Seminario 05: Avaliação de Eficácia

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A apresentação faz parte do curso: Estrutura, fisiologia e bioquímica da pele aplicadas à ciência cosmética. A apresentação tem como objetivo apresentar os princípios e métodos usados para validar a segurança e eficácia de produtos de uso tópico.

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Seminario 05: Avaliação de Eficácia

  1. 1. Estrutura, fisiologia e bioquímica da pele aplicadas à ciência cosmética. Alexandre Ferreira Avaliação de eficácia
  2. 2. Desafios • Necessidade de novos Apelos • Busca por novos ativos – Cosméticos x “Cosmecêuticos” • Necessidade de pesquisa & desenvolvimento • Estudos de EFICÁCIA & SEGURANÇA • Investimento $$$$$
  3. 3. Considerações Gerais Diretriz Estratégica (Marketing) OBJETIVO Mercado Cliente Regulamentação Benefício (valor) Evidência (Comprovação) Apelo • Hidrata • Reduz Ruga • Energiza • Despigmenta • etc... Resposta Biológica Produto MENSURAR SIM NÃO OBJETIVO O QUE ESTÁ POR TRÁS DA MENSURAÇÃO!?!?!?!?
  4. 4. Senso Crítico CONHECIMENTO Método Sistemático Impessoal Apenas Operacional Como é CRIADO o conhecimento no Mundo Moderno???? Melhoria de Processos Permeia as Organizações Não está restrito à Pesquisa Básica Princípio de operação da Ciência Básica MÉTODO CIENTÍFICO Resposta: Ler MUITO!!!
  5. 5. Método Científico Observação Sistemática Fenômeno Hipótese Coerência Testável Bibliografia Teoria Científica Previsões Experimentação Resultados SIM NÃO Nova Hipótese Validam Hipótese? CONHECIMENTOLaboratórios
  6. 6. Aplicação em Processos Planejar PD(S/C)A Fazer Estudar Agir • Experimentação • Teste de novos processos Oportunidade • Definição de Hipóteses • Desenho experimental • Analise dos Resultados • Validação da Hipótese CheckStudy Implementação de melhorias SIMNÃO Nova Hipótese
  7. 7. Construção do Conhecimento Conhecimento Conhecimento
  8. 8. Por Trás do Sim/Não MENSURAR SIM NÃO Falso Negativo ERROS ACONTECEM!!!!! Falso Positivo Impacto na Organização Impacto no Cliente Não Deixe de Acreditar Seja Desconfiado A INCERTEZA É INERENTE DA EXPERIMENTAÇÃO Prejuízo SENSO CRÍTICO NA INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO
  9. 9. Experimentação • Por natureza é uma atividade artesanal • Objetivo: – Mensurar uma resposta e gerar evidências para testar uma hipótese • Muito dependente do pessoal (equipe) • Mais diversas fontes de variação • Como detectar falhas em uma única experimentação?? Não é possível!!! Desenvolvimento mais suscetível
  10. 10. O QUE ESTÁ POR TRÁS DA MENSURAÇÃO? Por trás da Mensuração MENSURAÇÃO DESENHO EXPERIMENTAL SIGNIFICADO BIOLÓGICO DO TESTE E RESULTADOS METODOLOGIA ANÁLISE ESTATISTICA INCERTEZA FORMA DE EXECUÇÃO ASPECTOS ÉTICOS O QUE FOI MEDIDO?
  11. 11. Escolhendo o Apelo Mercado APELO Diretriz Estratégica FÁCIL “Reduz Ruga” “Induz Colágeno” “Hidrata a pele” “Revitaliza a pele” “Induz a regeneração celular” “Energiza a pele” DIFÍCIL Mecanismo de Ação Produto É RELEVANTE??? Mecanismo biológico É COMPATÍVEL??
  12. 12. Base Científica FENÔMENO BIOLÓGICO J K E G I L M G H N A B C D E F PROCESSO FISIOLÓGICOMECANISMO DE AÇÃO RESPOSTA DESEJADA
  13. 13. O que será mensurado? J K E G I L M G H N A B C D E F PRODUTO J K E G I L M G H N A B C D E F APELO Resposta Biológica Medição direta Redução de Rugas ↑ Colágeno Tipo I ↑ RNA Colágeno Tipo 1 ↑ Glicosaminoglicanas ↓ ROS Medição Indireta Suporta o Apelo???
