UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
Avaliação dos perfis protéicos urinário eAva...
Joyce Pereira Takatsuka
AVALIAÇÃO DOS PERFIS PROTÉICOS URINÁRIO E
PLASMÁTICO DE PACIENTES GESTANTES
NORMOTENSAS E COM PRÉ-...
Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro
T142a Takatsuka, Joyce Pereira
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À minha família, por todo apoio, confiança e ...
AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos
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Por me dar saúde e forças para continuar, mesmo quando ...
Aos colegas da pós-graduação...
Que compartilharam comigo momentos importantes de aprendizado...
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O presente trabalho foi desenvolvido com os recursos fina...
“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,Embora ...
ResumoResumoResumoResumo
A pré-eclâmpsia é uma síndrome específica da gestação que leva a uma perfusão sanguínea
reduzida ...
contribuindo para a proteinúria nesta condição. Desse modo, podemos propor que a
proteinúria da pré-eclâmpsia não pode ser...
AbstractAbstractAbstractAbstract
Preeclampsia is a pregnancy specific syndrome that leads to reduced blood perfusion of
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attributed exclusively to albuminuria, suggesting that it is not purely due to glomerular
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mmHg...................................... milímetros de mercúrio
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Tabela 1. Dados demográficos de gestantes normotensas e p...
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Figura 1. Representação esquemática do útero humano em tr...
SumárioSumárioSumárioSumário
1. Introdução...................................................................................
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Desordens hipertensivas da ges...
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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(4) Hipertensão gestacional, quando a elevação da...
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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Esta síndrome sempre representa perigo para o bin...
Introdução
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trofoblásticas e gestações com isoimunizações aum...
Introdução
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remodelamento inadequado das arteríolas espiralad...
Introdução
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responsividade aos vasoconstrictores, diminui a s...
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sanguínea poderiam interferir na invasão trofoblá...
Introdução
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hipertensão, definida como aferições repetidas ma...
Introdução
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comunicando a câmara diretamente com o túbulo con...
Introdução
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filtração glomerular, mas são, em grande parte, r...
Introdução
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Disfunções ou lesões tubulares proximais podem im...
Introdução
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horas, sugerindo a possibilidade do uso de outros...
Introdução
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Na pré-eclâmpsia, ocorrem diversas alterações em ...
Introdução
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glomerular (SUGIMOTO et al., 2003). Similarmente,...
Introdução
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1978). Yamamoto et al. (1992) referiram, através ...
Introdução
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significativamente aumentada em gestantes hiperte...
Introdução
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1.5. Proteínas plasmáticas na pré-eclâmpsia
Em um...
Introdução
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Devido às inter-relações existentes entre as prot...
Justificativa
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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2. JUSTIFICATIVA
A pré-eclampsia é uma desorde...
Objetivos
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O objetivo deste ...
Materiais e Métodos
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
Esta pesquisa foi...
Materiais e Métodos
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“Report of the National High Blood Press...
Materiais e Métodos
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micções espontâneas, e mantidas em banho...
Materiais e Métodos
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Determinou-se a massa molecular das band...
Materiais e Métodos
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Após agitar os tubos e deixá-los em repo...
Materiais e Métodos
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A concentração de albumina plasmática fo...
Materiais e Métodos
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5. RESULTADOS
5.1. Avaliação do perfil protéico u...
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5.2. Avaliação do perfil protéico urinário das am...
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Em relação às amostras controles, visualizou-se a...
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Figura 6. Esquema demonstrando o perfil urinário ...
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5.3. Determinação da concentração de proteínas to...
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Figura 7. Concentração de proteínas totais plasmá...
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5.4. Avaliação do perfil protéico plasmático
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Ao compararmos os percentis entre os grupos, veri...
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5.5. Correlação entre proteínas totais no plasma ...
Discussão
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6. DISCUSSÃO
A pré-eclâmpsia é uma complicação que...
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IRION, 2008). De acordo com Chesley (1984), aproxi...
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Redman e Sargent (2003) de que a pré-eclâmpsia ser...
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por Shinagawa e Saitoh, em 1983, de que o termo “p...
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imunoblot, Yamamoto et al. (1992) identificaram a ...
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Em nossos resultados, verificamos uma significativ...
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O organismo se protege de uma hipovolemia através ...
Avaliação dos perfis protéicos urinário e plasmático de pacientes gestantes normotensas e com pré eclâmpsia
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  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA Avaliação dos perfis protéicos urinário eAvaliação dos perfis protéicos urinário eAvaliação dos perfis protéicos urinário eAvaliação dos perfis protéicos urinário e plasmático de pacientes gestantes normotensas eplasmático de pacientes gestantes normotensas eplasmático de pacientes gestantes normotensas eplasmático de pacientes gestantes normotensas e com précom précom précom pré----eclâmpsiaeclâmpsiaeclâmpsiaeclâmpsia Joyce Pereira TakatsukaJoyce Pereira TakatsukaJoyce Pereira TakatsukaJoyce Pereira Takatsuka Uberaba - MG 2009
  2. 2. Joyce Pereira Takatsuka AVALIAÇÃO DOS PERFIS PROTÉICOS URINÁRIO E PLASMÁTICO DE PACIENTES GESTANTES NORMOTENSAS E COM PRÉ-ECLÂMPSIA Orientadora: Profª. Dra. Roseli Aparecida da Silva Gomes Julho, 2009 Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia – Área de Concentração “Patologia Clínica”, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre.
  3. 3. Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do Triângulo Mineiro T142a Takatsuka, Joyce Pereira Avaliação dos perfis protéicos urinário e plasmático de pacientes gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia / Joyce Pereira Takatsuka. - - 2009. 114 f. : tab. ; graf. ; fig. Dissertação (Mestrado em Patologia Clínica) - Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, 2009. Orientadora: Profª. Drª. Roseli Aparecida da Silva Gomes. 1. Pré-eclâmpsia. 2. Perfil protéico urinário. 3. Perfil protéico plasmático. I. Título. II. Gomes, Roseli Aparecida da Silva. CDU 618.3-06
  4. 4. DediDediDediDedico esta teseco esta teseco esta teseco esta tese............ À minha família, por todo apoio, confiança e carinho, mesmo à distância... Em especial, aos meus pais, Ricardo e Maria Helena, e minha irmã, Jéssica, pela fonte de amor inesgotável, pela compreensão com minhas ausências prolongadas e por serem sempre o meu porto seguro... Ao meu namorado, Carlos Eduardo, pelo apoio em todos os momentos... Por todas as palavras de carinho e incentivo, quando, por alguns momentos, me faltaram ânimo e confiança... Pela compreensão e pela paciência nos momentos mais difíceis durante a realização deste trabalho... Por fim, a todos que contribuíram, de alguma forma, para tornar possível a realização deste trabalho e a realização de um sonho meu...
