adicionou-se 1mL da solução de HCL 1M. Em seguida, levou-se ao banho-maria à
  11. 11. xi 40ºC, adicionou-se 90µL da solução de azocaseína em cada tubo e incubou-se até completar 5 minutos de reação. Em seguida, inativou-se as enzimas adicionando 1mL da solução de HCL 1M nas triplicatas. Centrifugar as amostras por 5 minutos a 10000 rpm. A leitura foi feita em cubeta de poliestireno a 345 nanômetros (nm) no espectrofotômetro. 3.5.6 Atividade Xilanolítica - Banho 40ºC. Marca: Kacil BM-02 - Banho 100ºC . Marca: Novatecnica NT248 - Espectrofotômetro. Marca: Biospectro SP-22 - Cubetas de poliestireno - Pipetas p20,100,1.000. Marca: Eppendorf - Tips para pipeta - Presilhas para eppendorf. Marca: Sigma – Aldrich - Reagente DNS - Água mili-Q - Solução de xilana 10g/L Em uma estante, colocou-se 4 eppendorfs para cada amostra, sendo 1 branco e 3 réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Adicionou-se 300µL de DNS nos tubos referentes aos brancos. Em seguida, levou-se ao banho-maria à 40ºC e adicionou-se 90µL da solução de xilana 1,0% nos eppendorfs a cada 10 segundos até completar 5 minutos de reação. Em seguida, inativou-se as enzimas adicionando 300µL do reagente DNS apenas nas triplicatas a cada 10 segundos e levando-os, posteriormente, ao banho-maria à 100ºC durante 5 minutos. Ao retirar deste banho, adicionou-se 1mL de água mili-Q em cada tubo. A leitura foi feita em cubeta de poliestireno a 540nanômetros (nm) no espectrofotômetro. 4. Resultados 4.1 Torta de babaçu suplementada com farinha de babaçu (50%):
  12. 12. xii 4.1.1 Cálculo da contagem de esporos 4.1.1.1 Aspergillus oryzae  Média da contagem: 75,2 esporos  Diluição: 1x (sem diluição)  Volume de líquido entre a câmara e a lamínula: 25 µL  Fator de correção volumétrico: 104  Quantidade inicial desejada de esporos/mL : 2,25 x 107 Cálculo (esporos/mL) : 75,2 x 25 x 1 x 104 = 1,88 x 107 Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /1,88x107 = 1.196 µL 4.1.1.2 Aspergillus awamori  Média da contagem: 170 esporos  Diluição: 2x  Volume de líquido entre a câmara e a lamínula: 25 µL  Fator de correção volumétrico: 104  Quantidade inicial desejada de esporos/mL : 2,25 x 107 Cálculo (esporos/mL) : 170 x 25 x 2 x 104 = 8,50 x 107 Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /8,5x107 = 265 µL 4.1.2 Cálculo atividade exoamilolítica:  Cálculo: Uxg-1 = (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) 4.1.2.1 Aspergillus oryzae N° esporos 84 N° esporos 85 N° esporos 89 N° esporos 54 N° esporos 64 N° esporos 176 N° esporos 157 N° esporos 167 N° esporos 161 N° esporos 189
