Vacinas contra diarréia

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Vacinas contra diarréia

  1. 1. 28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Vacinas Contra Diarréia SAÚDE Novas perspectivas baseadas em vacinas de DNA Márcio de Oliveira Lásaro Aluno de doutorado do curso de Pós-graduação do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ molasaro@biof.ufrj.br Luís Carlos de Souza Ferreira Professor adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ lcsf@biof.ufrj.br impacto econômico e social causado pelas diarréias infecciosas, em particular nos pa- íses em desenvolvi- mento, é tremendo, e ainda repre- senta um dos principais problemas de saúde pública da humanidade. Números fornecidos pela Organiza- ção Mundial da Saúde (OMS) indi- cam que as diarréias matam, a cada ano, de 3 a 4 milhões de crianças, sobretudo na África, Ásia e América Latina (Tabela 1). Além disso, a chamada diarréia dos viajantes, fre- qüente entre turistas e militares pro- venientes de regiões desenvolvidas, que visitam ou cumprem missões em regiões onde a doença é endê- mica, diminui a captação de recur- sos provenientes do turismo e de outras atividades econômicas, pois prejudica a imagem do país como local seguro para se visitar ou viver (Black, 1993; WHO, 1999). As diarréias infecciosas caracte- rizam-se pelo aumento do número de evacuações, alteração na consis- tência das fezes, fortes dores abdo- minais e desidratação. Em geral, são diagnosticadas clinicamente pela ocorrência de 3 ou mais evacua- ções, com fezes líquidas ou pasto- sas, em um período de 24 horas. Em casos extremos, como aqueles cau- sados por Vibrio cholerae, a perda de líquidos corporais pode atingir 10% do peso corporal em um único dia. Essa perda de água reflete a profunda alteração no fluxo intesti- nal de eletrólitos (principalmente sódio, cloro e potássio), que leva ao desequilíbrio eletrolítico no sangue e à desidratação. Entre crianças de até 5 anos de idade, assim como entre idosos e indivíduos debilita- dos por outras doenças, a diarréia pode ter efeito devastador e levar à morte em poucos dias (Black & Lanata, 1995). Além disso, pesquisas recentes confirmam que certos tipos de diarréia causadas por linhagens patogênicas de Escherichia coli po- dem comprometer de forma irrever- sível o desenvolvimento físico e mental de crianças, sobretudo da- quelas que enfrentam algum tipo de desnutrição (quadro comum em di- versas regiões do Brasil). O controle da diarréia pode e deve ser feito, prioritariamente, pela melhoria na qualidade de vida da população, como suprimento ade- quado de água limpa, tratamento de esgotos e moradias dignas. Tam- bém, noções básicas de higiene, como parte de um programa maior Figura 1: Vias de introdução de DNA plasmidial em células do hospe- deiro por bactérias atenuadas. (1) Shigella ou Salmonella com o DNA vacinal invade célula do hospedeiro; (2a) Shigella escapa do fagossomo para o citoplasma celular, morre e libera o DNA vacinal no citoplasma; (2b) Salmonella fica retida no vacúolo, morre e libera o DNA vacinal; (3) o DNA vacinal no citoplasma (a) ou no fagossomo (b) penetra no núcleo através de mecanismos ainda desconhecidos; (4) fragmentos da proteína codificada pelo DNA vacinal são apresentados na superfície da célula através de moléculas do sistema de histocompatibilidade. Esque- ma baseado em Dietrich et al. (1999)