  5. 5. AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos A Deus... Por me dar saúde e forças para continuar, mesmo quando as dificuldades pareciam infindáveis... Por me dar oportunidades para crescer espiritualmente e intelectualmente... E, por colocar em meu caminho pessoas tão especiais e indispensáveis... À Professora Roseli... Pela orientação, pela confiança, pelos ensinamentos transmitidos, pelas preciosas oportunidades oferecidas e pela amizade construída... Às gestantes participantes deste estudo... Pela gentileza em concordar em participar da pesquisa e em ceder suas amostras biológicas... Aos professores e funcionários da Disciplina de Bioquímica... Pelo agradável convívio, por todos os ensinamentos, pelos auxílios e apoios e pela amizade... À banca examinadora desta tese... Pela gentileza de avaliar este trabalho e contribuir de forma tão importante para sua melhoria... À Dra Marina Carvalho Paschoini, à Dra. Adriana Vitor Resende e ao Dr. Vilmar de Paiva Marques... Pelo auxílio na obtenção das amostras utilizadas neste estudo...
  6. 6. Aos colegas da pós-graduação... Que compartilharam comigo momentos importantes de aprendizado... A todos os professores do Curso de Pós-Graduação em Patologia... Pelos indispensáveis conhecimentos adquiridos durante o curso de mestrado...
  7. 7. Apoio financApoio financApoio financApoio financeiroeiroeiroeiro O presente trabalho foi desenvolvido com os recursos financeiros da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba (FUNEPU) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
  8. 8. “Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...”qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...”qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...”qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...” (Francisco Cândido Xavier)
  9. 9. ResumoResumoResumoResumo A pré-eclâmpsia é uma síndrome específica da gestação que leva a uma perfusão sanguínea reduzida dos órgãos e está relacionada a vasoespasmos e ativação da cascata da coagulação. Ocorre frequentemente após a vigésima semana de gravidez e é determinada por aumento da pressão arterial, acompanhado de proteinúria. Os mecanismos responsáveis pela proteinúria na pré-eclâmpsia ainda estão para serem elucidados. De acordo com outros estudos já realizados, a urina proveniente de pacientes com pré-eclâmpsia demonstra pouca seletividade e não difere significativamente de outras formas de doença renal primária, com presença de proteínas originárias tanto de danos glomerulares quanto tubulares. Observamos na literatura que o perfil protéico da urina de pacientes com pré-eclâmpsia ainda não está bem estabelecido e que estudos relacionados às proteínas plasmáticas de gestantes com a síndrome são raros e não associam proteinemia e proteinúria. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os perfis protéicos urinário e plasmático em gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia. Os perfis eletroforéticos foram analisados por SDS- PAGE, para as amostras de urina, e em fitas de acetato de celulose, para as amostras de plasma. As dosagens de proteínas totais e albumina plasmática foram realizadas pelos métodos do Biureto e Verde de Bromocresol, respectivamente. O perfil protéico urinário das amostras de 24 horas de gestantes pré-eclâmpticas apresentou diferenças importantes em relação aos perfis das amostras controles e ao padrão de proteinúria glomerular, tendo as proteínas mais frequentes, massas moleculares de 66 kDa, 56 kDa e 45 kDa, sendo a de 56 kDa a mais importante, quantitativamente. As proteínas de 30 e 40 kDa apresentaram alta prevalência entre as gestantes com pré-eclâmpsia e não foram visualizadas em nenhuma amostra controle. Com relação aos perfis eletroforéticos das amostras de urina com HCl, observamos predomínio de bandas de baixa massa molecular e peptídeos, que se mostraram constantes entre as amostras de gestantes com pré-eclâmpsia. Isto sugere que tenha havido hidrólise enzimática com a acidificação do meio. Houve redução significativa dos níveis de proteínas totais (5,1 ±0,9 versus 6,3 ±0,6 g/dL) e albumina (2,6 ±0,7 g/dL versus 3,8 ±0,5 g/dL) plasmática entre as gestantes com pré-eclâmpsia. O perfil eletroforético plasmático revelou redução significativa da fração albumina-α1-globulina entre as gestantes com pré-eclâmpsia. Não houve correlação entre os níveis de proteinúria e a dosagem de proteínas totais plasmáticas nas amostras de gestantes com pré-eclâmpsia, o que sugere que proteínas originárias da unidade feto-placentária possam estar
  10. 10. contribuindo para a proteinúria nesta condição. Desse modo, podemos propor que a proteinúria da pré-eclâmpsia não pode ser atribuída exclusivamente à albuminúria, sugerindo que não seja devido a danos puramente glomerulares, e não pode ser a única responsável pelas alterações protéicas plasmáticas observadas. PALAVRAS-CHAVES: Pré-eclâmpsia; Perfil protéico urinário; Perfil protéico plasmático.
  11. 11. AbstractAbstractAbstractAbstract Preeclampsia is a pregnancy specific syndrome that leads to reduced blood perfusion of organs, is related to vasospasm and activation of the coagulation cascade, occurs after the twentieth week of pregnancy and is determined by increased blood pressure, accompanied by proteinuria. Mechanisms responsible for proteinuria in preeclampsia are still to be elucidated. According to previous studies, urine from patients with preeclampsia demonstrates little selectivity and does not differ significantly from other forms of primary renal disease, with presence of proteins from both glomerular and tubular damage. We observed in literature that urine protein profile from patients with preeclampsia is not yet well established and that studies related to plasma proteins in pregnant women with the syndrome are rare and do not associate proteinemia and proteinuria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the plasma and urinary protein profiles in normotensive and preeclamptic pregnant women. Electrophoretic profiles were analyzed by SDS-PAGE for urine samples, and strips of cellulose acetate, for plasma samples. Plasma total protein and albumin dosages were performed by methods of Biuret and Bromocresol Green, respectively. Protein profile of 24-hours urine samples of preeclamptic women showed important differences in comparison to the control samples profiles and the glomerular proteinuria pattern. The most common proteins in this group have molecular masses of 66 kDa, 56 kDa and 45 kDa and the protein of 56 kDa was the most important, quantitatively. The proteins of 30 and 40 kDa showed a high prevalence among pregnant women with preeclampsia and were not seen in any control sample. Regarding electrophoretic profiles of urine samples with HCl, we observed a predominance of low molecular mass proteins and peptides, which were constant between samples from preeclamptic women. This suggests that enzymatic hydrolysis occurred with the acidification of the medium. There was significant reduction in levels of total protein (5.1 ± 0.9 g/dL versus 6.3 ± 0.6 g/dL) and albumin (2.6 ± 0.7 g/dL versus 3.8 ± 0.5 g/dL) in plasma samples between women with preeclampsia, in comparison with the normotensive pregnant women. Plasma electrophoretic profile showed significant reduction in the albumin-α1-globulin fraction in preeclamptic pregnant women samples. There was no correlation between the proteinuria and proteinemia of preeclamptic pregnant women, suggesting that proteins originated from fetal-placental unit in preeclampsia may be contributing significantly to the high proteinuria in this condition. Thus, we propose that proteinuria in preeclampsia can not be
  12. 12. attributed exclusively to albuminuria, suggesting that it is not purely due to glomerular damage, and may not be the unique responsible for the plasma changes observed. KEY WORDS: Preeclampsia; Urine protein profile; Plasma protein profile.
