Investigação genética dos abortamentos espontâneos pelo dna

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Investigação genética dos abortamentos espontâneos pelo dna

  1. 1. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73 164RESUMOOs abortamentos espontâneos são fenômenos comuns, masemocionalmente devastadores. Uma explicação científica dacausa da perda fetal é fundamental para o casal poder restaurara sua homeostase emocional e para o médico orientar a sua con-duta. Mais de 50% dos abortamentos apresentam anormalidadescromossômicas, especialmente trissomias (60%), triploidia (15%)e monossomia X (15%). Assim, o cariótipo fetal deve ser feito, sepossível, em todos os casos de perda gestacional. Os estudoscromossômicos convencionais dependem da cultura de célulasfetais estar associada com falhas de crescimento in vitro e conta-minação com células maternas. Uma alternativa vantajosa é acitogenética molecular, que estuda o cariótipo fetal diretamenteao nível do DNA, dispensando a cultura de tecidos e permitindoaté a análise de espécimes fixados em formol, etanol ou incluídosem parafina. Este artigo descreve a implantação no GENE –Núcleo de Genética Médica – de uma metodologia própria deestudos genéticos de abortamentos usando a reação em cadeiada polimerase (PCR) e permitindo o diagnóstico das principaistrissomias, da triploidia e da monossomia X. Neste trabalho faze-mos uma revisão da análise de 1.096 abortamentos estudadospor três protocolos diferentes: citogenética convencional(Protocolo 1), citogenética convencional + citogenética molecular(Protocolo 2), ou citogenética molecular isoladamente (Protocolo3). O nosso objetivo foi comparar resultados obtidos após aimplantação dos estudos moleculares com os resultados anterio-res. A conclusão do estudo foi que o procedimento de citogené-tica molecular implantado é simples, eficiente e de baixo custo erepresenta uma ferramenta de grande utilidade clínica.Palavras-chave: Abortamento; Perda fetal; Cromossomo-patias; Citogenética; DNAAbortamentos espontâneos são eventos comuns eocorrem em 10% a 15% das gravidezes reconhecidas cli-nicamente.1Sabemos hoje que mais freqüentemente a suacausa é genética, e mais especificamente citogenética.2Boué e Boué3, em Paris, encontraram anomalias cromos-sômicas em 61% de 1.500 abortamentos de primeiro tri-mestre estudados. Da mesma maneira, Hassold et al.4, noHavaí, encontraram cromossomopatias em 50,5% de2.919 fetos abortados com menos de 500g. Estes doisestudos basearam-se em culturas a longo termo de tecidosfetais, método sabidamente complexo e sujeito a falhas decultura em mais de 30% dos casos. Utilizando o examecromossômico com cultura a curto termo de vilosidadescoriônicas, Ohno et al5. obtiveram um cariótipo em92,3% dos abortos e observaram uma taxa de anormali-dades cromossômicas mais alta ainda: 69,4%. É possívelque os espécimes que não crescem em culturas in vitrotenham maior probabilidade de ser cromossomicamenteanormais.6Em todos os estudos, a proporção de conceptos cro-mossomicamente anormais estava inversamente relacio-nada com o período gestacional. Assim, por exemplo, nosegundo trimestre de gravidez, o número de abortos comdefeito cromossômico cai para 25% a 30%. Por outrolado, na maioria dos trabalhos publicados, as freqüênciasdos vários tipos de anormalidade foram mais ou menosconstantes. Fritz et al.6fizeram meta-análise de 19.920casos da literatura e observaram que as trissomias (presen-ça de um cromossomo extra) correspondiam a aproxima-damente 59% dos abortos anormais, a monossomia X(45,X) correspondia a 15% e a triploidia (três cópias detodos os cromossomos), a 15%.QUAL A IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICOETIOLÓGICO DAS PERDAS REPRODUTIVAS?O abortamento, apesar de comum, é emocionalmen-te devastador e o seu impacto é intensificado quando acausa não é estabelecida. Isto ocorre porque, com fre-quência, a perda fetal não é apropriadamente investigada.Embora esteja provado que mais de 50% dos abortamen-tos têm cariótipos anormais e os geneticistas há anos enfa-tizem a necessidade dos estudos citogenéticos das perdasreprodutivas, a verdade é que eles não se tornaram parteintegral da rotina obstétrica, exceto para alguns especialis-tas com orientação mais acadêmica. Uma das razões é ofato de que, no passado, freqüentemente havia insucessoda cultura clássica de tecidos fetais a longo termo, entãoessencial para o estudo cromossômico. Hoje, isto não émais verdade, graças aos avanços significativos em cultu-INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNAGENETIC INVESTIGATION OF SPONTANEOUS ABORTIONS BY DNA TECHNIQUESSÉRGIO DANILO JUNHO PENA*; HELENA BEATRIZ BELO LISBOA MARTINS DA COSTA**;ELEN ROSE FONTOURA CARVALHO**; ROSANE STURZENEKER**** Médico, Doutor em Genética Humana, pesquisador do GENE - Núcleo de Genética Médica deMinas Gerais – e do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de MinasGerais.** Bióloga do GENE - Núcleo de Genética Médica de Minas Gerais*** Bióloga, Doutora em BioquímicaGENE - Núcleo de Genética Médica de Minas GeraisEndereço para correspondência:Prof. Dr. Sérgio PenaGENE - Núcleo de Genética MédicaAv. Afonso Pena 3111, 9º andarBelo Horizonte, MGCEP: 30 130-909Tel.: (31) 3284-8000Fax: (31) 3227-3792E-mail: spena@gene.com.br