  2. 2. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 29 de melhoria do sistema edu- cacional, representam ações que podem reduzir drastica- mente a incidência e as prin- cipais conseqüências das di- arréias na população (Black, 1993). A abordagem curativa baseada na terapia de reidra- tação oral também pode con- tribuir de modo significativo para a redução da mortalida- de associada às doenças diar- réicas. O uso de antibióticos não é recomendado para o tratamento de diarréias já que a elevada incidência de bactérias re- sistentes diminui sua efetividade. Além disso, não existem provas con- clusivas, médicas e científicas, que comprovem a eficácia do tratamento na redução da intensidade e da duração do episódio diarréico, ex- cetoemcasosespecíficoscomoaque- les causados por Salmonella typhi ou por alguns parasitos como ame- ba e giardia. Entretanto, em países em desenvolvimento, como Brasil, o contínuo e desordenado cresci- mento populacional, a crônica falta de recursos e uma política governa- mental dúbia em relação à saúde pública, nos leva a crer que uma abordagem preventiva baseada em vacinas talvez represente a alternati- va mais eficaz para a erradicação das diarréias infecciosas. O principal obstáculo para o de- senvolvimento de vacinas contra as doenças diarreicas é a grande diver- sidade de alvos. Vários agentes pa- togênicos (vírus, bactérias e parasi- tos) podem levar ao quadro diarréi- co e todos apresentam uma grande complexidade antigênica. Isso nos leva a crer que uma única vacina eficaz contra todos os tipos de diar- réia nunca será obtida, mas, prova- velmente, um conjunto de vacinas, cada uma delas específica para um ou alguns patógenos causadores de diarréia, nos permitirá reduzir ou eliminar essa doença em um futuro não muito longínquo (Sansonetti, 1998). Vários são os agentes causadores de diarréias, entre os quais se inclu- em parasitos, como amebas e giardi- as, vírus (rotavírus) e diversas espé- cies de bactérias. A Organização Mundial da Saúde considerou os principais agentes patogênicos cau- sadores de diarréia os seguintes mi- crorganismos: rotavírus, Shigella, Vibriocholerae, E.coli enterotoxigê- nica (ETEC) e Salmonella typhi (Ta- bela 2). E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), e Entamoeba histolytica completam a lista dos principais mi- crorganismos diarreogênicos para o homem. Estes patógenos represen- tam, portanto, os principais alvos para o desenvolvimento de vacinas anti-diarréia (Sansonetti, 1998). O desenvolvimento de vacinas eficazes contra diarréias infecciosas não será tarefa fácil. A diversidade e acomplexidadeantigênicadosagen- tes causadores de diarréia é enorme. Em alguns casos, variantes sorológi- cos de uma mesma bactéria podem causar diarréias com intensidade, duração e severidade características. Freqüentemente essas diferenças re- fletem estratégias ou mecanismos de virulência específicos, como a habi- lidade de colonizar ou de invadir o epitélio intestinal ou ainda a produ- ção de toxinas. Em alguns casos, diferentes sorotipos ou sorogrupos (definidos pela composição antigê- nica do envoltório celular) de uma mesma espécie bacteriana podem levar à diarréia. O exemplo mais conhecido é representado pela E. coli. Linhagens pato- gênicas de E.coli podem cau- sardoençastãodistintascomo meningite, infecção urinária e diarréias. As linhagens de E. coli capazes de causar di- arréia foram classificadas em grupos, de acordo com o tipo de lesão causado ao epitélio intestinal e as características de virulência que possuem. Dessa forma, foram estabele- cidos os chamados patotipos como aqueles representados pelas ETEC, EPEC e EHEC entre outros. O grupo das ETEC é formado por linhagens que colonizam o trato intestinal através de apêndices capi- lariformes, fímbrias ou fatores de colonização (FC), que reconhecem receptores localizados na superfície de enterócitos e produzem toxinas que causam o aumento do efluxo de íons e água que caracterizam a diar- réia. Outros grupos de E. coli pato- gênica, como as EPEC e EHEC, pro- vocam a doença por intermédio de toxinas e/ou colonização, que cau- sam