  13. 13. Lista de Símbolos e AbreviaturasLista de Símbolos e AbreviaturasLista de Símbolos e AbreviaturasLista de Símbolos e Abreviaturas %.............................................. porcentagem <............................................... menor que ±............................................... mais ou menos ≥............................................... maior ou igual ®.............................................. marca registrada °C............................................. graus Celsius µg............................................. micrograma ABNT...................................... Associação Brasileira de Normas Técnicas ALT......................................... alanina transferase AST......................................... aspartato transferase C.............................................. controle CEP.......................................... Comitê de Ética em Pesquisa CPGP....................................... Curso de Pós-Graduação em Patologia DCB......................................... Departamento de Ciências Biológicas dL............................................. decilitro DP............................................ desvio padrão et al.......................................... e colaboradores g............................................... grama HCl.......................................... ácido clorídrico HELLP..................................... hemólise, elevação de enzimas hepáticas, trombocitopenia HLA......................................... antígeno leucocitário humano hs............................................. horas IgA........................................... imunoglobulina A IgG........................................... imunoglobulina G IgM.......................................... imunoglobulina M kDa.......................................... quilodalton M............................................. molar mg............................................ miligrama mL........................................... mililitro mm3 ......................................... milímetros cúbicos
  14. 14. mmHg...................................... milímetros de mercúrio N.............................................. normal nm............................................ nanômetro PAD......................................... pressão arterial diastólica PAS.......................................... pressão arterial sistólica PE............................................ pré-eclâmpsia pH............................................ potencial hidrogeniônico PIGF........................................ fator de crescimento placentário Rf............................................. relativo à frente rpm........................................... rotações por minuto SAME...................................... serviço de arquivo médico SDS-PAGE.............................. eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) sFlt-1........................................ receptor solúvel de tirosina quinase UFTM...................................... Universidade Federal do Triângulo Mineiro VEGF...................................... fator de crescimento endotelial vascular α............................................... alfa β............................................... beta γ............................................... gama
  15. 15. Lista de TabelasLista de TabelasLista de TabelasLista de Tabelas Tabela 1. Dados demográficos de gestantes normotensas e pré-eclâmpticas...... 37 Tabela 2. Valores médios de proteínas totais e albumina das amostras de plasma das gestantes com pré-eclâmpsia e controles............................................ 49 Tabela 3. Valores médios de percentis estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas.................................... 51 Tabela 4. Concentrações médias estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas....................................................... 51
  16. 16. Lista de FigurasLista de FigurasLista de FigurasLista de Figuras Figura 1. Representação esquemática do útero humano em três situações: não- gravídico, em uma gestação complicada pela pré-eclâmpsia e em uma gestação normal...................................................................................................................... 20 Figura 2. Endoteliose glomerular............................................................................ 21 Figura 3. Sistema de filtração glomerular renal...................................................... 24 Figura 4. Perfil eletroforético das proteínas do soro sanguíneo humano................ 32 Figura 5. Esquema demonstrando o perfil urinário protéico das amostras de 24 horas de gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia............................................. 45 Figura 6. Esquema demonstrando o perfil protéico urinário das amostras de 6 horas de gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia............................................. 48 Figura 7. Concentração de proteínas totais plasmática no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia e no grupo de gestantes normotensas........................................ 50 Figura 8. Concentração de albumina plasmática no grupo de gestantes com pré- eclâmpsia e no grupo de gestantes normotensas...................................................... 50 Figura 9. Percentis das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas e gestantes normotensas................................................. 53 Figura 10. Concentrações das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas e gestantes normotensas.................................. 54 Figura 11. Correlação entre as concentrações de proteínas totais na urina e no plasma de gestantes com pré-eclâmpsia................................................................... 55
  17. 17. SumárioSumárioSumárioSumário 1. Introdução........................................................................................................ 16 1.1. Desordens hipertensivas da gestação....................................................... 16 1.2. Pré-eclâmpsia........................................................................................... 17 1.3. Proteinúria................................................................................................ 23 1.4. Proteinúria na pré-eclâmpsia.................................................................... 26 1.5. Proteínas plasmáticas na pré-eclâmpsia................................................... 32 2. Justificativa...................................................................................................... 34 3. Objetivos.......................................................................................................... 35 3.1. Objetivo geral........................................................................................... 35 3.2. Objetivos específicos............................................................................... 35 4. Materiais e métodos........................................................................................ 36 4.1. Obtenção e processamento das amostras................................................. 36 4.2. Avaliação do perfil protéico das amostras de urina................................. 38 4.3. Determinação da concentração de proteínas totais das amostras de plasma................................................................................................................... 39 4.4. Determinação da concentração de albumina das amostras de plasma..... 40 4.5. Avaliação do perfil protéico das amostras de plasma.............................. 41 4.6. Análise estatística dos resultados............................................................. 41 5. Resultados........................................................................................................ 43 5.1. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 24 horas.............. 43 5.2. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 6 horas................ 46 5.3. Determinação da concentração de proteínas totais e albumina plasmáticas............................................................................................................ 49 5.4. Avaliação do perfil protéico plasmático.................................................. 51 5.5. Correlação entre proteínas totais no plasma e na urina............................ 55 6. Discussão.......................................................................................................... 56 7. Conclusões........................................................................................................ 67 Referências........................................................................................................... 69 Apêndices............................................................................................................. 79 Anexos.................................................................................................................. 94