  2. 2. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73165ras de curto prazo e em estudos diretos do DNA extraídodos tecidos fetais, mesmo contaminados, macerados oufixados, garantindo um resultado conclusivo e útil namaioria dos casos, como demonstrado neste estudo.A maior indicação para o estudo cromossômico dostecidos fetais é o abortamento de repetição.7Nos EstadosUnidos, 4% das mulheres casadas tiveram duas perdasfetais e 3% tiveram três ou mais perdas.8Nestes casos derecorrência torna-se essencial estabelecer se o abortamentoestá ou não relacionado com uma cromossomopatia. Napresença de cromossomopatia, a causa da perda fetal podeser considerada como estabelecida e não há necessidade defazer nenhuma investigação da mãe. Por outro lado, naausência de uma alteração do cariótipo fetal, há indicaçãopara investigações maternas, que devem incluir ultra-sono-grafia pélvica, estudos genéticos de trombofilia e anticor-pos lúpicos anticoagulante e anti-cardiolipina.9Estudoshormonais são controversos.1Entretanto, mesmo no primeiro abortamento, acredi-tamos que há justificativas para o estudo cromossômicofetal. O processo de luto após uma perda fetal é associadocom ansiedade e depressão.10Nos casos em que a perdafica inexplicada, freqüentemente a paciente apresenta sen-timentos de culpa e questiona se a perda fetal ocorreuporque ela fez ou deixou de fazer algo. Friedman e Gath11entrevistaram 67 mulheres quatro semanas após aborta-mento espontâneo e observaram a presença de depressãopsiquiatricamente significativa em 32 delas (48%).Freqüentemente as seqüelas psicológicas também têmimpacto negativo nas relações familiares, incluindo mari-dos e outros filhos.12O esclarecimento ao casal de que oabortamento foi causado por defeito cromossômico espo-rádico (“acidente genético”) e que a continuação da gravi-dez seria impossível ou culminaria no nascimento de umacriança anormal contribui significativamente para quehaja aceitação da perda fetal. Devido a estas razões, acre-ditamos que todos os abortamentos devam ser submeti-dos a exames citogenéticos, assim permitindo o aconse-lhamento genético dos casais antes de uma nova gravidez.DESENVOLVIMENTO DAS TÉCNICAS DEINVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOSESPONTÂNEOS PELO ESTUDO DIRETO DO DNAPelo exposto acima fica claro que, sempre que possí-vel, todas as perdas reprodutivas devem ser investigadascitogeneticamente. Infelizmente, quando feitas com acitogenética clássica convencional, estas investigações sãorelativamente dispendiosas, demoradas e têm um percen-tual significativo de casos sem resultado. Isto aconteceporque a citogenética convencional depende da disponi-bilidade de células humanas vivas e em processo ativo dedivisão celular, o que freqüentemente só é possível com acultura dos tecidos fetais a longo termo no laboratório. Asfalhas de cultura são comuns porque os tecidos de aborta-mentos e natimortos estão freqüentemente macerados,contaminados com bactérias e/ou fungos, ou foram fixa-dos em formol ou álcool. Neste estudo, verificamos se épossível usar testes baseados na reação em cadeia da poli-merase (PCR) para conseguir fazer o diagnóstico rápidode doenças cromossômicas humanas em DNA extraídode tecidos de fetos abortados e natimortos, sem necessida-de de cultura de tecidos.Em 1991, Mutter e Pomponio13iniciaram a citogené-tica molecular pela PCR ao desenhar um único par de ini-ciadores que promovia a amplificação do gene ZFY nocromossomo Y e o seu homólogo ZFX no cromossomo X,mas gerando produtos de tamanhos diferentes para cadaum deles. Eles demonstraram que, além do diagnósticodo sexo, estas condições competitivas permitiam o diag-nóstico molecular de indivíduos com cariótipo alterado47, XXY (síndrome de Klinefelter) ou 47, XYY (dissomiaY), pois as quantidades relativas de produtos de amplifi-cação de ZFX e ZFY tinham razões 2:1 e 1:2, respectiva-mente, em contraste com 1:1 em controles normais (46,XY). Obviamente, este enfoque experimental tão atraen-te, baseado na homologia peculiar apresentada entre oscromossomos sexuais X e Y, não era aplicável aos cromos-somos autossômicos. Entretanto, Mansfield14observouque em indivíduos heterozigotos para microssatélites poli-mórficos (ver abaixo) um alelo podia servir como contro-le interno competitivo para o outro.Os