a destruição das microvilosida- des do epitélio intestinal. Nas EHEC, em particular, as lesões provocadas podem extrapolar o ambiente intes- tinal, já que, pelo menos, uma das toxinas produzidas pode atravessar a barreira intestinal e cair na corrente sangüínea, onde agirá sobre células que formam a parede dos vasos sangüíneos, o que termina por com- prometer a função renal. A doença causada por EHEC mostra que a diarréia não é exclusiva dos países pobres, pois sua ocorrência está quase que restrita a países como Estados Unidos, Inglaterra e Japão (Black & Lanata, 1995). A prevalên- cia deste patógenos nestes países ainda não foi explicada de forma convincente, mas mostra que a diar- réia é um problema de caráter uni- versal. Aliada à grande diversidade de patógenos e antígenos-alvo, o de- senvolvimento de vacinas contra as diarréias deve levar em considera- ção ainda outros aspectos, como a definição do perfil dos potenciais usuários (turistas, militares ou crian- ças), o tipo de resposta imune a ser Figura 2: Micrografia eletrônica colorida por computador de uma célula de ETEC CFA/I+ . Os apêndices capilariformes amare- los representam a fímbria CFA/I expressos na superfície da bac- téria. Reproduzido de Gaastra & Svennerholm (1996)
  3. 3. 30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ativada e, consequentemen- te, a via de inoculação. A ativação do sistema imune de mucosa pode conferir maior grau de proteção para diarréias causadas por mui- tas bactérias e rotavírus que não invadem o epitélio in- testinal. Para estes patóge- nos, as vacinas mais eficazes devem ser baseadas em for- mulaçãoadministradaporvia oral e constituídas por mi- crorganismos mortos ou ate- nuados. Por outro lado, va- cinas capazes de ativar respostas sistêmicas, humorais ou citotóxicas, devem ser mais eficazes contra para- sitos e bactérias invasoras como S. typhi. Para estes patógenos, as vaci- nas mais recomendadas devem se basear em antígenos purificados ad- ministrados por via parenteral (in- tramuscular ou subcutânea) (Sanso- netti, 1998). Vacinas com potencial de proteção comprovado contra os cinco principais agentes causadores de diarréia, definidos como priori- dades pela OMS, foram desenvolvi- das e encontram-se em diferentes estágios de teste em humanos (Ta- bela 2). A constatação de que a inocula- ção de ácidos nucleícos (DNA ou RNA) pode induzir potente resposta imune contra o(s) antígeno(s) codificado(s) está provocando uma verdadeira revolução no campo do desenvolvimento de vacinas (Silva, 1997; Azevedo, 1998). Basicamente a estratégia consiste em criar plasmí- deos bacterianos capazes de codifi- car antígenos sob controle de pro- motores eucarióticos fortes. Plasmí- deos purificados são administrados por via parenteral em soluções sali- nas (via intra-muscular) ou aderidos a partículas de ouro injetadas na derme com o auxílio de pistolas (“gen-gun”). Vacinas de DNA admi- nistradas por via parenteral ativam forte resposta imune sistêmica, hu- moral ou celular, contra o antígeno produzido por células que recebe- ram o plasmídeo recombinante. Entretanto, o desenvolvimento de vacinas contra diarréias baseadas em plasmídeos tem sido limitado pela incapacidade de estimular o sistema imunológico de mucosas de forma eficiente. O sistema imunológico de mu- cosas tem como função básica excluir (bloqueio da colonização ou invasão de patógenos) ou neu- tralizar agentes nocivos (toxinas) através da produção de IgA secre- tor (S-IgA), uma forma especi- alizada de imunoglobulina produ- zida para atuar sobre mucosas, como os epitélios intestinal, respi- ratório ou genital, ou em secre- ções como a saliva ou o leite materno. A produção diária de S- IgA de um indivíduo adulto pode chegar a 70 mg/kg e