Thesis Presentation: Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo
Thesis Presentation: Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo
1. Tesi di Laurea in Medicina
Facoltà di Medicina e Psicologia – Università di Roma “La Sapienza”
Angelo D’Ambrosio
“Influenza del paradigma Fear Conditioning
sull’espressione dei fattori di trascrizione
Specific AT-rich DNA-binding Protein
(SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo.”
2. La Patologia Psichiatria
È Molto Diffusa
Un terzo della popolazione europea riporterà
una patologia psichiatrica nel corso della vita.
(Alonso J, Angermeyer MC, Bernert S, et al., 2004)
Prevalenza maggiori disturbi psichiatrici:
•Disturbi d’ansia: 10.6%
•Disturbi dell’umore: 6.8%
•Schizofrenia: 0.4%
•Disturbi della personalità: 13.4%
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3. La Patologia Psichiatria
È Molto Diffusa
La maggior parte dei farmaci a nostra disposizione agisce sulle sinapsi e in
partcolare sul sistema delle monoammine (serotina, noradrenalina, GABA)
VIENE
TRATTATO IL
SINTOMO
NON LA CAUSA
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4. Epigenetica
Renthal and Nestler
Dialog. Clin Neurosci 11, 2009
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5. Epigenetica
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6. SATB1 e SATB2 e le MAR
La cromatina è organizzata in anse.
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7. SATB1 e SATB2 e le MAR
Le Matrix Attachment Regions (MARs) sono dei domini che permettono
l’attracco del DNA alla matrice nucleare e la formazione e la regolazione delle
anse della cromatina.
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8. SATB1 e SATB2 e le MAR
I fattori SATB si legano alla base delle anse e fungono da landing point per
una molteplicità di effettori, fra i quali anche HDAC e HAT.
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9. SATB1 e SATB2
I fattori SATB sono necessari per lo sviluppo di molte linee cellulari e sono
coinvolti in alcune patologie.
SATB1
Switch da emoglobina fetale ad adulta
Differenziazione CD4+CD8+
Patologia
SATB2
Necessario lyonizzazione chromosoma X
Sviluppo osseo
Attivazione IgM in cellule B
Deficit causa ritardo mentale
Fenotipo metastatico K mammella
Nel Sistema Nervoso
Sviluppo IEG
Corretta formazione precoce delle spine
dendritiche
Patologia
Deformazioni crani-facciali, palato schisi,
ritardo mentale,
Screening K Colon Retto
Nel Sistema Nervoso
Fenotipo cortico-corticale neuroni corteccia
Swtich colinergico delle fibre sudoromotorie
del simpatico
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10. SATB1 e SATB2,
Riassumendo
I fattori SATB regolano l’espressione di molti geni permettendo la modifica
della cromatina. Fungono quindi da interruttori generali del fenotipo cellulare.
Le informazioni sulla loro funzione fa intuire un possibile ruolo nelle funzioni
cognitive superiori e quindi anche nella loro patologia.
Il nostro studio è un primo approccio alla definizione di SATB2 nei processi di
apprendimento e affettivi.
A tal fine abbiamo indagato l’effetto del modello del Fear Conditioning
sull’espressione nell’amigdala di topo.
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11. Fear Conditioning
E’ un paradigma di memoria
associativa.
Presentando più volte uno stimolo
emotivamente neutro, come un
suono, con uno rilevante, come il
dolore causato da una scossa
elettrica, alla fine lo stimolo neutro
sarà in grado autonomamente di
provare risposte associate a quello
rilevante.
La risposta che noi andiamo a misurare è il freezing.
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12. Amigdala
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13. Protocolli Di Fear
Conditioning
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14. Protocollo Di Fear
Conditioning
Fear Acquisition
US
CS
Pausa
2s
2s
30s
120s
PreCS
2s
30s
P
P
CS1
2s
30s
CS2
2s
30s
30s
P
P
CS3
CS4
30s
30s
120s
CS4
PostCS
Fear Extinction
CS
Pausa
30s
30s
120s
PreCS
P
30s
P
CS1
CS2
P
CS3
CS14
120s
CS15
PostCS
Control Training
30s
CS
Pausa
30s
120s
PreCS
P
CS1
CS2
Reinstatement
US
CS
Pausa
30s
P
30s
30s
P
P
CS3
CS4
120s
CS5
PostCS
Fear Testing
2s
CS
30s
120s
120s
PreCS
CS1
PostCS
Pausa
30s
120s
PreCS
120s
CS1
PostCS
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15. Metodi
Topi C57/Bl6n.
Perfusione tramite infusione transcardica di acido picrico e paraformaldeide.
Immunostaining con immuno perossidasi e immuno fluorescenza.
Anticorpi utilizzati per le proteine SAT:
•Rabbit policlonale anti-SATB1 (rRbSATB1) [1:1000] da Abcam (ab49061)
•Mouse monoclonale anti-SATB2 (mMsSATB2) [1:1500] da Abcam
(ab51502)
•Rabbit monoclonale anti-SATB12 (mRbSATB2) [1:500] da Abcam (ab92446)
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16. Immunoreatività
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17. Immunoreatività
Mancanza di co-localizzazione tra FOXP2 e SATB21/ nel
complesso basolaterale dell’amigdala
Anti-FOXP2 = rosso
mMs-SATB2 = verde
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18. Immunoreatività
Assenza di espressione del SATB-1/2 nei neuroni
GABAergici inibitori nell’amigdala
Anti-GAD = rosso
mMs-SATB2 = verde
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19. Training di Fear Conditioning
I dati mostrano l’efficacia del modello, con un aumento significativo del freezing
FA: fear acquisition
FC: fear conditioning
S/L: Short/Long
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20. Quantificazione segnale
Costante diminuzione a 24h e a 72h del segnale di
SATB1 nell’amigdala basolaterale.