microssatélites são blocos de unidades repetitivasde DNA, contendo de uma a seis bases nucleotídicas, quesão abundantes e altamente polimórficos em genomaseucariontes devido à variação no número de unidadesrepetitivas entre alelos.15Os locos de microssatélites sãoinformativos para o diagnóstico de trissomias quandomostram a presença de mais de um alelo. Os indivíduostrissômicos apresentarão, em locos de microssatélitesinformativos, três alelos de intensidade aproximadamenteigual ou dois alelos com dosagem relativa na proporção2:1 (Figura 1). No primeiro caso, o diagnóstico é óbvio efácil, enquanto que, no segundo caso, é quantitativo edepende de técnicas estatísticas.Vários grupos de pesquisadores têm usado a amplifi-cação pela PCR de microssatélites do cromossomo 21para o diagnóstico da síndrome de Down14, 16-19, especial-mente para o diagnóstico pré-natal em DNA extraído decélulas fetais do líquido amniótico ou de vilos coriônicos.No GENE – Núcleo de Genética Médica – nós desenvol-vemos para o exame pré-natal em líquido amniótico obti-do por amniocentese um protocolo diagnóstico para atrissomia 21 que permite a amplificação simultânea deINVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNA
  3. 3. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73 166três microssatélites diferentes, D21S11, D21S1270 eIFNAR, conjuntamente com AMEL.20Já temos seis anosde experiência com este procedimento, que permite umdiagnóstico rápido (24-48 horas) e, assim, quando nor-mal, alivia a ansiedade dos pais, já que os resultados dacitogenética convencional, dependentes da cultura decélulas, demoram de 8 a 14 dias.Da mesma maneira que para o diagnóstico da trisso-mia21, a citogenética molecular pode ser usada para odiagnóstico pré-natal das aneuploidias sexuais19e dastrissomias 13 e 18.17,18Já emergiram na Europa propos-tas de utilização da citogenética molecular pela PCRcomo ferramenta única no diagnóstico pré-natal de tris-somias. Mann et al.21, em Londres, publicaram em 2001a experiência com o diagnóstico pré-natal das trisso-mias21, 18 e 13exclusivamente pela PCR em 1.314 casos.Nesta série não houve nenhum resultado falso-positivonem falso-negativo.21Esta também é a experiênciado GENE.DIAGNÓSTICO DA SÍNDROME DE TURNER (45,X)PELO ESTUDO DIRETO DO DNAO grupo de pesquisa do Laboratório de GenéticaBioquímica na UFMG desenvolveu procedimento PCRmultiplex que permite a amplificação simultânea decinco microssatélites de dinucleotídeos localizados emuma região do braço longo do cromossomo X (Figura2B). Os estudos populacionais demonstraram que adiversidade haplotípica em populações do Brasil, daÁfrica e da Europa era maior que 99%.22Assim, espera-mos ver homozigosidade dos cinco locos em menos de1% das mulheres normais. Por outro lado, esperamosver a presença de um único pico em cada um dos cincolocos em todas as pacientes não-mosaicas com o carióti-po 45, X (Figura 2B), já que há perda de heterozigosida-de por ausência de um cromossomo X. Assim, começa-mos a usar estes microssatélites para fazer a triagem defetos para a síndrome de Turner.23Para confirmaçãodeste teste baseado em microssatélites, empregamos oprocedimento de PCR específica para metilação (Figura2C), usando a metodologia descrita em detalhe previa-mente para diagnóstico da síndrome do X-frágil.24,25Proposta do presente estudoEste estudo descreve a implantação no GENE –Núcleo de Genética Médica – de protocolo de estudogenético de abortamentos e outras perdas reprodutivaspela citogenética molecular pela PCR. Como mostra-mos acima, entre os abortamentos com cromossomopa-tias há três classes principais de defeitos: trissomias(Figura 1), monossomia X (Figura 2) e triploidia (Figura3). A nossa estratégia era fazer o diagnóstico moleculardas trissomias mais freqüentes, ou seja, daquelas acome-tendo os cromossomos 13, 16, 18, 21 e 22 (que conjun-tamente perfazem aproximadamente 70% de todas astrissomias em abortamentos – Figura 1). O diagnósticodas triploidias seria feito usando a mesma ferramentadiagnóstica, ou seja, citogenética molecular por PCRcom quantificação fluorescente (Figura 3). Não se cons-tatando a presença de triploidia ou das trissomias testa-das, todos os fetos do sexo feminino seriam estudadospelo procedimento de triagem da monossomia X, usan-do a reação multiplex de cinco microssatélites do braçolongo do cromossomo X (Figura 2B). Nos casos comevidência molecular de monossomia X, seria, então,feita a confirmação do cariótipo 45,X com a PCR espe-cífica para metilação (Figura 2C).No presente trabalho fazemos uma revisão de 1.096abortamentos estudados no GENE no período 1990-2002. Estes casos foram estudados por três protocolosdiferentes: citogenética convencional, citogenética con-vencional + citogenética molecular, ou citogenéticamolecular isoladamente. A conclusão