representa mais de 80% das imunoglobuli- nas sintetizadas pelo organis- mo. Portanto, vacinas contra diarréias capazes de estimular preferencialmente o sistema imunológico de mucosas pos- suem a capacidade de proteger o indivíduo na etapa inicial do processo infeccioso (McCluskie & Davis, 1999). Uma alternativa interessan- te e promissora para a criação de vacinas de DNA capazes de estimular o sistema imune de mucosas baseia-se no uso de bacté- rias atenuadas como transportado- res dos plasmídeos vacinais aos síti- os indutores do sistema imunológi- co de mucosa. Trabalhos recentes demonstram que linhagens aviru- lentas de Shigella flexneri, Salmone- lla typhimurium e Listeria mono- cytogenes,quandoadministradaspor via oral, podem introduzir plasmí- deos nas células do hospedeiro atu- ando como verdadeiras “seringas celulares” (Figura 2). Estas bactérias são atenuadas em genes envolvidos na síntese de metabólitos essenciais não disponíveis nos tecidos de ma- míferos e, portanto, não conseguem sobreviver no hospedeiro mas per- manecem no organismo o tempo suficienteparainduzirrespostasimu- ne sistêmicas e secretoras (Dietrich, et al., 1999). Nosso laboratório, no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Ja- neiro, dedica-se à pesquisa de vaci- nas contra à diarréia por meio de estratégias não convencionais. En- tre os projetos em desenvolvimento pelo grupo está a criação de vacinas de DNA contra diarréias causadas por bactérias, em particular, por linhagens patogênicas de ETEC. A escolha deste patógeno reflete sua importância na etiologia da diarréia. Infecções provocadas pelas ETEC causamanualmentecercade300.000 mortes, sobretudo entre crianças até 5 anos de idade, e 1 bilhão de episódios diarréicos no mundo. Li- nhagens de ETEC representam tam- bém o principal agente da diarréia dos viajantes (Black, 1993; WHO, 1999). Figura 3: O plasmídeo (pRECFA) utilizado em nosso trabalho como vacina de DNA. As principais características do plasmídeo são: cfaB, gene estrutural para a principal subunidade da fímbria do CFA/I; RSV LTR, região promo- tora derivada do vírus de Sarcoma de Rous; SV40 polyA, sinal de poliadenilação deriva- do do vírus SV40; gD1, gene estrutural para glicoproteína D do vírus herpes humano tipo 1 (gD1). A proteína recombinante codificada pelo pRECFA é expressa na forma de híbrido com a proteína gD1, o que garante sua locali- zação na membrana citoplasmática da célula transfectada. Reproduzido de Alves et al. (1999b)
  4. 4. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 31 Para causar a diarréia, a ETEC precisa aderir-se à superfície do epi- télio intestinal humano através dos fatores de colonização (FC). Em nos- so meio, um dos principais FC en- contrados em linhagens de ETEC é denominadoCFA/I,umafímbriaque recobre a toda a superfície da bacté- ria e apresenta afinidade por certos açúcares encontrados na membrana de enterócitos (Figura 2) (Gaastra & Svennerholm, 1996). Trabalhando em nosso laboratório durante sua tese de doutoramento, a pesquisa- dora Ada M. B. Alves construiu vaci- nas de DNA capazes de levar à expressão do CFA/I em células de mamíferos transfectadas com plas- mídeos recombinantes. Um desses plasmídeos, denominado pRECFA, foi capaz de promover a expressão do CFA/I em células de mamíferos e de induzir respostas sistêmicas, hu- morais e celulares, quando adminis- trado por via intramuscular em ca- mundongos. Entretanto, animais vacinados com o pRECFA não foram capazes de produzir quantidades significativas de S-IgA contra o CFA/ I (Alves et al. 1999a, 1999b). Na procura de possíveis soluções para melhorar o desempenho do pRECFA como uma vacina de DNA eficaz contra diarréias causadas pe- las ETEC, decidimos estabelecer um protocolo de vacinação