  13. 13. 13 Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades T.Babaçu 24 1 0,061 0,028 0,083 1,01 0,46 1,37 T.Babaçu 24 1 0,014 0,007 0 0,23 0,12 0,00 0,53 T.Babaçu 48 5 0,131 0,123 0,132 10,01 9,40 10,09 T.Babaçu 48 5 0,137 0,12 0,156 10,47 9,17 11,92 10,18 T.Babaçu 72 10 0,099 0,085 0,08 16,32 14,01 13,19 T.Babaçu 72 10 0,1 0,096 0,1 16,48 15,82 16,48 15,38 T.Babaçu 96 10 0,121 0,106 0,105 19,94 17,47 17,31 T.Babaçu 96 10 0,148 0,133 0,102 24,39 21,92 16,81 19,64 T.Babaçu 120 10 0,094 0,101 0,096 15,49 16,65 15,82 T.Babaçu 120 5 0,275 0,284 0,253 21,02 21,71 19,34 18,34 4.1.2.2 Aspergillus awamori Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades T.Babaçu 24 1 0,126 0,132 0,13 2,08 2,18 2,14 T.Babaçu 24 1 0,238 0,273 0,226 3,92 4,50 3,72 3,09 T.Babaçu 48 20 0,124 0,125 0,127 40,88 41,21 41,86 T.Babaçu 48 10 0,074 0,08 0,084 12,20 13,19 13,85 27,20 T.Babaçu 72 50 0,118 0,121 0,113 97,25 99,72 93,12 T.Babaçu 72 30 0,135 0,138 0,148 66,75 68,24 73,18 83,04 T.Babaçu 96 50 0,136 0,115 0,105 112,08 94,77 86,53 T.Babaçu 96 30 0,293 0,318 0,323 144,88 157,24 159,71 125,87 T.Babaçu 120 50 0,151 0,154 0,15 124,44 126,91 123,62 T.Babaçu 120 10 0,058 0,072 0,062 8,87 11,01 9,48 67,39 4.1.3 Cálculo atividade Celulolítica  Cálculo: 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 24 48 72 96 120 144 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade Amilolítica A. awamori A. oryzae
  14. 14. 14 Uxg-1 = (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) 4.1.3.1 Aspergillus oryzae Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades T.Babaçu 24 1 0,018 0,012 0,005 0,45 0,30 0,12 0,33 T.Babaçu 24 1 0,038 0 0,008 0,94 0,00 0,20 T.Babaçu 48 1 0,023 0,009 0,018 0,57 0,22 0,45 0,27 T.Babaçu 48 1 0 0,014 0,001 0,00 0,35 0,02 T.Babaçu 72 1 0,001 0,027 0,002 0,02 0,67 0,05 0,39 T.Babaçu 72 1 0,012 0,023 0,03 0,30 0,57 0,74 T.Babaçu 96 1 0,051 0,063 0,064 1,26 1,56 1,58 1,32 T.Babaçu 96 1 0,05 0,073 0,02 1,24 1,81 0,49 T.Babaçu 120 1 0,043 0,028 0,028 1,06 0,69 0,69 1,15 T.Babaçu 120 1 0,046 0,07 0,063 1,14 1,73 1,56 4.1.3.2 Aspergillus awamori Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades T.Babaçu 24 1 0,005 0,027 0,04 0,12 0,67 1,01 1,88 T.Babaçu 24 1 0,1 0,141 0,14 2,47 3,49 3,51 T.Babaçu 48 1 0,006 0,026 0,03 0,15 0,64 0,84 0,33 T.Babaçu 48 1 0 0,003 0,01 0,00 0,07 0,27 T.Babaçu 72 1 0,184 0,27 0,24 4,55 6,68 6,01 6,08 T.Babaçu 72 2 0,116 0,136 0,14 5,74 6,73 6,73 T.Babaçu 96 2 0,169 0,181 0,17 8,36 8,96 8,36 6,94 T.Babaçu 96 2 0,102 0,1 0,12 5,05 4,95 5,94 T.Babaçu 120 2 0,154 0,161 0,18 7,62 7,97 9,11 5,27 T.Babaçu 120 1 0,08 0,082 0,12 1,98 2,03 2,92 4.1.4 Cálculo atividade proteolítica  Cálculo: Concentração de FAN (Nitrogênio livre) = (Fator da curva padrão x diluição x absorbância) 0 5 10 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade celulolítica A.awamori A.oryzae
  15. 15. 15 Uxg-1 = média [FAN] x (Vol. de líquido inoculado/ Massa de matéria-prima pesada)/ Tempo de reação 4.1.4.1 Aspergillus oryzae Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Concentração de FAN Média FAN Média das Atividades T.Babaçu 24 100 0,522 0,54 396,3 410,0 401,5 140,9 T.Babaçu 24 100 0,508 0,545 385,7 413,8 T.Babaçu 48 250 0,4 0,403 759,3 765,0 770,2 281,6 T.Babaçu 48 250 0,39 0,43 740,3 816,2 T.Babaçu 72 300 0,42 0,473 956,7 1077,4 999,4 365,9 T.Babaçu 72 300 0,429 0,433 977,2 986,3 T.Babaçu 96 400 0,257 0,25 780,6 759,3 747,9 271,2 T.Babaçu 96 400 0,237 0,241 