do estudo foi queo protocolo de citogenética molecular desenvolvido ésimples, eficiente e de baixo custo e que a sua implanta-ção representou um progresso considerável na investiga-ção genética dos abortamentos.MATERIAIS E MÉTODOSMateriais estudadosNo período entre janeiro de 1990 e o final de junhode 2002, foram estudados no GENE – Núcleo deGenética Médica – 1.096 abortamentos em que a idadegestacional era conhecida, incluindo 1.008 perdas de pri-meiro trimestre e 88 perdas de segundo trimestre. Estescasos foram encaminhados com finalidades diagnósticas,de praticamente todo o território brasileiro. Trata-se deuma amostra populacional essencialmente de classe médiaou classe média alta.Citogenética convencional: cultura a curto termoTodo o trabalho é realizado assepticamente em umacapela de fluxo laminar. O material de curetagem é colo-cado em uma placa de Petri estéril e examinado nomicroscópio invertido. As vilosidades coriônicas, se pre-sentes, são cuidadosamente dissecadas. Uma pequenaparte da amostra é então congelada para possível utiliza-INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNA
  4. 4. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73167ção em citogenética molecular. Para cultura de curtotermo, os vilos são transferidos para uma nova placa decultura contendo 5ml de meio de cultura Amniomax(Invitrogen) e incubadas a 37ºC na presença de 5% deCO2 durante a noite. No dia seguinte, pela manhã, sãoadicionados 700 mg de colcemid e a placa é incubada a37ºC por 45 min. Após centrifugação, as vilosidades sãotratadas seqüencialmente com solução hipotônica (10 mlde citrato de sódio 1%) e fixador [2 ml de ácido acéti-co/metanol 1/3 (v/v)]. Após 6 lavagens com fixador, omaterial é pingado em lâminas resfriadas a 4ºC de acordocom procedimento citogenético padrão. As lâminas sãocolocadas em placa aquecida a 60ºC até o dia seguinte,quando então é iniciado o bandeamento GTG, usandotripsina e o método de coloração de Giemsa de acordocom procedimento citogenético padrãoCitogenética convencional: cultura a longo termoSe vilosidades não são visualizadas no material fetalencaminhado ao laboratório, ou se não forem obtidasmetáfases com a cultura a curto termo descrita acima, ouse for uma perda fetal mais tardia e tecidos do própriofeto (pele, fascia lata, músculo, etc.) tiverem sido encami-nhados, é feita a cultura a longo termo. Tecidos fetais sãoidentificados, cuidadosamente separados de tecidosmaternos, e cortados em pequenos fragmentos de aproxi-madamente 1 mm3(explantes), que são colocados emuma placa de cultura com uma gota de meio de culturacada um, para mantê-los úmidos. Depois dos explantesestarem aderidos à placa de cultura, são adicionados cui-dadosamente 2ml de meio Amniomax sobre eles, e as pla-cas são mantidas em incubadora a 37ºC na presença de5% CO2 até que fibroblastos migrem dos explantes paraa superfície da placa. Quando há suficientes fibroblastoscrescendo, a placa é processada para citogenética usandoprocedimentos rotineiros de preparação cromossômica insitu, seguido de bandeamento GTG por tripsina e giem-sa. Caso não haja crescimento dos explantes após 3-4semanas, é feita a extração de DNA dos mesmos para arealização dos testes de citogenética molecular.Diagnóstico molecular das trissomias fetaisPara a realização dos testes de citogenética molecularpela PCR, o DNA é extraído das células fetais. ContantoINVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNAFigura 2 - Diagnóstico da monossomia X (45,X) por três técnicas dife-rentes usadas neste trabalho: a citogenética convencional (A), a perda deheterozigosidade diagnosticada por microssatélites do cromossomo X(B) e a análise de metilação do cromossomo X (C). Em mulheres nor-mais, observamos um fragmento de 142 pb, que corresponde ao cro-mossomo X ativo (não-metilado) e também um produto de 84 pb quecorresponde ao cromossomo X inativado. Como um controle internoindispensável, nós usamos iniciadores específicos para a versão maternametilada da ilha CpG do gene SNRPN no cromossomo 15 humano.Como na síndrome de Turner (igual ao caso de homens) há apenas umcromossomo X ativo (não-metilado), há no resultado um padrão mole-cular tipicamente masculino, ou seja, ausência do produto de 142 pb,com a presença apenas da banda de 84 pb.Figura 1 - Citogenética molecular por PCR usando quantificação fluo-rescente de microssatélites polimórficos (QF-PCR). Foram utilizadosem multiplex o loco da amelogenina nos cromossomos X e Y e micros-satélites polimórficos dos cromossomos 16, 13, 21, 22 e 18. De cimapara baixo vemos os traçados obtidos com um feto cromossomicamen-te normal (46,XY), um feto feminino com trissomia 18 (as setas mos-tram o padrão de três alelos) e um feto masculino com trissomia 16 (assetas mostram dois alelos em relação de área 1:2).