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21. Quantificazione segnale
Il segnale di SATB2 in amigdala basolaterale è
difficilmente apprezzabile e mostra una variazione a
campana, sebbene non significativa.
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22. Interpretazioni
• Diminuzione di SATB1 nei topi trattati
• Diminuzione di SATB1 potrebbe impedire complessamento HDAC con
cromatina, favorendo la trascrizione genica necessaria per plasticità
sinaptica
• SATB1 e SATB2 potrebbero interagire positivamente o negativamente.
• Impossibile valutare effetti di modifiche post-trascrizionali su SATB1 e
SATB2.
• In futuro sarà necessario sviluppare dei knock-out condizionali per valutare
gli effetti del deficit dei fattori SATB sull’apprendimento di ansia e paura nel
Fear Conditioning.
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23. Epigenetica?
Un meccanismo complesso per un sistema complesso
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⁃Le patologie psichiatriche sono estremamente comuni andando a colpire un terzo della popolazione europea (Wittchen HU, Jacobi F., 2005)
Uno studio europeo ha riportato una prevalenza di disturbi d'ansia dell'11% in europa
L'approccio farmacologico fin'ora utilizzato, basato sulla regolazione delle monoammine e dei loro recettori ha avuto successi limitati.
Si cura il sintomo ma non la causa
Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronale
I paradigmi più noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HAT
Studi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore.
Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica.
Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici più specifici.
Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronale
I paradigmi più noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HAT
Studi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore.
Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica.
Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici più specifici.
Il nostro studio si è concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2
La cromatina nel nucleo in interfase è organizzata in anse che regolano l'accessibilità di tali regioni ai macchinari nucleare.
Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.
SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori più o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.
Il nostro studio si è concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2
La cromatina nel nucleo in interfase è organizzata in anse che regolano l'accessibilità di tali regioni ai macchinari nucleare.
Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.
SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori più o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.
Il nostro studio si è concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2
La cromatina nel nucleo in interfase è organizzata in anse che regolano l'accessibilità di tali regioni ai macchinari nucleare.
Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.
SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori più o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.
Sono stati studiati i ruoli di SATB soprattutto nello sviluppo
SATB1 fa
SATB2 fa
Entrabi agiscono nel sistema Nervoso. SATB1 regola la sequenza dell'espressione di geni necessari per la plasticità sinaptica e la densita di sinapsi. SATB2 è necessario per la differenziazione dei neuroni corticali da cortico-spinali a cortico-corticali.
Regolatori globali dell'espressione genica e quindi probabilmente coinvolti nelle funzioni cognitive superiori e nelle loro alterazioni patologiche
Noi abbiamo indagato come SATB vengano inluenzati nel topo dal FC, un paradigma di memoria associativa.
il paradigma dice che associando più volte un stimolo neutro (un suono, o il contesto stesso) con uno emozionalmente rilevante, lo stimolo neutro sarà in grado di provocare le risposte associate allo stimolo avversivo
Per valutare la creazione delle memorie associative registriamo il freezing, ovvero il tempo di assenza di qualunque movimento nel topo a parte il respiro.
Noi abbiamo indagato l'influenza che questi due fattori possono avere nell'amigdala.
L'amigdala è il centro nevralgico di analisi e memorizzazione della paura e dell'ansia.
Nuclei e connessioni
I 3 anticorpi mostrano un segnale differente in amigdala. dal confronto con la letteratura possiamo dire che pRB e mRB sono specifici. Quindi mMs è specifico per entrambi.
Noi questo lo abbiamo scoperto dopo e abbiamo eseguito i nostri esperimenti
Ma il fatto che il segnale di SATB2 in amigdala è trascurabile rispetto a SATB1, possiamo attribuire i risultati a SATB1
Proponiamo per brevità i dati di un solo esperimento, ma esperimenti simili da noi fatti danno risultati simili.
Analizzando i dati del comportamento possiamo vedere come il FC sia un paradigma efficacia nella creazione di ansia e paura associativa sia per gli stimoli sensoriali, che per il contesto.
Mostriamo quindi i risultati sulla quantificazione cellulare di SATB1, fatta tramite l'anticorpo doppiamente specifico su citato.
possiamo vedere sia dalle immagini che dal grafico come il segnale di SATB1 cali in BLA passando dai controlli, ai topi sacrificatii 24h dopo training a quelli sacrificati 72h
questo cambiamento e il trend decrescente sono statisticamente significativi
SATB2 mostra invece risultati più dubbi.
abbiamo un comportamento a campana invertita, che indica una prima sotto regolazione di SATB2 che tende a regredire a livelli normali.
Sfortunatamente non significativi
Questi risultati, soprattutto per satb1 possono essere interpretati con il ruolo che questo ha sul compattamento della cromatina tramite HDAC.
Infatti SATB1 funge da punto di attracco per questo fattore permettendogli di deacitilare gli istoni, aumentando così il compattamento della cromatina e quindi diminuendo la trascrizione genica.
di converso una diminuizione di SATB1 potrebbe accompagnarsi ad una regolazione positiva di certi geni, necessaria per la plasticità sinaptica.
Vediamo quindi come l'epigenetica aggiunge ennesimi livelli di complessità al vecchio paradigma un gene una proteina. Complessità che si manifesta chiaramente nella complessità del nostro sistema nervoso, nella fisiologia e nella patologia.
Comprendere tali sistemi ci permetterà di affinare ancora ulteriormente le nostre armi terapeutiche per riportare nei ranghi quegli interruttori fenotipici andati fuori asse.