719,8 732,0 T.Babaçu 120 500 0,232 0,235 880,8 892,2 889,3 320,1 T.Babaçu 120 500 0,208 0,262 789,7 994,7 4.1.4.2 Aspergillus awamori Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Concentração de FAN Média FAN Média das Atividades T.Babaçu 24 20 0,262 0,288 39,8 43,7 41,8 1,3 T.Babaçu 24 20 0,268 0,282 40,7 42,8 T.Babaçu 48 150 0,354 0,36 403,2 410,0 394,1 136,2 T.Babaçu 48 150 0,329 0,341 374,7 388,4 T.Babaçu 72 200 0,648 0,684 984,0 1038,7 1011,4 371,8 T.Babaçu 72 200 0,678 0,654 1029,6 993,2 T.Babaçu 96 400 0,26 0,246 789,7 747,1 764,6 281,8 T.Babaçu 96 400 0,246 0,255 747,1 774,5 T.Babaçu 120 500 0,197 0,207 747,9 785,9 767,8 281,9 T.Babaçu 120 500 0,191 0,214 725,1 812,4 4.1.5 Cálculo atividade xilanolítica  Cálculo: -100 0 100 200 300 400 500 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade proteolítica A.awamori A.oryzae
  16. 16. 16 (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) 4.1.5.1 Aspergillus oryzae Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades T.Babaçu 24 1 0,005 0,019 0,024 0,62 2,35 2,97 4,57 T.Babaçu 24 1 0,061 0,065 0,048 7,54 8,03 5,93 T.Babaçu 48 1 0,045 0,044 0,044 5,56 5,44 5,44 5,21 T.Babaçu 48 1 0,042 0,038 0,04 5,19 4,70 4,94 T.Babaçu 72 1 0,047 0,041 0,038 5,81 5,07 4,70 6,61 T.Babaçu 72 1 0,069 0,056 0,07 8,53 6,92 8,65 T.Babaçu 96 1 0,055 0,031 0,046 6,80 3,83 5,68 5,70 T.Babaçu 96 1 0,044 0,057 0,044 5,44 7,04 5,44 T.Babaçu 120 1 0,021 0,026 0,015 2,59 3,21 1,85 4,16 T.Babaçu 120 1 0,028 0,063 0,049 3,46 7,78 6,05 4.1.5.2 Aspergillus awamori Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades T.Babaçu 24 1 0,023 0,029 0,036 2,84 3,58 4,45 4,53 T.Babaçu 24 1 0,04 0,042 0,05 4,94 5,19 6,18 T.Babaçu 48 1 0,069 0,107 0,09 8,53 13,22 11,12 8,96 T.Babaçu 48 1 0,052 0,063 0,054 6,43 7,78 6,67 T.Babaçu 72 3 0,134 0,145 0,142 49,68 53,75 52,64 40,96 T.Babaçu 72 3 0,119 0,005 0,118 44,11 1,85 43,74 T.Babaçu 96 1 0,267 0,257 0,295 32,99 31,76 36,45 31,41 T.Babaçu 96 1 0,237 0,249 0,22 29,29 30,77 27,19 T.Babaçu 120 1 0,156 0,169 0,176 19,28 20,88 21,75 18,27 T.Babaçu 120 1 0,111 0,129 0,146 13,72 15,94 18,04 4.2 Farelo de Soja 4.2.1 Cálculo da contagem de esporos (A.awamori) N° esporos 114 N° esporos 104
  17. 17. 17  Média da contagem: 102,9 esporos  Diluição: 2x  Volume de líquido entre a câmara e a lamínula: 25 µL  Fator de correção volumétrico: 104  Quantidade inicial desejada de esporos/mL : 2,25 x 107 Cálculo (esporos/mL) : 102,9 x 25 x 2 x 104 = 25,725 x 107 Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /25,725x107 = 87,5 µL 4.2.2 Cálculo atividade exoamilolítica  Cálculo: (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Farelo de Soja 24 5 0,066 0,122 0,110 4,91 9,07 8,18 7,50 Farelo de Soja 24 5 0,096 0,105 0,106 7,14 7,81 7,88 Farelo de Soja 48 5 0,185 0,191 0,170 13,75 14,20 12,64 12,50 Farelo de Soja 48 5 0,152 0,153 0,158 11,30 11,37 11,74 Farelo de Soja 72 1 0,369 0,368 0,337 5,49 5,47 5,01 4,84 Farelo de Soja 72 1 0,293 0,288 0,300 4,36 4,28 4,46 Farelo de Soja 96 1 0,290 0,307 0,306 4,31 4,56 4,55 4,45 Farelo de Soja 96 1 0,310 0,303 0,281 4,61 4,50 4,18 Farelo de Soja 120 1 0,368 0,336 0,350 5,47 5,00 5,20 4,90 Farelo de Soja 120 1 0,320 0,294 0,308 4,76 4,37 4,58 N° esporos 97 N° esporos 115 N° esporos 84