  5. 5. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73 168que o DNA não esteja demasiadamente degradado, estaextração pode ser feita em tecidos frescos, secos, congela-dos, macerados, contaminados com bactérias ou fungos,fixados em formol ou etanol ou mesmo incluídos emparafina. Utilizando pinça e tesoura esterilizadas, sepa-ram-se os tecidos fetais (vilosidades coriônicas, pele ousangue fetal, restos placentários). Se o material fetal tivervindo sem conservante, ou em álcool absoluto, são feitosentão o lisado e a precipitação do DNA exatamente comodescrito em detalhe por Pena et al.26Caso os tecidos fetaistenham vindo fixados em formol, a incubação em protei-nase K é estendida por 72h. A extração de DNA paraPCR de amostras incluída em parafina foi feito, pelométodo descrito por Raedle et al.27, que utiliza pré-incu-bação com Triton X-100. Depois de o DNA ser extraídoe dosado eletroforeticamente26é feita a primeira amplifi-cação por PCR com a mistura C1 que inclui os locosamelogenina, D13S308, D16S2622, amelogenina,D18S51, D21S1446 e D22S685, respectivamente doscromossomos X e Y, 13, 16, 18, 21 e 22. Os iniciadoresusados na PCR são marcados com o fluorocromo Cy5 eos produtos do sistema multiplex são resolvidos por ele-troforese num densitômetro a laser computadorizado(Seqüenciador Automático ALF Express, Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). Adicionalmente, oGENE possui vários marcadores em reserva para casos emque algum microssatélite não seja informativo e tambémpara confirmação diagnóstica, se necessário (Tabela 1).Diagnóstico do sexo fetal e de aneuploidias do cro-mossomo XNós temos usado os iniciadores desenhados porSullivan et al.28para diagnosticar o sexo fetal de aborta-mentos. Pela incorporação do fluoróforo Cy5 durante aPCR podemos usar o seqüenciador automático paraquantificar os produtos de amplificação do X e do Y everificar o sexo fetal, além de fazer o diagnóstico molecu-lar da síndrome de Klinefelter (47, XXY) ou da dissomiaY (47, XYY).Diagnóstico molecular da monossomia X (síndromede Turner)Quando os testes para trissomias e triplodia são nor-mais e o sexo fetal é feminino, são sempre realizados estu-dos moleculares adicionais para o diagnóstico de umapossível monossomia X (45,X), uma das causas maiscomuns de abortamento. Inicialmente é utilizada a reaçãomultiplex de cinco microssatélites do braço longo do cro-mossomo X, exatamente como descrito em Pereira et al.23Nos casos em que um único pico é visto em cada um dosmicrossatélites é feita então a confirmação do cariótipo45,X com a PCR específica para metilação, utilizando ametodologia descrita por Pena e Sturzeneker.24, 25INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNAMultiplex C1Cromossomos X e YCromossomo 13Cromossomo 16Cromossomo 18Cromossomo 21Cromossomo 22Multiplex LACromossomos X e YCromossomo 21Locos reservaCromossomo 13Cromossomo 16Cromossomo 18Cromossomo 21Cromossomo 22Tabela 1 - Locos de microssatélite usados na citogenética molecularpela Reação em Cadeia da PolimeraseAmelogeninaD13S308D16S2622D18S51D21S1446D22S685AmelogeninaD21S11, D21S1270, D21S1280D13S258, D13S317, D13S631D16S535, D16S685D18S57, D18S535, D18S1270D21S1245, IFNAR, PENTA DD22S264, D22S941, D22S944Figura 3 - (A) Cariótipo fetal masculino mostrando a presença de 69cromossomos (triploidia). (B) Diagnóstico molecular do mesmo fetomostrando trissomia dos cromossomos 16, 13, 22, 21 e 18 e um com-plemento sexual XXY. Observe padrões de três picos nos cromossomos16, 22 e 21 e padrões de dois picos com diferenças quantitativas noscromossomos 13 e 18, além do par XY.
  6. 6. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73169Definição dos protocolosNeste trabalho fazemos uma revisão da análise de1.096 abortamentos estudados por três protocolos dife-rentes que foram adotados seqüencialmente. O Protocolo1, que vigorou de 1990 a 1996, baseou-se no uso exclusi-vo da citogenética convencional. O Protocolo 2, que pas-sou a vigorar a partir de 1997, estendendo-se até o presen-te, baseou-se no uso combinado da citogenética conven-cional e da citogenética molecular. Finalmente, oProtocolo 3, que era constituído pela citogenética mole-cular isoladamente, passou a ser usado a partir de 1999.Análise estatísticaToda a análise estatística foi realizada no VassarStatsWeb Site for Statistical Computation (http://faculty.vas-sar.edu/lowry/VassarStats.html). Foi usado o teste exatode Fisher e o valor de P considerado significativo foimenor que 0,05.RESULTADOSProtocolo 1O Protocolo 1 vigorou de 1990 a 1996 e efetivamen-te representa a era pré-molecular. Neste período foramestudados 500 casos de abortamento por cultura de curtotermo de vilosidades coriônicas e/ou cultura a longotermo de explantes de outros tecidos fetais, seguidos,quando viável, de processamento para citogenética con-vencional. Quando a cultura de curto termo de vilosida-des coriônicas não produzia metáfases, era então feita acultura a longo termo dos tecidos fetais disponíveis, apóscuidadosa dissecação. Os resultados obtidos com esteprotocolo estão mostrados em detalhe na Tabela 2.Como já esperado pelas estatísticas internacionais, nãoforam