  18. 18. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 16 1. INTRODUÇÃO 1.1. Desordens hipertensivas da gestação As desordens hipertensivas da gestação são classificadas em quatro grupos1 (critérios de “Report of the National High Blood Pressure Education Program Working2 Group on High Blood Pressure in Pregnancy”, 2000), conforme descrito abaixo:3 (1) Hipertensão arterial crônica, quando o aumento da pressão arterial é observado4 antes ou durante as vinte primeiras semanas da gestação, ou quando não há remissão da5 hipertensão após o parto. A hipertensão é definida quando a pressão arterial sistólica (PAS)6 se encontra ≥140 mmHg ou a pressão diastólica (PAD) ≥ 90 mmHg;7 (2) Pré-eclâmpsia/eclâmpsia, quando há elevação da pressão arterial e aparecimento8 de proteinúria (excreção urinária maior que 300 mg/24 hs) após a vigésima semana de9 gravidez. A eclâmpsia é definida pela ocorrência de convulsões em uma mulher com pré-10 eclâmpsia que não podem ser atribuídas à outra causa;11 (3) Pré-eclâmpsia sobreposta à hipertensão arterial crônica, quando a gestante é12 hipertensa, mas não apresenta proteinúria nas primeiras vinte semanas de gestação, após as13 quais a excreção de proteínas na urina aumenta e chega a 300 mg/dia ou quando a gestante14 é hipertensa e apresenta proteinúria, mas ocorre elevação repentina da pressão arterial ou15 da proteinúria, ou ela passa a apresentar trombocitopenia (<100.000 células/mm3 ) ou16 elevação das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato17 aminotransferase (AST);18
  19. 19. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 17 (4) Hipertensão gestacional, quando a elevação da pressão arterial ocorre após a1 metade da gestação, sem a presença de proteinúria.2 As desordens hipertensivas da gestação são a segunda causa de morte materna, após3 o embolismo, nos Estados Unidos, chegando a causar 15% destas mortes. Elas ocorrem em4 cerca de 6 a 8% das gestações, e contribuem significativamente com os índices de5 natimortos e de morbi-mortalidade neonatal, de acordo com o “American College of6 Obstetricians and Gynecologists” (1996).7 No Brasil, Gaio et al. (2001), em um estudo com 4892 gestantes, demonstraram8 uma frequência de 7,5% de desordens hipertensivas da gestação, sendo 4,0% hipertensão9 crônica, 2,3% causadas por pré-eclâmpsia/eclâmpsia, 0,7% hipertensão gestacional e 0,5%10 pré-eclâmpsia/eclâmpsia sobreposta à hipertensão prévia. Laurenti, Jorge e Gotlieb (2006)11 encontraram uma frequência de 67,1% de mortes maternas por causas obstétricas diretas,12 sendo 37% destas causadas por pré-eclâmpsia-eclâmpsia.13 1.2. Pré-eclâmpsia A pré-eclâmpsia afeta de 2 a 3% das gestações em todo o mundo e é responsável14 por cerca de 60.000 mortes maternas anualmente, principalmente nos países pobres15 (Organização Mundial de Saúde, 2005). Trata-se de uma síndrome específica da gestação16 que leva a uma perfusão sanguínea reduzida dos órgãos e está relacionada a vasoespasmos17 e ativação da cascata da coagulação. Ocorre frequentemente após a vigésima semana de18 gravidez e é determinada por aumento da pressão arterial (PAS ≥ 140 mmHg ou PAD ≥ 9019 mmHg) acompanhado de proteinúria (≥ 300 mg/24 hs) (Report of the National High Blood20 Pressure Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy, 2000.21
  20. 20. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 18 Esta síndrome sempre representa perigo para o binômio materno-fetal. Para o feto,1 a pré-eclâmpsia pode resultar em restrição do crescimento e parto prematuro. Já para a2 mãe, as complicações que podem ocorrer são diversas: falência renal, síndrome HELLP3 (hemólise, alterações de enzimas hepáticas e trombocitopenia), infarto ou morte (revisto4 por IRMINGER-FINGER, JASTROW e IRION, 2008).5 A pré-eclâmpsia pode ter outras manifestações maternas, como cefaléia, sonolência,6 taquicardia e náuseas e pode evoluir com vasoespasmo cerebral importante, com7 conseqüente crise convulsiva, o que caracteriza a eclâmpsia, podendo ocasionar seqüelas8 neurológicas maternas, ou até a morte (revisto por BROWN, 1995).9 Assim, é recomendado às gestantes que se submetam a uma triagem para10 determinação de proteína urinária e avaliação da pressão arterial a cada visita pré-natal,11 pois o intervalo entre a detecção da hipertensão e proteinúria e o subseqüente12 desenvolvimento de complicações potencialmente letais pode ser extremamente curto13 (SIBAI, 2003; SIBAI, CARITIS e HAUTH, 2003).14 A pré-eclâmpsia é mais comum em pacientes que possuem mães ou irmãs que15 tiveram a doença, o que sugere uma suscetibilidade genética (BROWN, 1995), e é mais16 freqüente em primigestas. Sendo assim, uma mulher que teve sua primeira gestação sem17 nenhuma intercorrência, tem poucas chances de desenvolver pré-eclâmpsia em uma18 segunda gestação. Entretanto, a chance de desenvolver a doença pode se reverter e chegar a19 10-15% caso haja troca de parceiro (NEED, 1975). Condições que diminuem o fluxo20 sanguíneo placentário, também podem aumentar o risco de desenvolvimento da pré-21 eclâmpsia, como hipertensão crônica e diabetes. As gestações gemelares, neoplasias22
  21. 21. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 19 trofoblásticas e gestações com isoimunizações aumentam a massa placentária e o risco de1 desenvolver pré-eclâmpsia, provavelmente devido à diminuição relativa do fluxo2 sanguíneo placentário (NEME, 1991).3 Tem sido sugerido que a pré-eclâmpsia é uma doença de dois estágios, sendo o4 primeiro, assintomático e caracterizado por desenvolvimento placentário anormal durante o5 primeiro trimestre, e resultando em insuficiência placentária e na liberação de excessivas6 quantidades de materiais placentários na circulação materna; e o segundo, sintomático,7 quando a gestante desenvolve a hipertensão característica, prejuízo renal e proteinúria, e8 está em risco de desenvolver a síndrome HELLP, eclâmpsia e outros danos em órgãos9 diversos (ROBERTS, 2000).10 A exata etiologia da pré-eclâmpsia ainda não é conhecida, sendo chamada de11 doença das teorias, entre as quais estão: (1) perfusão uteroplacentária reduzida, (2)12 anormalidades imunológicas e (3) desordens genéticas (LINDHEIMER e KATZ, 1981).13 Entretanto, é bastante provável que a síndrome seja ocasionada pela placenta (BROSENS14 et al., 1972; NAICKER et al., 2003), baseado no fato de que a única forma de acabar15 definitivamente com os sintomas da pré-eclâmpsia é através da retirada da placenta, e de16 que mulheres com gestações molares frequentemente desenvolvem pré-eclâmpsia grave.17 A vasculatura uterina sofre profundas modificações fisiológicas para proporcionar18 um aumento no fluxo sanguíneo para manter a gestação. No desenvolvimento placentário19 normal, o citotrofoblasto invade as arteríolas espiraladas maternas e as remodelam20 completamente em vasos de grande capacitância com baixa resistência (GERRETSEN et21 al., 1981). Análises de placentas provenientes de gestações complicadas pela pré-22 eclâmpsia, geralmente revelam infartos placentários e estreitamento de artérias e arteríolas,23 com uma diminuição característica de invasão endovascular pelo citotrofoblasto e um24
  22. 22. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 20 remodelamento inadequado das arteríolas espiraladas uterinas (Figura 1), o que resulta em1 vasos menos distensíveis e incapazes de nutrir adequadamente a placenta, tornando-a2 isquêmica (DE WOLF, BROSENS e ROBERTSON, 1982; LIM et al., 1997; MOHAUPT,3 2007).4 A placentação inadequada leva a isquemia placentária seguida por liberação5 sistêmica de produtos citotóxicos, os quais danificam o endotélio vascular materno (ZHOU6 et al., 2002; RODGERS, TAYLOR e ROBERTS, 1988; AHMED et al., 2000). A lesão7 celular endotelial vascular reduz a síntese de agentes vasodilatadores, aumenta8 Figura 1. Representação esquemática do útero humano em três situações: (a) não-gravídico, (b) em uma gestação complicada pela pré-eclâmpsia e (c) em uma gestação normal. Na gestação normal há invasão completa do citotrofoblasto e diferenciação das artérias espiraladas maternas. Na gestação pré-eclâmptica, a invasão do citotrofoblasto é superficial e limitada a regiões mais externas da decídua basal. As artérias espiraladas não sofrem diferenciação devido à invasão. Fonte: adaptado de MOHAUPT, 2007. a b c
  23. 23. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 21 responsividade aos vasoconstrictores, diminui a síntese de anticoagulantes endógenos e1 aumenta a síntese de pró-coagulantes, causando isquemia cerebral e disfunção renal e2 hepática (CARON et al., 1991). A existência de uma lesão celular endotelial generalizada é3 evidenciada por alterações morfológicas típicas (como o edema difuso do citoplasma da4 célula endotelial) que caracterizam a endoteliose glomerular, lesão histológica5 característica da pré-eclâmpsia (SPARGO et al., 1959; STILLMAN e KARUMANCHI,6 2007) (Figura 2).7 Uma participação imunológica para a gênese da pré-eclâmpsia tem sido especulada8 por muitos anos e baseia-se em estudos anatomopatológicos de biópsias de leitos9 placentários de gestantes normais comparadas às gestantes com pré-eclâmpsia (DEKKER,10 ROBILLARD e HULSEY, 1998). A placenta é um órgão de origem fetal e, como tal,11 possui determinantes genéticos tanto maternos quanto paternos (GREGG, 2004). Estudos12 sugerem que respostas imunológicas desencadeadas por antígenos fetais na circulação13 Figura 2. Endoteliose glomerular: (A) oclusão de capilares glomerulares devido ao edema das células endoteliais; (B) seta indica um único capilar não ocluso no tufo glomerular neste caso grave de oclusão de capilares; e (C) edema celular envolvendo mesângio e células endoteliais, levando a perda de fenestrações endoteliais e a oclusão de lumens de capilares. Fonte: STILLMAN e KARUMANCHI, 2007.