  18. 18. 18 4.2.3 Cálculo atividade Celulolítica  Cálculo: (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Farelo de Soja 24 1 0,007 0,005 0,013 0,16 0,12 0,15 1,04 Farelo de Soja 24 1 0,086 0,041 0,088 1,92 1,94 1,96 Farelo de Soja 48 1 0,020 0,062 0,012 0,45 0,30 0,27 0,42 Farelo de Soja 48 1 0,024 0,021 0,016 0,54 0,47 0,50 Farelo de Soja 72 1 0,070 0,070 0,000 1,56 1,56 1,55 1,36 Farelo de Soja 72 1 0,033 0,135 0,079 0,74 1,00 1,76 Farelo de Soja 96 1 0,036 0,096 0,033 0,80 0,77 0,74 1,89 Farelo de Soja 96 1 0,139 0,149 0,116 3,10 3,32 2,59 Farelo de Soja 120 1 0,006 0,058 0,070 1,39 1,29 1,56 2,33 Farelo de Soja 120 1 0,081 0,173 0,128 3,00 3,86 2,85 0 5 10 15 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade exoamilolítica A.awa…
  19. 19. 19 4.2.4 Cálculo atividade Proteolítica  Cálculo: (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Farelo de Soja 24 1 0,275 0,279 0,284 20,75 21,06 21,43 17,43 Farelo de Soja 24 1 0,180 0,183 0,185 13,58 13,81 13,96 Farelo de Soja 48 1 0,108 0,103 0,100 8,15 7,77 7,55 9,30 Farelo de Soja 48 1 0,100 0,162 0,143 11,0 12,23 10,79 Farelo de Soja 72 1 0,118 0,136 0,129 8,91 10,26 9,74 11,77 Farelo de Soja 72 1 0,177 0,184 0,192 13,36 13,89 14,49 Farelo de Soja 96 1 0,116 0,115 0,128 8,75 8,68 9,66 10,45 Farelo de Soja 96 1 0,152 0,155 0,165 11,47 11,70 12,45 Farelo de Soja 120 1 0,170 0,185 0,172 12,83 13,96 12,98 14,73 Farelo de Soja 120 1 0,232 0,212 0,200 17,51 16,00 15,09 -1 0 1 2 3 4 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade celulolítica A.awa…
  20. 20. 20 4.2.5 Cálculo atividade Xilanolítica  Cálculo: (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Farelo de Soja 24 1 0,130 0,155 0,119 15,62 18,63 14,30 10,95 Farelo de Soja 24 1 0,050 0,043 0,094 6,01 5,17 6,00 Farelo de Soja 48 1 0,085 0,058 0,121 10,21 13,00 14,54 8,93 Farelo de Soja 48 1 0,045 0,045 0,065 5,41 5,41 5,00 Farelo de Soja 72 1 0,140 0,079 0,089 10,00 9,49 10,70 8,15 Farelo de Soja 72 1 0,048 0,058 0,082 5,77 6,97 6,00 Farelo de Soja 96 1 0,011 0,003 0,007 1,32 1,00 0,84 1,17 Farelo de Soja 96 1 0,014 0,010 0,008 1,68 1,20 0,96 Farelo de Soja 120 1 0,000 0,026 0,001 0,00 0,11 0,12 1,20 Farelo de Soja 120 1 0,020 0,021 0,017 2,40 2,52 2,04 0 5 10 15 20 25 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade Proteolítica A.awamori
  21. 21. 21 4.2.6 Teor de água e pH Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pH Farelo de Soja 0 0,989 0,989 6,63 6,63 Farelo de Soja 24 0,972 0,9735 7,41 7,42 Farelo de Soja 24 0,975 7,43 Farelo de Soja 48 0,957 0,965 6,94 7,125 Farelo de Soja 48 0,973 7,31 Farelo de Soja 72 0,966 0,953 7,6 7,31 Farelo de Soja 72 0,94 7,02 Farelo de Soja 96 0,955 0,9435 7,45 7,465 Farelo de Soja 96 0,932 7,48 Farelo de Soja 120 0,849 0,845 6,78 7,015 Farelo de Soja 120 0,841 7,25 0 5 10 15 20 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade xilanolítica A.awam… 6.5 7 7.5 8 0 24 48 72 96 120 Tempo(h) pH Farelo de soja Torta de mamona 0 0.5 1 1.5 0 24 48 72 96 120 Tempo (h) Teor de água Farelo de… Torta de…