obtidos resultados em 28,4% dos casos (142 exa-mes). Nos exames que permitiram um resultado, obser-vamos 63 conceptos masculinos cromossomicamentenormais (28,1%) e 161 conceptos femininos cromosso-micamente normais (71,2%). Esta diferença é altamentesignificativa pelo teste exato de Fisher (Z = 4,7; P =0,000002). A razão para esta diferença fica clara quandoseparamos os resultados das culturas a curto termo devilosidades coriônicas (coluna “Vilos” na Tabela 2), comuma razão feminino/masculino de 1,02, e das culturas alongo termo (coluna “Cultura” na Tabela 2) com umarazão feminino/masculino de 0,13. Provavelmente, nasculturas a longo termo estava havendo crescimento decélulas maternas femininas e citogeneticamente normais.Com base nesta observação, todos os laudos dos examescom resultado 46,XX eram acompanhados de explicaçãoespecífica e também de sugestões relativas a necessidadede outros exames dos pais.Focalizando a nossa atenção somente nos resultadosobtidos de vilosidades coriônicas, que apresentam menosvieses potenciais, podemos constatar a presença de anor-malidades cromossômicas em 56,0% dos abortamentos, oque é completamente concordante com a literatura. Entreos conceptos cromossomicamente anormais encontramos68,6% trissômicos, 9,9% com cariótipo 45,X e17,3% triplóides.Protocolo 2O Protocolo 2, que inclui os estudos de citogenéticamolecular pela PCR, passou a vigorar a partir de 1997 efoi usado no estudo de 298 perdas reprodutivas. Houvefalhas de cultura em 94 casos (31,5%), conforme espera-do pelos dados da literatura, e este percentual, inclusive,não difere significativamente dos 28,4% com o Protocolo1 (Z = 0,9; P > 0,30). Entretanto, neste protocolo todosos casos em que houve falha de cultura foram ademaisestudados pela citogenética molecular, com a conseqüên-cia de que foi possível obter resultados em 296 das 298INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNATotal de casosFalha de culturaSem resultadoCariótipo normal46, XY46, XXCariótipo anormalTrissomiaTrissomia 13Trissomia 16Trissomia 18Trissomia 21Trissomia 2247, XXYOutras trissomiasb45, XTriploidiaTetraploidiaOutros2160095484712183102531462231221142841421421291511413704101014110500142142224631611349010294147224162224121/216=56,0%a68,6%a(60) 49,6%19,0%c9,9%17,3%0,8%3,3%100,0%28,4%28,4%224/358=62,6%134/358=37,4%Tabela 2 - Estudo genético de abortamentos feito exclusivamente porcitogenética convencional. Período: janeiro 1990 - dezembro 1996Vilos Cultura TotalaEstas percentagens referem-se exclusivamente aos resultados em vilosidades coriônicas(vilos)bInclui trissomias duplascEm negrito e itálico estão as anormalidades cromossômicas não detectáveis pelo protocolomolecular
  7. 7. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73 170INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNAperdas reprodutivas (>99%), um aumento espetacularem comparação com o Protocolo 1. Com a citogenéti-ca convencional no Protocolo 2 foram encontradasanormalidades cariotípicas em 49,5% dos conceptos,em concordância com os resultados do Protocolo 1. Poroutro lado, com a citogenética molecular observamosanormalidades em apenas 24,5% dos casos. Entretanto,temos de considerar que a citogenética molecular temfoco exclusivo nos cromossomos 13, 16, 18, 21, 22, Xe Y e, além disso, não é capaz de diagnosticar casos detetraploidia nem translocações balanceadas. Dos 100casos anormais detectados pela citogenética convencio-nal, 30 não seriam passíveis de detecção pelo protocolode citogenética molecular utilizado neste estudo (verem negrito e itálico na Tabela 3), porque envolviamanomalias infreqüentes. O protocolo adotado noGENE leva em conta a relação custo/benefício doexame e privilegia as cromossomopatias mais comunsnos abortamentos. Se omitirmos estes casos, indetectá-veis pela citogenética molecular, de consideração, tería-mos cariótipos anormais pela citogenética convencionalem 70 de 202 conceptos, ou seja, 34,7%, que não é sig-nificantemente diferente dos 24,5% vistos com a cito-genética molecular (Z = 1,7; P > 0,14). Além disso,como a citogenética molecular foi feita nos casos emque houve falha de cultura apenas, os dois grupos nãosão facilmente comparáveis.Protocolo 3O Protocolo 3, que inclui apenas estudos de citogenéti-ca molecular pela PCR, passou a vigorar a partir de 1999.De janeiro daquele ano a junho de 2002, foram estudados298 abortamentos por este protocolo. Vários destes casoseram de espécimes que haviam sido fixados em formol ouálcool, ou mesmo incluídos em parafina para estudos anato-mopatológicos ao microscópico. Foram observados 105conceptos com cariótipos anormais, ou seja, uma taxa deanormalidade cariotípica de 35,2% (Tabela 4).DISCUSSÃOEficiência da citogenética molecularEste foi um estudo com controles seqüenciais, ou seja,o nosso objetivo era comparar resultados obtidos após aimplantação dos estudos moleculares (Protocolos 2 e 3)com os resultados anteriores (Protocolo 1). Dois parâme-tros básicos, determinantes da sensibilidade diagnósticado procedimento, foram inicialmente analisados: propor-ção de casos com resultado definitivo e proporção decasos com anormalidade cromossômica.O