combinado onde a vacina de DNA atuaria como estímulo que sensibilizaria tanto o sistemaimunológicosistêmicocomo osistemasecretordoindivíduo.Uma segunda vacina administrada por via oral, constituída por uma linhagem atenuada de Salmonella typhimu- rium capaz de expressar o CFA/I de ETEC como antígeno intracelular (Guillobel et al., 1998), atuaria como reforço específico para ativação do sistema imunológico de mucosa. A expectativa maior seria a demons- tração de um efeito sinergístico so- bre as respostas imunológicas indu- zidas por estas vacinas. A vacina de DNA, administrada por via parente- ral, garantiria uma resposta sistêmi- ca forte e duradoura enquanto que a vacina oral, representada pela bac- téria transportadora do antígeno pré- formado, atuaria como estimulo para a ativação preferencial do sistema Doenças Infecciosas Infecções respiratórias agudas AIDS Diarréias Tuberculoses Malária Sarampo Segundo WHO (1999) Até 5 anos 1,9 0,4 1,9 0,1 0,8 0,9 Acima de 5 anos 1,6 1,9 0,3 1,4 0,3 - Total 3,5 2,3 2,2 1,5 1,1 0,9 Mortes (milhões) 63% Causa de mortes entre crianças 0-5 anos Tabela 1 : Panorama mundial de mortes causadas por doenças infecciosas Patógeno Rotavírus Shigella Vibrio cholerae ETEC Salmonella typhi Segundo Sansonetti (1996) Via de Inoculação oral parenteral oral oral oral oral parenteral Formulação vírus recombinantes vivos lipolissacarídeos + toxóide cepa atenuada cepa atenuada células mortas + toxóide cepa atenuada antígeno Vi + toxóide Novas Vacinas em Avaliação Tabela 2: Estratégias vacinais em desenvolvimento contra patógenos causadores de diarréia imune de mucosa. Camundongos imunizados pela via intramuscular com duas doses do pRECFA seguido por duas doses intragástricas de uma linhagem de S. typhimurium expressando intrace- lularmente o CFA/I apresentaram níveisdeanticorpossistêmicos(IgG) e secretores (IgA) muitas vezes su- periores aos valores encontrados em animais imunizados com apenas uma das vacinas (Figura 4). A indu- ção de anticorpos contra o CFA/I ocorreu mesmo quando a vacina de Salmonella era aplicada um ano após a imunização com o pRECFA, resultado que indica uma importan- te resposta de memória ativada pela vacina de DNA (Lásaro et al., 1999). Experimentos adicionais revelam ainda que resultados semelhantes podem ser obtidos quando a linha- gem de S. typhimurium era substitu- ída por cepas de ETEC que expressa- vam o CFA/I. Além disto, observamos que a substituição de bactérias vivas por bactérias mortas, tanto de S.typhi- murium como ETEC, pode aumentar a produção local de anticorpos con- tra o CFA/I sempre que incorporáva- mos à vacina oral um adjuvante de mucosa, uma forma detoxificada da toxina termo-lábil (LT) produzida por algumas linhagens de ETEC. Estes resultados, embora restritos ao modelo murino, nos oferecem perspectivas alentadoras sobre o de- senvolvimento de uma nova catego- ria de vacinas contra diarréias. A continuação desta pesquisa poderá demonstrar a viabilidade desta abor- dagem vacinal em pessoas, principal- mente em crianças que vivem em regiões onde a ETEC é endêmica. É possível imaginar que a sensibiliza- ção inicial promovida pela vacina de
  5. 5. 32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento DNA possa ser capaz de conferirumaproteçãoefe- tiva em indivíduos expos- tos à ETEC já que a inges- tão contínua de alimentos e água contaminados atu- aria como “doses de re- forço” de uma vacina oral. Por outro lado, turistas ou militares que normalmen- te não estão expostos à ETEC em seus países de origem poderiam receber o tratamento completo, uma vacina de DNA em algum momento de suas vidas e doses de reforço da vacina oral alguns dias antes da viagem para lo- cais onde o patógeno é endêmico. Esperamos que o rápi- do avanço