  14. 14. Método RESPOSTA MÉTODO Pessoal Procedimentos Equipamentos Estrutura física
  15. 15. Pessoal • Qualificação • Treinamento – Validação do treinamento • Costuma ser uma das maiores fontes de variação dentro de um método
  16. 16. Equipamentos • $$$$$$$ • Precisão • Grau de automação • Qualidade da capacidade de mensuração • Passível de calibração • Disponibilidade manutenção • GRANDE GARGALO PARA MUITOS LABORATÓRIOS
  17. 17. Estrutura Física • Fluxo de circulação • Facilidade de limpeza • Qualidade da rede elétrica • Qualidade da fonte de água • Prática de segurança
  18. 18. Procedimento • Origem – Normas / Guias – Artigos científicos – Desenvolvimento interno • Aceitação – Aprovado pela comunidade científica – De acordo com as teorias vingentes – Regulamentado
  19. 19. Procedimento MENSURAÇÃO MODELO INDUÇÃOUSO DOS EQUIPAMENTOS DOCUMENTAÇÃO PREPARAÇÃO DOS REAGENTES DESENHO EXPERIMENTAL ANÁLISE DOS RESULTADOS RESULTADO CONCLUSÃO ou ????????
  20. 20. Modelo Animal In Vitro Humano Pré-Clínicos Clínicos
  21. 21. Obtenção das Culturas • Obtenção do explante • Separação do tecido • Digestão enzimática • Cultura em meio seletivo • Tripsinização diferencial • Obtenção de culturas puras
  22. 22. Tipos de culturas Queratinócitos FibroblastosMelanócitos
  23. 23. ATERAÇÃO FISIOLÓGICA MORTE MODELO MULTIPLICAÇÃO SECREÇÃO ADIÇÃO DE AGENTE INDUTOR PRODUTO Indução & Resposta RESPOSTA
  24. 24. Mensuração J K E G I L M G H N A B C D E F PROCESSO FISIOLÓGICO RESPOSTA DESEJADA MENSURAR SUBJETIVA OBJETIVA FORMA NÃO PARAMÉTRICA PARAMÉTRICA A, B, C, D, E ESCALA 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 INFLUENCIA FORTEMENTE O DESEMPENHO DO MÉTODO
  25. 25. A escolha do Método Qual método escolher???? RESPOSTA MÉTODO a PERGUNTA HIPÓTESE MÉTODO b MÉTODO c MÉTODO d etc... Relevância Preço Desempenho
  26. 26. Parâmetros de desemenho do Método MÉTODO Repetibilidade Reprodutibilidade VARIAÇÃO Exatidão Seletividade Robustez DESEMPENHO Linearidade Sensibilidade Limite de Detecção Limite de Quantificação Faixa de Trabalho CORRELAÇÃO INCERTEZAPRECISÃO Parâmetros
  27. 27. Parâmetros Interligados Repetibilidade Exatidão Reprodutibilidade Seletividade Linearidade Sensibilidade Limite de Detecção Limite de Quantificação Faixa de Trabalho Robustez PERFORMANCE
  28. 28. Exatidão e Precisão Exatidão Precisão EXATIDÃO: • Capacidade de entregar o valor verdadeiro • Desvios do método • Fácil correção PRECISÃO: • Capacidade de repetir o resultado • Inerente do método • Difícil correção
  29. 29. Precisão REPETITIVIDADE Reprodução do resultado após repetitivos experimentos REPRODUTIBILIDADE Reprodução do resultado em laboratórios Distintos Precisão Intermediária Reprodução dos resultados dentro de diferentes variáveis •Técnicos •Equipamentos •Dias Estudo de Proficiência Provedores de ensaios de proficiência Laboratório 1 Laboratório 2 Laboratório 3 Laboratório n Validação Treinamento Validação Equipamento • Coordena atividades • Oferece amostras de referência • Analisa os dados
  30. 30. Exatidão Frequência Resposta Resposta Real X R Y
  31. 31. A incerteza Método 1 Método 2 Resposta obtida em 1 experimento Universo de respostas possíveis Frequência Resposta Frequência Resposta Respostas unidimensionais
  32. 32. Linearidade Correlação Resposta Estímulo Sensibilidade LQ inf. LD LQ sup. Faixa de Trabalho
  33. 33. Seletividade • Capacidade de discriminar a resposta verdadeira de respostas falsas • Suscetibilidade a interferentes • Falso positivo Método Pouco Seletivo Método Muito Seletivo
  34. 34. Robustez • Capacidade de tolerar variações em parâmetros aos quais o método é sujeito Umidade Lote Reagentes pHReagentes Temperatura Parâmetros comuns Alterações na Rede elétrica