Protocolo 1, baseado na citogenética tradicionalapós cultura a curto ou longo prazo, representa o proce-dimento clássico de estudo de abortamentos e estabeleceua nossa linha de base. A proporção de casos sem resulta-do, 28,4%, foi significativa, mas dentro do esperado, jádescrito na literatura especializada. Na maioria dos casosisto se deveu a amostras inadequadas, com contaminaçãobacteriana, maceração pronunciada, ou mesmo ausênciade tecidos fetais reconhecíveis. Em parte, este problema érelacionado com a falta de experiência dos médicos aofazer a coleta, que não haviam recebido informações ade-quadas, ou que não haviam seguido os procedimentos decoleta recomendados. Sem dúvida, essa proporção de exa-Total de casosFalha de culturaSem resultadoCariótipo normalCariótipo anormalTrissomiaTrissomia 13Trissomia 16Trissomia 18Trissomia 21Trissomia 2247, XXYOutras trissomias*45, XTriploidiaTetraploidiaOutros298942173Convencional100/202 =49,5%70823510521710758Molecular23/94 =24,5%1942641201300Total12389122511146417111058100%72,3%(72) 58,5%(17%a) 15,4%8,9%8,1%(5,0%) 4,1%(8,0%) 6,5%100,0%31,5%0,7%173/296=58,4%123/296 =41,6%Tabela 3 - Estudo genético de abortamentos feito exclusivamente porcitogenética convencional com utilização suplementar de metodologiamolecular (PCR - Reação em Cadeia da Polimerase). Período: janeiro1997 - junho 2002* Inclui trissomias duplasaEm negrito e itálico estão as anormalidades cromossômicas não detectáveis pelo protocolomolecularTotal de casosSem resultadoCariótipo normalCariótipo anormalTrissomiaTrissomia 13Trissomia 16Trissomia 18Trissomia 21Trissomia 2247, XXY45, XTriploidia298019310546617813112336100,0%44,2%22,1%34,6%100,0%203/298 = 64,8%105/298 = 35,2%Tabela 4 - Estudo genético de abortamentos feito pelo Protocolo 3,empregando a metodologia molecular (PCR - Reação em Cadeia daPolimerase). Período: janeiro 1999 a junho 2002
  8. 8. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73171INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS PELO DNAmes sem resultado, mesmo se esperada, era causa de frus-tração para os médicos, os pais e a própria equipe doGENE. Um outro problema com este protocolo é que ainadequação das amostras dificultava também a dissecaçãodos conceptos, de tal maneira que nas culturas a longo prazohavia o risco de crescimento de células maternas, como sina-lizado pelo excesso de resultados femininos normais (Tabela2). Como a contaminação com células maternas é sabida-mente uma causa de resultados falso-negativos, em todos osresultados de cariótipo feminino normal em culturas alongo termo de abortamentos era incluída no laudo umaobservação indicando esta possibilidade. Se concentrarmosa nossa atenção somente nos casos examinados pela culturaa curto prazo de vilosidades coriônicas, em que a contami-nação materna não constitui uma fonte de erro, observamosanormalidades citogenéticas em 56% dos casos, o que ébem concordante com a literatura já citada.O Protocolo 2 incluiu a utilização inicial da citogenéti-ca convencional, suplementada pela citogenética molecularquando não havia resultado com a primeira (Tabela 3). Osresultados da citogenética convencional com este protocolopodem ser juntados com os de vilosidades coriônicas daTabela 2 para aumentar a casuística e torná-la mais confiá-vel. Passamos assim a ter 221 casos anormais em 418 abor-tamentos estudados (52,9%), distribuídos da seguintemaneira: 69% trissomias, 12,7% triploidias e 10% monos-somia X, o que se harmoniza muito bem com a literatura.Para avaliarmos a eficiência e a sensibilidade dos estudosde abortamentos apenas pelo exame direto do DNA, preci-samos então comparar os resultados da citogenética conven-cional conjuntamente das Tabelas 2 e 3 com os obtidos peloProtocolo 3 (Tabela 4), que faz uso exclusivo de metodolo-gia molecular e que tem as enormes vantagens de ser maisrápido, ter um custo muito menor (ver discussão a seguir) ede permitir resultado em virtualmente 100% dos casos,mesmo naqueles em que os tecidos fetais foram fixados emformol, álcool ou incluídos em parafina. A principal limita-ção da sensibilidade diagnóstica deste protocolo é o fato deque metodologicamente só é viável o diagnóstico das anor-malidades cromossômicas mais comuns. Nós desenvolve-mos técnicas moleculares para o diagnóstico de todas as tri-ploidias, da monossomia X e das trissomias dos autossomos13, 16, 18, 21 e 22 e dos cromossomos sexuais X e Y. Assim,entre os 221 casos anormais observados com a citogenéticaconvencional (Tabelas 2 e 3), 58 (26,2%) são trissomias deoutros autossomos, tetraploidias e arranjos estruturais, ouseja, apresentam anomalias não detectáveis pelo protocolomolecular em discussão (Protocolo 3). Isto estabelece ummáximo teórico de sensibilidade ao redor de 74% para oprotocolo molecular implantado no GENE. Efetivamenteobservamos 35,2% de anormalidades (Tabela 4) que, se cor-rigido para a sensibilidade teórica de 74%, fornece taxa totalestimada de anormalidades de 47,6%, que não é estatistica-mente diferente dos 52,9% observados pela citogenéticaconvencional (Z = 1,47; P > 0,14). Assim, concluímos queo protocolo de citogenética molecular está funcionandobem