  24. 24. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 22 sanguínea poderiam interferir na invasão trofoblástica e na placentação, resultando em1 disfunção endotelial e insuficiência placentária (SCHNEIDER, LANDAU e MÖRTL,2 2001). Outros estudos sugerem que diferenças na expressão de HLA (antígeno leucocitário3 humano) podem estar associadas à pré-eclâmpsia e eclâmpsia (O’BRIEN et al., 2000).4 A presença de polimorfismos genéticos para alguns genes tem sido associada ao5 desenvolvimento de pré-eclâmpsia (CHEN et al., 1996; CURNOW, PHAM e AUGUST,6 2000; SPINA, ALEANDRI e MORINI, 2000; KOBASHI et al., 2000) e acredita-se que o7 polimorfismo possa agir como modificador de doença e modificador de resposta a agentes8 vasoativos endógenos ou exógenos, como os fármacos (SCHNEIDER, LANDAU e9 MÖRTL, 2001).10 Irminger-Finger, Jastrow e Irion (2008) descrevem a patogênese da pré-eclâmpsia11 como pouco entendida e a resumem conforme descrito a seguir.12 Fatores genéticos e imunológicos causam placentação anormal associada13 com obstrução funcional ou mecânica das arteríolas espiraladas, o que14 leva a diminuição da perfusão uteroplacentária. Isto ocasiona um15 desequilíbrio entre fatores vasoconstrictores e vasodilatadores resultando16 em vasoconstricção arterial, resultando em hipertensão arterial sistêmica17 e coagulação intravascular disseminada, responsáveis pela proteinúria,18 convulsões, testes funcionais hepáticos alterados e isquemia.19 Uma adaptação importante que ocorre no organismo materno, e que o prepara para20 a gestação, é a redução da pressão arterial como resultado da diminuição da resistência21 periférica secundária a uma vasodilatação. Na pré-eclâmpsia, um desarranjo em fatores22 vasoativos derivados do endotélio resulta no predomínio de substâncias vasoconstrictoras23 (endotelina, tromboxano A2) sobre as vasodilatadoras (óxido nítrico, prostaciclina). A24
  25. 25. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 23 hipertensão, definida como aferições repetidas maiores ou iguais a 140/90 mmHg, resulta1 então, de uma vasoconstricção anormal (HLADUNEWICH, KARUMANCHI e2 LAFAYETTE, 2007).3 Gestantes saudáveis exibem uma importante hiperfiltração glomerular, devido à4 diminuição da pressão oncótica plasmática nos capilares glomerulares. Nas gestantes com5 pré-eclâmpsia, níveis variáveis de insuficiência renal, com diminuição da taxa de filtração6 glomerular, estão associados com a endoteliose glomerular (HLADUNEWICH,7 KARUMANCHI e LAFAYETTE, 2007).8 A pré-eclâmpsia é diferenciada da hipertensão gestacional pela presença de9 proteinúria na gestação. Excreção significativa de proteína é definida com valores ≥ 30010 mg em uma amostra de urina coletada em 24 horas ou 1+ ou mais em teste urinário com11 tiras reativas de 2 amostras ocasionais que foram coletadas com intervalo de tempo de pelo12 menos 4 horas (BROWN et al., 2001).13 1.3. Proteinúria A unidade funcional do rim é o néfron, formado pelos seguintes elementos: o14 corpúsculo renal, representado pelo glomérulo e pela cápsula de Bowman; o túbulo15 proximal; a alça de Henle; o túbulo distal; e uma porção do ducto coletor. O glomérulo é16 responsável pela formação de um ultrafiltrado a partir do plasma e é formado por uma rede17 de capilares especializados (tufo glomerular), nutridos pela arteríola aferente e drenados18 pela arteríola eferente. Esta rede capilar projeta-se dentro de uma câmara que está19 delimitada por uma cápsula (cápsula de Bowman) que, por sua vez, possui uma abertura20
  26. 26. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 24 comunicando a câmara diretamente com o túbulo contornado proximal (RIELLA, de1 MOURA e RIELLA, 2003; TRYGGVASON e WARTIVAARA, 2005.) (Figura 3).2 A parede do capilar glomerular está formada por três camadas: (1) células3 endoteliais ou lâmina fenestrada, porção mais interna; (2) membrana basal, constituída4 basicamente por colágeno e glicoproteínas; e (3) células epiteliais (podócitos), camada5 mais externa (revisto por RIELLA, de MOURA e RIELLA, 2003) (Figura 3).6 Apesar de ter uma resistência à passagem de água extremamente baixa, a barreira7 de filtração glomerular restringe eficientemente a passagem de proteínas do sangue para o8 espaço de Bowman, com base no seu tamanho, carga elétrica e conformação molecular.9 Moléculas grandes e carregadas negativamente são menos filtradas que as pequenas e sem10 carga ou carregadas positivamente. Apesar disso, em condições fisiológicas, proteínas de11 baixa massa molecular e uma pequena quantidade de albumina atravessam a barreira de12 Figura 3. Sistema de filtração glomerular renal. Cada rim humano contém cerca de 1.000.000 de glomérulos. As arteríolas aferentes dão origem aos capilares glomerulares, cujas paredes constituem a barreira de filtração glomerular. A barreira de filtração glomerular é composta por células endoteliais fenestradas, membrana basal glomerular e podócitos, com as projeções de seus pés formando interdigitações. Fonte: adaptado de TRYGGVASON e WARTIOVAARA, 2005.