  22. 22. 22 4.3 Casca de soja 4.3.1 Cálculo da contagem de esporos  Média da contagem: 36,2 esporos  Diluição: 10x  Volume de líquido entre a câmara e a lamínula: 25 µL  Fator de correção volumétrico: 104  Quantidade inicial desejada de esporos/mL : 2,25 x 107 Cálculo (esporos/mL) : 36,2 x 25 x 10 x 104 = 9,05 x 107 Cálculo volume a inocular no meio malte (µL): 2,25x107 /9,05x107 = 249 µL 4.3.2 Cálculo da atividade Exoamilolítica  Cálculo: (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Casca de Soja 24 1 0,135 0,148 0,136 2,01 2,20 2,02 1,71 Casca de Soja 24 1 0,090 0,092 0,091 1,34 1,37 1,35 Casca de Soja 48 1 0,292 0,294 0,284 4,34 4,37 4,22 4,28 Casca de Soja 48 1 0,272 0,300 0,286 4,04 4,46 4,25 Casca de Soja 72 2 0,196 0,193 0,215 5,83 5,74 6,39 5,20 Casca de Soja 72 2 0,146 0,144 0,155 4,34 4,28 4,61 Casca de Soja 96 2 0,222 0,230 0,245 6,60 6,84 7,28 6,48 Casca de Soja 96 2 0,211 0,206 0,193 6,27 6,13 5,74 Casca de Soja 120 2 0,245 0,227 0,270 7,28 6,75 8,03 6,81 Casca de Soja 120 2 0,199 0,220 0,214 5,92 6,54 6,36 N° esporos 35 N° esporos 33 N° esporos 36 N° esporos 45 N° esporos 32
  23. 23. 23 4.3.2 Cálculo da atividade Celulolítica  Cálculo: (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Casca de Soja 24 1 0,014 0,008 0,007 0,31 0,18 0,16 0,22 Casca de Soja 24 1 0,013 0,008 0,008 0,29 0,18 0,18 Casca de Soja 48 1 0,010 0,003 0,005 0,22 0,07 0,11 0,10 Casca de Soja 48 1 0,001 0,003 0,004 0,02 0,07 0,09 Casca de Soja 72 1 0,015 0,022 0,026 0,33 0,49 0,58 0,34 Casca de Soja 72 1 0,016 0,002 0,011 0,36 0,04 0,25 Casca de Soja 96 1 0,027 0,015 0,019 0,60 0,33 0,42 0,49 Casca de Soja 96 1 0,025 0,024 0,021 0,56 0,54 0,47 Casca de Soja 120 1 0,034 0,023 0,040 0,76 0,51 0,89 0,56 Casca de Soja 120 1 0,017 0,019 0,017 0,38 0,42 0,38 0 2 4 6 8 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade Exoamilolítica A.awa…
  24. 24. 24 4.3.3 Cálculo da atividade Proteolítica  Cálculo: (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Casca de Soja 24 1 0,265 0,324 0,318 12,00 14,67 14,40 13,22 Casca de Soja 24 1 0,266 0,285 0,294 12,04 12,90 13,31 Casca de Soja 48 1 0,140 0,149 0,162 6,34 6,75 7,34 7,06 Casca de Soja 48 1 0,167 0,159 0,158 7,56 7,20 7,15 Casca de Soja 72 1 0,169 0,164 0,174 7,65 7,43 7,88 7,49 Casca de Soja 72 1 0,166 0,158 0,162 7,52 7,15 7,34 Casca de Soja 96 1 0,159 0,151 0,150 7,20 6,84 6,79 7,03 Casca de Soja 96 1 0,162 0,160 0,150 7,34 7,24 6,79 Casca de Soja 120 1 0,135 0,145 0,155 6,11 6,57 7,02 6,59 Casca de Soja 120 1 0,151 0,145 0,142 6,84 6,57 6,43 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade Celulolítica A.awamori