próximo de sua expectativa teórica.QUAL DOS NOSSOS PROTOCOLOS É O IDEAL PARAESTUDO DE ABORTAMENTOS?Em termos de sensibilidade diagnóstica não há dúvidaque o Protocolo 2 é o melhor, pois combina a alta sensibili-dade metodológica da citogenética convencional, que per-mite o diagnóstico de todas as cromossomopatias, com arobustez da citogenética molecular, garantindo um resulta-do em virtualmente todos os espécimes. Entretanto, na prá-tica clínica temos de levar em conta considerações de custoe benefício. Os exames de citogenética convencional são tec-nicamente complexos e intensivos em trabalho manual eanálise especializada ao microscópio, o que os torna muitomais dispendiosos que os exames moleculares. Para ospacientes, os exames moleculares isolados baseados na PCR(Protocolo 3) custam aproximadamente 50% dos exames decitogenética convencional (Protocolo 2), que incluem umasegunda etapa molecular na eventualidade de não se obterum diagnóstico pelo primeiro método. Assim, ao decidirqual estudo fazer, temos de primariamente levar em consi-deração a situação econômica da família e as indicações parao exame. Em casos de abortamento de repetição, sempreque financeiramente possível, deve ser empregado oProtocolo 2, pois é imperativo trabalhar com sensibilidadediagnóstica elevada para maximizar a probabilidade de obterresultado anormal conclusivo que possa orientar a condutamédica. No abortamento de repetição é especialmenteimportante usar metodologia capaz de diagnosticar rearran-jos cromossômicos não-balanceados, que poderiam revelar apresença de translocação balanceada em um dos pais e assimelucidar a causa das perdas repetidas. Por outro lado, emcasos de primeiro abortamento, o Protocolo 3 é o métodode escolha quando uma economia financeira for importan-te. Outros elementos a serem levados em conta na escolhado exame são as condições de coleta dos tecidos fetais e afacilidade e rapidez do transporte deste material ao labora-tório. Para citogenética molecular os tecidos têm de ser cole-tados de maneira rigorosamente estéril e encaminhados comurgência ao laboratório sem nenhum conservante, paragarantir a viabilidade dos tecidos. Por outro lado, para utili-zação exclusiva das técnicas moleculares, a esterilidade não étão fundamental e é perfeitamente aceitável a fixação dostecidos fetais em etanol, o que elimina a urgência e permiteo envio do material pelo correio, mesmo em localidades nasquais o serviço SEDEX não está disponível.
  9. 9. Rev Med Minas Gerais 2003; 13(3):164-73 172Qualquer que seja o protocolo usado, o nosso estudodemonstra claramente que a metodologia molecular desen-volvida pelo GENE, e já implantada em sua rotina diagnós-tica, representa ferramenta de extraordinária utilidade clíni-ca, que fez muito para tornar a investigação genética deabortamentos um exame perfeitamente adaptável à rotinaclínica do obstetra moderno, independente de sua localiza-ção geográfica.SUMMARYSpontaneous abortions are common, but emotionallydevastating events. A scientific explanation of the cause ofthe fetal death is important for the parents to restore theiremotional homeostasis and for the physicians involved toplan their conduct. More than 50% of miscarriages havechromosomal abnormalities, especially trisomies (60%), tri-ploidy (15%) and monosomy X (15%). Thus, a fetal kar-yotype should be obtained in all abortions, if possible.Conventional chromosome studies depend on fetal cell cul-tures and are thus associated with growth failures in vitroand contamination with maternal cells. An advantageousalternative to conventional methods is molecular cytogene-tics, which is based on studying the fetal karyotype directlyat the DNA level. This has the advantage of dispensing withtissue culture and allows analysis even of specimens fixed inethanol or formaldehyde or included in paraffin. We wishto describe the development at GENE – Núcleo deGenética Médica – of a methodology for the molecularcytogenetic study of miscarriages using the polymerasechain reaction (PCR), permitting the diagnosis of the mostcommon trisomies, of triploidy and of monosomy X. Inthis article we review the results of 1,096 abortion speci-mens studies by one of three protocols: conventional cyto-genetics (Protocol 1), conventional cytogenetics + molecu-lar cytogenetics (Protocol 2) and molecular cytogeneticsalone (Protocol 3). Our objective was to compare dataobtained with molecular cytogenetics with previous results.The conclusion was that the protocols developed with theuse of molecular techniques are simple, efficient and inex-pensive and represent a tool of great clinical usefulnessKeywords: Abortions; Miscarriages; Chromosomaldefects; Cytogenetics; DNAAGRADECIMENTOSOs autores desejam agradecer a todos os outros integrantesda equipe técnica do GENE. Agradecem também a BetâniaMaria Andrade Pena pela revisão do manuscrito, úteissugestões e importantes discussões.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1- Simpson JL. Fetal wastage. In: Gabbe SG, Niebyl Jr, SimpsonJL, editors. Gabbe obstetrics: normal and problem pregnan-cies. 4th. ed. 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