  27. 27. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 25 filtração glomerular, mas são, em grande parte, reabsorvidas pelas células tubulares.1 Aumento na excreção de proteínas na urina pode ser decorrente de aumento de sua2 filtração, por alterações na permeabilidade seletiva glomerular, ou de defeitos em sua3 captação tubular. Diversos estudos experimentais mostraram que as alterações de4 seletividade são resultados de uma combinação de perda de restrição por carga e por5 tamanho (revisto por D’AMICO e BAZZI, 2003).6 Normalmente, são filtrados 180 litros de plasma a cada dia pelos glomérulos,7 contendo 70 gramas/litro de proteína. No entanto, graças a um eficiente mecanismo de8 reabsorção, efetuado principalmente pelos túbulos proximais, menos de 150 mg de9 proteína são excretados por dia na urina. Destes, de 30 a 50 mg são de uma mucoproteína10 (Tamm-Horsfall) de alta massa molecular, e o restante se constitui de globulinas e muito11 pouca albumina (menos que 30 mg/dia). A presença de proteínas na urina em quantidades12 superiores aos 150 mg/dia considerados normais, caracteriza a proteinúria (revisto por13 RIELLA, PASCHALY e ZUNINO, 2003).14 De acordo com a disfunção renal que ocorre, a proteinúria patológica pode ser15 dividida em três categorias: glomerulares, tubulares e por hiperfluxo (revisto por16 BARRATT e TOPHAM, 2007).17 Na proteinúria glomerular, há dano da parede capilar glomerular, permitindo a18 passagem de proteínas de alta massa molecular em quantidades que superam a capacidade19 de reabsorção tubular. Em casos de proteinúria glomerular intensa, a albumina constitui de20 60 a 90% da proteinúria total e quantidades menores das quatro maiores frações de21 globulinas também são excretadas (KASISKE e KEANE, 2000). Considera-se, de modo22 geral, que proteinúrias acima de 1,0 g/dia, muito provavelmente, têm origem glomerular23 (RIELLA, PASCHALY e ZUNINO, 2003).24
  28. 28. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 26 Disfunções ou lesões tubulares proximais podem impedir a reabsorção normal de1 proteínas, resultando no aparecimento de proteínas, principalmente de baixa massa2 molecular, na urina. Além disso, proteínas derivadas de células epiteliais tubulares lesadas3 também podem ser excretadas pelos rins, caracterizando proteinúria. A este tipo, dá-se o4 nome de proteinúria tubular, a qual não excede 1 a 2 g/dia (KASISKE e KEANE, 2000).5 Quando proteínas, normais ou anormais, de baixa massa molecular são produzidas6 em maior quantidade, são filtradas livremente pelos glomérulos, entretanto sua quantidade7 ultrapassa a capacidade de reabsorção tubular. Tem-se, então, a proteinúria por hiperfluxo8 ou extravasamento. Neste caso, tanto a barreira de filtração quanto o túbulo renal estão9 intactos. (KASISKE e KEANE, 2000; ROSE, 2001; BASTOS, 1998).10 1.4. Proteinúria na pré-eclâmpsia Alterações hemodinâmicas na gestação levam a um aumento significativo no fluxo11 sanguíneo renal e na taxa de filtração glomerular, o que é acompanhado por um aumento12 na excreção urinária de proteínas, sendo considerado dentro da faixa de normalidade13 valores <300 mg/dia para gestantes (KUO, KOUMANTAKIS e GALLERY, 1992).14 É recomendado que o diagnóstico de pré-eclâmpsia seja baseado na coleta de15 amostra de urina de 24 horas, sempre que possível, ou como alternativa, que seja baseado16 na taxa proteína/creatinina urinária (“Report of the National High Blood Pressure17 Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy”, 2000).18 Entretanto, Soni et al. (2009) mostraram ausência de diferenças estatisticamente19 significativas quando compararam amostras de urina de 24 horas com amostras de 2 e 420
  29. 29. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 27 horas, sugerindo a possibilidade do uso de outros tipos de amostras de urina para a1 avaliação da proteinúria.2 A proteinúria tem sido proposta e estudada como um indicador da gravidade de pré-3 eclâmpsia e como preditora de seus sintomas (HOFMEYR e BELFORT, 2009), apesar de4 alguns autores não considerarem-na tão eficiente (THANGARATINAM et al., 2009).5 A proteinúria tem servido ainda para classificar a pré-eclâmpsia, sendo que valores6 ≥ 2 g/dia denotam uma gravidade mais elevada da doença e aumentam a certeza no7 diagnóstico (“Report of the National High Blood Pressure Education Program Working8 Group on High Blood Pressure in Pregnancy”, 2000), enquanto valores ≥ 5 g/dia são9 indicativos de diagnóstico de pré-eclâmpsia grave (American College of Obstetrics and10 Gynecology, 1996).11 Os mecanismos responsáveis pela proteinúria na pré-eclâmpsia ainda estão para12 serem elucidados. Sabe-se que ocorrem alterações hemodinâmicas nesta doença que13 impedem o aumento da taxa de filtração glomerular que ocorre em gestações normais14 (BROWN, 1995), mas parece pouco provável que apenas essas alterações sejam15 responsáveis pelo aumento da excreção protéica urinária característica da síndrome.16 Geralmente, a urina proveniente de pacientes com pré-eclâmpsia demonstra pouca17 seletividade e não difere significativamente de outras formas de doença renal primária18 (SIMANOWITZ e MACGREGOR, 1974). Proteínas de tamanhos intermediários,19 originadas de danos glomerulares, como a albumina, têm sido identificadas sozinhas ou em20 combinação com proteínas de origem tubular, tais como a β2-microglobulina, refletindo o21 dano tubular que também ocorre na pré-eclâmpsia grave (WINKLER et al., 1988; QUASS22 et al., 1987).23
  30. 30. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 28 Na pré-eclâmpsia, ocorrem diversas alterações em componentes do glomérulo.1 Biópsias renais têm demonstrado uma endoteliose característica das células endoteliais2 glomerulares, o que pode afetar a filtração glomerular de proteínas (HOLT, MANGOS e3 BROWN, 2007). Lafayette et al. (1998) notaram um espessamento significativo da4 membrana basal glomerular, decorrente de depósitos fibrinóides, e uma diminuição de5 fenestrações endoteliais expostas, em um estudo de biópsia renal de pacientes pré-6 eclâmpticas, e sugeriram que estes seriam os motivos da diminuição da taxa de filtração7 glomerular encontrada nesta doença. Naicker et al. (1997) além de também encontrarem o8 espessamento da membrana basal dos glomérulos na pré-eclâmpsia, reportaram uma9 redução no número de sítios aniônicos nesta membrana basal, o que poderia contribuir para10 a proteinúria aumentada. Os podócitos, células que formam a camada final da barreira11 glomerular, são fontes de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), e estudos12 experimentais demonstraram que a redução ou o bloqueio do VEGF derivado de podócitos,13 em animais, resulta em disfunção endotelial e proteinúria semelhante à vista na pré-14 eclâmpsia (MAYNARD et al., 2003).15 Recentemente foi demonstrado que níveis séricos do receptor solúvel de tirosina16 quinase (sFlt-1), do VEGF e do fator de crescimento placentário (PIGF) estão alterados na17 pré-eclâmpsia (MAYNARD et al., 2003; LEVINE et al., 2004). Níveis séricos aumentados18 de sFlt-1 , os quais reduzem os níveis de PIGF livres, parecem preceder o aparecimento19 dos sintomas da doença por cinco semanas (LEVINE et al., 2004; THADHANI et al.,20 2004). Ao contrário, as concentrações séricas de VEGF encontram-se diminuídas ao longo21 da gestação, e não predizem precisamente a pré-eclâmpsia (LEVINE et al., 2004). A22 significância dos fatores angiogênicos VEGF, sFlt-1 e PIGF na regulação da fisiologia23 vascular glomerular do rim humano merece uma atenção aumentada. sFlt-1 administrado24 exogenamente a roedoras prenhas levaram a hipertensão, proteinúria e endoteliose25