dos conhecimentos sobre os mecanismos de virulência de pató- genos causadores de diarréia e o desenvolvimento de novas estratégi- as vacinais mais seguras e eficazes possam levar, em um futuro não muito distante, à redução significati- va da incidência da diarréia no mun- do. Acreditamos também que a ciên- cia brasileira pode e deve contribuir para a solução desse importante pro- blema mundial de saúde pública. Referências Bibliográficas: 1- Alves, AMB; Lasaro, MO; Almei- da, DF & Ferreira, LCS. (1999a) New strategies against enterotoxigenic Es- cherichia coli. I – DNA vaccines against the CFA/I fimbrial adhesin. Braz. J. Med. Biol. Res. 32: 223-229. 2- Alves, AMB; Lásaro, MO; Pyr- rho, AS; Gattass, CR; Almeida, DF & Ferreira, LCS. (1999b) Antibody res- ponse in mice immunized with a plasmid DNA encoding the coloniza- tion factor antigen I of enterotoxige- nic Escherichia coli. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 23:321-330. 3- Azevedo, V & Oliveira, SC. (1999) Vacinas de DNA. Biotecnolo- gia 5:40-43. 4- Black, RE. (1993) Epidemiolo- gy of diarrhoeal disease: implications for control by vaccines. Vaccine 11:100-106. 5- Black, RE & Lanata, CF. Epidemiology of diar- rheal diseases in develop- ment countries. In: Infecti- ons of the gastrointestinal tract. MS Blaser, PD Smith, JI Ravdin, HB Greenberg & RL Guerrant (eds) Raven Press, New York, 1995 16- 36. 6- Dietrich, G; Gents- chev, I; Hess, J; Ulmer, JB; Haufmann, SHE & Goe- bel, W. (1999) Delivery of DNA vaccines by attenua- ted intracellular bacteria. Imunol. Today 20:251-253. 7- Gaastra, W. & Sven- nerholm, A.M. (1996) Colo- nization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends in Mi- crobiol. 4: 444-452 8- Guillobel, HC; Luna, MG; Ca- macho, EF; Almeida, DF & Ferreira, LC. (1998) Immunization against the colonization factor antigen I of ente- rotoxigenic Escherichia coli by admi- nistration of a bivalent Salmonella typhimuriumaroAstrain.Braz.J.Med. Biol. Res. 31:545-554. 9- Lásaro, MO; Alves, AMB; Gui- llobel, HCR; Almeida, DF & Ferreira, LCS. (1999) New vaccine strategies against enterotoxigenic Escherichia coli. II: Enhanced systemic and secre- ted antibody responses against the CFA/I fimbriae by priming with DNA and boosting with a live recombinant Salmonella vaccine. Braz. J. Med. Biol. Res. 32:241-246. 10- McCluskie, MJ & Davis, HL. (1999) Novel strategies using DNA for the induction of mucosal immunity. Immunology, 19:303-329. 11- Sansonetti, PJ. (1998) Slaying the Hydra all at once or head by head?. Nature Medicine 4:499-500. 12- Silva, CL. (1997) Vacinas Gêni- cas. Biotecnologia 3:323-34. 13- Sizemore, DR; Brasnstron, AA & Sadoff, JC. (1995) Attenuated Shige- lla as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. Scien- ce 270:299-302. 14- World Health Organization. Removing obstacles to healthy deve- lopment. URL: http://www.who.org/ infectious-disease-report/ Figura 4: Respostas de anticorpos contra o CFA/I ativadas pelo protocolo de imunização baseado na vacina de DNA (pRECFA) e a vacina oral constituída por uma linhagem atenua- da de S. typhimurium recombinante capaz de expressar o CFA/I. (A) Pa- drão de resposta para IgG sérico; (B) Padrão de res- posta para S-IgA extratos fecais. A linha pontilhada em B indica o ponto de corte para valores conside- rados positivos para o en- saio. Os animais foram submetidos a um esquema de imunização que inclui 2 doses de DNA (100µg/ dose), aplicadas em um intervalo de 2 semanas, seguidas por 2 doses de S. typhimurium (1010 cfu/mL) no intervalo de 1 semana. Os resultados para IgG e IgA específicos para CFA/I foram obtidos em testes de ELISA com a proteína purificada. Reproduzido de Lásaro et al. (1999)

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