  35. 35. Desenho Experimental • Garantir obtenção da resposta real – Definição dos controles – Necessidade de brancos / Placebo • Garantir que resultado represente o que seria obtido em uma população – Número de réplicas – Aleatorização • Evitar tendencia – Estudo mono ou duplo cego
  36. 36. Análise de Resultados CONCLUSÃO RESULTADO NÃO SIM TALVEZ ANÁLISE CRÍTICA GESTÃO DE RISCOS
  37. 37. Tipos de Distribuição de Dados Frequência Resposta Resposta Frequência Normal Não Normal • Resultados paramétricos • Médias • Métodos analíticos • Resultados não paramétricos • Análises sensoriais
  38. 38. Distribuição Normal Frequência Resposta População de n respostas obtidas Resposta média 99% 0,5%0,5% 0,01 95% 2,5%2,5% 0,05 p-valor Intervalo de Confiança
  39. 39. A Variação Frequência Resposta Método 1 Método 2 Resposta Esperada X R Y
  40. 40. Comparando Dois Resultados Frequência Resposta Dado 1 Análise Estatística X R X = R ou X ≠ R Teste T de Student X < R X > R Bilateral Unilateral X Dado 2
  41. 41. Dado 2 R2 Analisando Vários Resultados Frequência Resposta Dado 1 ANOVA (Análise de Variância) R1 Dado 2 R2
  42. 42. Apresentação dos resultados * Resultado = X ± Y Valor Resposta Grupo 1 Grupo 2 Valor Resposta Amostra 1 Grupo 2 Grupo 3 a a,b b Amostra Resultado 1 5 ± 1 a,b 2 8 ± 2 c 3 6 ± 1 c 4 4 ± 2 a,c Nível de Significância: 5; 1; 0,1% Melhor se Incerteza
  43. 43. Conclusões • Não terceirize a responsabilidade • ANALISE OS RESULTADOS CRITICAMENTE • Exija apresentação clara dos resultados através de relatório detalhado (caso se trate de uma pesquisa) • Ensaios – sempre que disponível apenas acreditados • Fundamental uma análise estatística
  44. 44. Classes de Experimentação Ensaio Pesquisa • Controle de qualidade • Desenvolvimento • POPs • Protocolo + POPs • Experimentação Única • Múltiplos experimentos • Sujeito a validação • Não validável • Rigidez • Flexibilidade • Sem margem a interpretação • Com margem a interpretação • Pessoal treinado na execução • Pessoal com conhecimento no tema
  45. 45. Garantia da qualidade Controle de Qualidade Pesquisa Inovadoras NÃO Estudo com Animais Estudo in vitro Estudo Clínico Boas Práticas Laboratoriais (BPL) (Guia) Boas Práticas Clínicas (BPC) (Guia) Certificação PesquisasEnsaios Acreditação ISO 17.025 SIM (Norma)
  46. 46. Características Gerais • Foco na operação (laboratório) • Estratégia (comercial / Administrativa) não é abordada – Exceto o que impacta no laboratório • Estrutura da documentação • Organização da Equipe • Fluxo geral de trabalho • Adequação de parte física laboratorial
  47. 47. ISO 17.025 Laboratório Equipe Coordenador Técnicos
  48. 48. Boas Práticas Laboratoriais Laboratório Patrocinador Equipe Pesquisador Principal Demais Membros
  49. 49. Boas Práticas Clinicas Laboratório CEP Patrocinador Sujeito de Pesquisa Equipe Pesquisador Principal Demais Membros
  50. 50. Responsabilidade Laboratório Agência Reguladora Fabricante ExigênciasDocumentação Necessidades Resultados Órgão de Acreditação Consumidor
  51. 51. Conflito de Interesse Laboratório Fabricante OBJETIVO Cliente OBJETIVO Cliente Pressão
  52. 52. Escolha de um laboratório • Visite o laboratório • Quando disponível preferência para contratar laboratórios certificados/acreditados • Qualifique o laboratório através de uma auditoria – Sistema de documentação – Acompanhamento do teste
  53. 53. Medidas Biofísicas • Medidas da elasticidade da pele • Medidas da hidratação da pele • Medidas da oleosidade da pele • Avaliação clínica do estado da pele • Diminuição da irregularidade de rugas
  54. 54. Medidas Biofísicas • Vantagem: – utiliza como modelo experimental sistema in vivo • Desvantagem: – não permite compreender ao nível molecular a ação do produto
  55. 55. Ensaios Moleculares • Estimulo produção de proteínas de MEC • Inibição da produção e atividade das MMPs • Inibição da produção de RL • Estímulo a proliferação celular • Entre outros...