  31. 31. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 29 glomerular (SUGIMOTO et al., 2003). Similarmente, neutralização de níveis fisiológicos1 de VEGF, um fator de sobrevivência mitogênico, importante para o endotélio vascular2 glomerular, levou a um aumento da apoptose, diminuição do reparo do capilar glomerular,3 e acentuada proteinúria em modelo animal de nefrite mesangioproliferativa (OSTENDORF4 et al., 1999).5 Se estes fatores angiogênicos atuam diretamente sobre a membrana basal6 glomerular, levando a alterações funcionais que poderiam ser importantes para explicar a7 presença da proteinúria nesta doença multissistêmica, isto ainda está para ser esclarecido.8 Sabe-se que existe uma forte correlação entre a intensidade da proteinúria e uma9 diminuição de proteoglicanos na membrana basal glomerular (KHEDUN et al., 2002). O10 proteoglicano sulfato de heparan é considerado o principal responsável pela seletividade de11 carga da membrana basal glomerular, e sua diminuição resulta em uma redução da carga12 aniônica desta membrana. A excreção urinária de heparan sulfato está significativamente13 aumentada em mulheres negras africanas com pré-eclâmpsia, existindo uma forte14 correlação entre a intensidade da proteinúria e a diminuição de carga da membrana basal,15 induzindo a mudanças estruturais na barreira de filtração, o que poderia ser o mecanismo16 responsável pela proteinúria na pré-eclâmpsia (KHEDUN et al., 2002).17 Existem, também, evidências de que possa haver alguma disfunção tubular na pré-18 eclâmpsia. Estudos avaliando a excreção de substâncias normalmente reabsorvidas por19 células do túbulo proximal demonstraram diminuição do clearance destas substâncias em20 gestações que evoluíram com hipertensão (GALLERY e GYORY, 1979) ou pré-eclâmpsia21 (SAUDAN, FARREL e BROWN, 1998). Além disso, marcadores de lesão tubular, como a22 N-acetil-β-D-glucosamiminidase urinária, já foram relatados em maiores concentrações23 entre pré-eclâmpticas do que em gestantes normotensas (MADIAS e HARRINGTON,24
  32. 32. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 30 1978). Yamamoto et al. (1992) referiram, através de um estudo com imunoblot, que pelo1 menos 12% das proteínas urinárias na pré-eclâmpsia eram de origem tubular, enquanto que2 15% tinham origem puramente glomerular, de acordo com suas massas moleculares.3 De acordo com Jeyabalan e Conrad (2007), o aumento da excreção urinária de4 proteínas da pré-eclâmpsia é decorrente de alterações na seletividade, no tamanho e/ou5 carga da barreira de filtração glomerular, o que possivelmente aumenta a pressão capilar6 glomerular e compromete a reabsorção tubular proximal.7 Diversos estudos têm estudado a proteinúria da pré-eclâmpsia no intuito de8 encontrar proteínas potencialmente preditoras da doença. Pesquisas voltadas à investigação9 do potencial valor da medida da concentração de albumina urinária, como um método para10 detectar pacientes com probabilidade de desenvolver pré-eclâmpsia, mostraram resultados11 contraditórios (IRGENS-MOLLER, HEMMINGSEN e HOLM, 1986; RODRIGUEZ et12 al., 1988; KONSTANTIN-HANSEN, HESSELDAHL e PEDERSEN, 1992; DAS et al.,13 1996; WAUGH et al., 2003). Este fato foi atribuído à variedade de métodos utilizados na14 seleção de pacientes, bem como nos critérios de inclusão das pacientes nos vários grupos15 de estudo. Um estudo que avaliou a presença de microalbuminúria e excreção urinária de16 cálcio em 88 gestantes demonstrou que 83% das pacientes que apresentaram altos níveis de17 microalbuminúria e baixa excreção de cálcio, desenvolveram pré-eclâmpsia subseqüente18 (RODRIGUEZ et al., 1988). Por outro lado, outros pesquisadores mostraram que pacientes19 que desenvolveram pré-eclâmpsia com proteinúria clinicamente detectável não20 apresentaram microalbuminúria prévia (KONSTANTIN-HANSEN, HESSELDAHL,21 PEDERSEN, 1992; LOPEZ-ESPINOZA et al., 1986).22 Li, Chu e Zhou, em 1995, demonstraram que a excreção urinária de albumina, IgA23 (imuglobulina A) e IgG (imunoglobulina G), mas não IgM (imunoglobulina M), estava24
  33. 33. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 31 significativamente aumentada em gestantes hipertensas, quando comparadas a gestantes1 normais em diferentes idades gestacionais, e que a excreção dessas proteínas se2 correlacionava positivamente com a pressão arterial média. Ao contrário, os resultados de3 um estudo avaliando o padrão protéico da urina de pacientes no terceiro trimestre de4 gravidez, realizado para diferenciar a genuína pré-eclâmpsia da pré-eclâmpsia sobreposta à5 glomerulopatias pré-existentes, mostrou que 47% das pacientes apresentavam um padrão6 protéico misto, independente da gravidade da doença (KALTENBACH et al., 1983).7 O padrão protéico urinário também foi estudado, através de eletroforese em gel de8 poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), comparando homens e9 mulheres não-grávidas e sadios, mulheres grávidas sem intercorrências no curso da10 gravidez e pacientes grávidas hipertensas, e o dado mais marcante observado foi a redução11 ou desaparecimento de uma banda protéica de 105 kDa, correspondente à proteína Tamm-12 Horsfall, na maioria das pacientes grávidas hipertensas (RATH et al., 1988). Shinagawa e13 Saitoh (1983) fizeram análises imunológicas das proteínas urinárias de pacientes com pré-14 eclâmpsia e observaram que muitos tipos de proteínas podem ser detectados na urina além15 da albumina, e sugerem que “proteinúria” seja o termo mais adequado que “albuminúria”,16 para se referir à excreção protéica urinária da pré-eclâmpsia. Entre as proteínas mais17 freqüentemente detectadas na urina das pacientes encontravam-se albumina, transferrina,18 IgG, inibidor de alfa-1-antitripsina, IgA e IgM, sendo que após o parto algumas dessas19 proteínas desapareciam prontamente da urina, como o inibidor de alfa-1-antitripsina e IgA.20 Outro estudo mostrou grandes quantidades de IgM, fibronectina, IgG e β2-microglobulina21 em urinas de pacientes com pré-eclâmpsia (YAMAMOTO et al., 1992).22