  25. 25. 25 4.3.4 Cálculo da atividade Xilanolítica  Cálculo (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada) Amostra Tempo (h) Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das Atividades Casca de Soja 24 1 0,068 0,045 0,072 8,17 5,41 8,65 4,39 Casca de Soja 24 1 0,012 0,003 0,019 1,44 0,36 2,28 Casca de Soja 48 1 0,031 0,032 0,021 3,73 3,85 2,52 9,31 Casca de Soja 48 1 0,114 0,128 0,139 13,70 15,38 16,70 Casca de Soja 72 1 0,183 0,191 0,208 21,99 22,95 25,00 18,11 Casca de Soja 72 1 0,111 0,090 0,121 13,34 10,82 14,54 Casca de Soja 96 1 0,313 0,336 0,346 37,61 40,38 41,58 29,68 Casca de Soja 96 1 0,150 0,129 0,208 18,03 15,50 25,00 Casca de Soja 120 1 0,252 0,230 0,245 30,28 27,64 29,44 23,35 Casca de Soja 120 1 0,136 0,140 0,163 16,34 16,82 19,59 0 5 10 15 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade Proteolítica A.awa…
  26. 26. 26 4.3.5 Teor de água e pH Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pH Casca de Soja 0 0,976 0,976 5,78 5,78 Casca de Soja 24 0,981 0,981 6,91 7,01 Casca de Soja 24 0,98 7,1 Casca de Soja 48 0,979 0,973 6,46 6,45 Casca de Soja 48 0,967 6,44 Casca de Soja 72 0,956 0,956 5,58 5,70 Casca de Soja 72 0,956 5,81 Casca de Soja 96 0,869 0,849 4,98 4,98 Casca de Soja 96 0,828 4,98 Casca de Soja 120 0,841 0,841 4,66 4,65 Casca de Soja 120 0,841 4,64 0 20 40 60 0 24 48 72 96 120 Atividade(U/g) Tempo (h) Atividade Xilanolítica A.awa… 0.8 0.85 0.9 0.95 1 0 24 48 72 96 120 Tempo (h) Teor de água Casca de Soja casca de mamona 0 2 4 6 8 0 24 48 72 96 120 Tempo (h) pH Casca de Soja Casca de Mamona
  27. 27. 27 5. Discussão A contagem de esporos para Aspergillus oryzae indicou 1,88 x 107 esporos/mL. Já a contagem de esporos para Aspergillus awamori indicou 8,50 x 107 esporos/mL, o que significa que o A.awamori esporula melhor que o A.oryzae quando em ágar PDA (Dextrose-Batata) por 7 dias a 30ºC. Quanto as atividades, o A.awamori apresentou maior produção exoamilolítica: 125,87 U/g após 96 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 19,64 U/g após 96 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção celulolítica: 6,94 U/g após 96 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 1,32 U/g após 96 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção proteolítica: 371,8 U/g após 72 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 365,9 U/g após 72 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção xilanolítica: 40,96 U/g após 72 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 6,61 U/g após 72 horas de crescimento. Com isso, fica evidente que o A.awamori teve melhor desempenho em produção enzimática, em torta de babaçu suplementada, em relação ao A.oryzae. Devido seu desempenho, o A.awamori foi o único fungo a ser testado em farelo de soja e casca de soja. Esses testes são importantes para caracterizar as matérias-primas e mostrar em qual delas o fungo realiza maiores produções enzimáticas. Em farelo de soja, o A.awamori apresentou pico de produção exoamilolítica de 12,50 U/g após 48 horas de crescimento, pico de produção celulolítica de 2,33 U/g após 120 horas de crescimento, pico de produção proteolítica de 17,43 U/g após 