  56. 56. Ensaios Moleculares • Vantagens – Possível medir parâmetros que não podem ser medidos in vivo – Podem ser feitos em larga escala – No geral são altamente reprodutíveis com baixa variabilidade • Desvantagens – Geralmente é sistema longe do in vivo – Necessário, desenvolvimento e domínio de técnicas envolvendo alta tecnologia
  57. 57. Quando usar • Como teste pré-clínicos de eficácia • Para a substituição de modelos animais • Quando o parâmetro não pode ser medido in vivo • Para prospecção de ativos
  58. 58. Desenvolvimento • Conhecimento do processo biológico a ser medido. – Anti-envelhecimento – envelhecimento – Clareamento cutâneo – melanogêneses – Proteção Solar – produção de ROS por incidência de UV, danos ao DNA e reposta imunológica associada. • Identificação do ponto no processo que é o alicerce da resposta biológica de interesse. • Validação da técnica a ser usada.
  59. 59. Eficácia via tópica • Não prevê se ele permeia até o local de ação • Necessário avaliar a entrega do ativo via tópica • A eficácia de um ativo: in vitro x in vivo • Determinação de permeação percutânea in vitro
  60. 60. Testes in vitro • Simular in vitro processos biológicos do envelhecimento • Medir esses processos • Avaliar resposta induzida por ativo • Inferir a eficácia
  61. 61. Uso de Culturas de células e pele • Usadas para: – Teste eficácia – Teste de segurança • Permitem medir: – Alterações da fisiologia intra e extra celular – Indução de morte
  62. 62. Estresse oxidativo • Determinação da inibição do efeito biológicos de ROS – Indução de MMPs; morte celular; fatores de transcrição AP1. • Quantificação do ROS – Indireto: usando moléculas específica – Direto: EPR (Electron paramagnetic resonance)
  63. 63. Determinação de No. Células • Aplicado a culturas • Indicativo de proliferação, inibição de crescimento e morte – Contagem de células – Incorporação de DNA (Timina marcada) – Exclusão de corantes – Trypan Blue; – Metabolismo celular – MTT • Redução de corante pelo metabolismo celular
  64. 64. Danos ao DNA • Danos oxidativos ou por UV • Ensaio do cometa
  65. 65. Matriz Extracelular • Indução ou inibição da produção: – Proteínas de matriz – MMPs – TIMPs ADIÇÃO DE AGENTE INDUTOR
  66. 66. Componentes Matriz Extracelular • MMPs – atividade enzimática • Dosagem bioquímicas específicas • Técnicas imunológicas – Western Blots – Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) • Quantificação de mRNA – Northern blots – RTPCR
  67. 67. Vias de Sinalização Intracelular • Fosforilação • Expressão de proteínas da via • Translocação citoplasma/núcleo
  68. 68. Determinação Enzimáticas • Detecção do produto – Absorção – Fluorescência – Luminescência + ENZIMA SUBSTRATO PRODUTOS
  69. 69. Determinação Bioquímicas • Detecção do produto – Espectroscopia – Fluorescência + COLÁGENO LIGANTE
  70. 70. Western Blot +ELETROFORESE - TRANSFERÊNCIA HIBRIDIZAÇÃO ANTICORPO LAVAGEM REVELAÇÃO
  71. 71. ELISA LAVAGEM ANTICORPOREVELAÇÃO ADIÇÃO DA AMOSTRA PLACA CONTENDO ANTICORPO • Leitura – Absorção – Fluorescência – Luminescência
  72. 72. Northern Blot +ELETROFORESE - TRANSFERÊNCIA HIBRIDIZAÇÃO LAVAGEM REVELAÇÃO SONDA
  73. 73. Imunofluorescência AGENTE INDUTOR
  74. 74. KnowWhy treinamentos especializados Alexandre HP Ferreira, Ph.D. www.linkedin.com/company/knowwhy alexhpf@yahoo.com.br Campinas - SP www.facebook.com/KnowWhy.br twitter.com/knowwhy_br br.linkedin.com/in/alexandrehpferreira/

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