24 horas de crescimento e pico de atividade xilanolítica de 10,95 U/g após 24 horas de crescimento. O teor de água, ao longo do crescimento, se mostrou constante, em torno de 0,9. O pH se mostrou neutro ao longo de todo o crescimento. Em casca de soja, o A.awamori apresentou pico de produção exoamilolítica de 6,81 U/g após 120 horas de crescimento, pico de produção celulolítica de 0,56 U/g após 120 horas de crescimento, pico de produção proteolítica de 13,22 U/g após 24 horas de crescimento e pico de atividade xilanolítica de 29,68 U/g após 96 horas de crescimento. O teor de água, ao longo do crescimento, se mostrou estável, em torno de 0,9. Já o pH oscilou, fato que pode se dar pela dinâmica de produção de proteases, que leva a produção e consumo de aminoácidos pelo fungo. Ao correlacionarmos as matérias-primas, o farelo de soja mostrou induzir melhor a produção enzimática em geral, em relação a casca de soja. No entanto, a torta de babaçu suplementada com farinha de babaçu mostrou ser um substrato muito mais rico e indutor de produção enzimática pelo fungo A.awamori.
  28. 28. 28 6. Considerações Finais O Aspergillus awamori esporula melhor e realiza maior produção enzimática em relação ao Aspergillus oryzae. É, portanto, o fungo mais interessante para essa pesquisa. A torta de babaçu mostrou ser uma matéria-prima mais rica em nutrientes, induzindo melhor a produção de amilases e enzimas acessórias, como celulases, proteases e xilanases. Dessa forma, a fermentação no estado sólido do fungo Aspergillus awamori em torta de babaçu suplementada com farinha de babaçu origina um extrato multienzimático rico e de grande interesse para a pesquisa. Esse extrato poderá ser concentrado por liofilização ou filtração para posteriormente, hidrolisar as mesmas matérias-primas e originar monossacarídeos e aminoácidos, que são de grande interesse para a produção de etanol, meios de cultura, biopolímeros, dentre outros. 7. Bibliografia Castro, A.M., Andrea, T.V., Castilho, L.R., Freire, D.M.G.: Use of mesophilic fungal amylases produced by solid-state fermen- tation in the cold hydrolysis of raw babassu cake starch. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1612–1625 (2010) Castro, A.M., Carvalho, D.F., Freire, D.M.G., Castilho, L.R.: Economic analysis of the production of amylases and other hydrolases by Aspergillus awamori in solid-state fermentation of babassu cake. Enzyme Res. 2010. Article ID 576872. doi: 10.4061/2010/576872 Castro, A.M., Pereira Jr, N.: Production, properties and applica- tion of cellulases in the hydrolysis of agroindustrial residues. Quim. Nova 33, 181–188 (2010) R. Banerjee, B.C. Bhattacharya, Evolutionary operation (EVOP) as a tool of optimization for solid-state fermentation, Bio- chem. Eng. J. 13 (2003) 149–155. Hayashida, S. and P. Q. Flor (1981) Raw starch-digestive glucoamylase productivity of protease-less mutant from Aspergillus awamori var. kawachi. Agric. Biol. Chem. 45: 2675-2681.

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