  34. 34. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 32 1.5. Proteínas plasmáticas na pré-eclâmpsia Em um indivíduo adulto, a concentração de proteínas totais no plasma varia de 6,01 a 8,0 g/dL. Consistem de uma mistura complexa de proteínas simples, lipoproteínas e2 glicoproteínas, sendo que a maioria delas tem síntese hepática. Já as γ-globulinas são3 sintetizadas nos plasmócitos e algumas proteínas podem ser sintetizadas em células4 endoteliais (revisto por GRAS, 1983).5 As proteínas totais do plasma podem ser separadas, identificadas e quantificadas6 por diversos métodos, incluindo métodos de cromatografia, eletroforese e7 espectrofotometria. Em laboratórios clínicos, emprega-se geralmente a espectrofotometria8 e a eletroforese em fita de acetato de celulose em tampão pH 8,6. Este método9 eletroforético permite a separação das proteínas do soro em cinco frações: albumina, α1-10 globulinas, α2-globulinas, β-globulinas e γ-globulinas (Figura 4). Com exceção da fração11 albumina, todas as outras frações são compostas de diferentes proteínas, com pontos12 isoelétricos semelhantes. Quando a eletroforese é feita utilizando-se plasma, nota-se uma13 fração adicional entre as frações β e γ, correspondente ao fibrinogênio (revisto por GRAS,14 1983).15 Figura 4. Perfil eletroforético das proteínas do soro sanguíneo humano. Fonte: HIAL et al., 2008. Albumina------------54-59% α1-globulinas-------04-07% α2-globulinas-------08-09% β-globulinas--------12-14% γ-globulinas---------11-18%
  35. 35. Introdução Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 33 Devido às inter-relações existentes entre as proteínas plasmáticas e proteínas de1 outros tecidos, alguns pesquisadores estudaram as proteínas plasmáticas de mulheres2 gestantes hígidas e gestantes com diagnóstico de pré-eclâmpsia. O volume de sangue3 circulante está significativamente aumentado durante a gestação normal, sendo que o4 volume plasmático se expande mais que o celular (BERLIN et al., 1953; CATON et al.,5 1951). A concentração de proteínas sanguíneas na gestação normal diminui até 26ª semana6 e se mantém baixa até o 3° trimestre, enquanto que a concentração de albumina diminui7 progressivamente até a 36ª semana e a de globulinas aumenta (BLEKTA et al., 1970).8 Bagga e Dutt Mullick (1966) descreveram que a diminuição de proteínas totais e albumina9 sérica foi constatada por diversas pesquisas, apesar das discrepâncias encontradas nos10 resultados das análises seriadas de proteínas totais séricas durante o curso da gestação.11 Estudos demonstraram que concentrações de proteínas totais e de albumina estão12 também reduzidas no sangue de pacientes com pré-eclâmpsia (BLEKTA et al., 1970;13 FREIS e KENNY, 1948; MACGILLIVRAY e TOVEY, 1957, BAGGA e DUTT14 MULLICK, 1966). Além disso, a redução do volume sanguíneo circulante e da quantidade15 absoluta de proteínas pode ocorrer, inclusive, antes do aparecimento dos sintomas clínicos16 da pré-eclâmpsia (BLEKTA et al., 1970).17
  36. 36. Justificativa Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 34 2. JUSTIFICATIVA A pré-eclampsia é uma desordem hipertensiva comum da gestação, tem alta1 prevalência em todo o mundo e pode levar à morte materna e/ou fetal. Ainda não possui2 uma etiologia conhecida e fisiopatologia bem definida.3 Estudando a literatura, observamos que os mecanismos que levam á proteinúria e o4 perfil protéico urinário na pré-eclâmpsia ainda não estão completamente estabelecidos.5 Além disso, a proteinúria, como ocorre na síndrome nefrótica, é acompanhada por6 alterações significativas no perfil protéico plasmático e estudos relativos às proteínas7 plasmáticas na pré-eclâmpsia são raros e não associam proteinúria e proteinemia.8 Sendo a proteinúria um parâmetro importante para o diagnóstico e9 acompanhamento de pacientes com pré-eclâmpsia, propusemos uma análise do perfil10 protéico urinário de gestantes pré-eclâmpticas e normotensas, com o intuito de conhecer o11 padrão de proteínas excretadas nesta doença e tentar relacioná-lo com a provável disfunção12 renal que possa estar ocorrendo.13 Uma avaliação quantitativa e qualitativa das proteínas do plasma é também de14 interesse quando avaliamos pacientes que apresentam proteinúria tão significativa quanto a15 que pode ser observada na pré-eclâmpsia. Diante das poucas informações existentes na16 literatura sobre parâmetros plasmáticos na pré-eclâmpsia, propusemos também uma análise17 do perfil protéico plasmático destas gestantes, para verificar quais alterações a proteinúria18 pode estar desencadeando nas proteínas plasmáticas de pacientes com pré-eclâmpsia.19
  37. 37. Objetivos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 35 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral O objetivo deste estudo é avaliar os perfis protéicos urinário e plasmático em pacientes gestantes com pré-eclâmpsia e normotensas. 3.2. Objetivos específicos 1. Analisar os perfis eletroforéticos urinários de cada paciente do estudo e as diferenças existentes entre os grupos; 2. Comparar os níveis plasmáticos de proteínas totais e albumina entre as gestantes com pré-eclâmpsia e as normotensas; 3. Correlacionar os níveis de proteínas totais plasmáticas e a excreção urinária de proteínas das pacientes com pré-eclâmpsia; 4. Analisar os perfis eletroforéticos plasmáticos de cada paciente e compará-los entre os grupos.
  38. 38. Materiais e Métodos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 36 4. MATERIAIS E MÉTODOS Esta pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Bioquímica e1 Biofísica do Departamento de Ciências Biológicas (DCB) da Universidade Federal do2 Triângulo Mineiro (UFTM).3 Todos os procedimentos realizados durante a realização deste estudo foram4 analisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFTM (CEP-UFTM/ N°:5 309/2002) (Anexo A). As pacientes foram informadas sobre o estudo, concordaram em6 participar e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo B).7 Esta dissertação foi escrita de acordo com as normas da Associação Brasileira de8 Normas Técnicas (ABNT) e com o Roteiro para Confecção de Teses do Curso de Pós-9 Graduação em Patologia (CPGP) da UFTM.10 4.1. Obtenção e Processamento das Amostras Este estudo foi realizado com amostras provenientes de 14 gestantes com pré-11 eclâmpsia internadas na enfermaria de Obstetrícia do Departamento Materno-Infantil da12 UFTM e amostras de 11 gestantes normotensas acompanhadas no Ambulatório Maria da13 Glória da UFTM.14 As gestantes com pré-eclâmpsia foram selecionadas com base no seu diagnóstico,15 ou seja, desenvolvimento de hipertensão arterial (pressão arterial ≥140/90 mmHg) e16 proteinúria (≥ 300 mg/24 horas) após 20 semanas de gestação (segundo critérios do17
  39. 39. Materiais e Métodos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 37 “Report of the National High Blood Pressure Education Program Working Group on High1 Blood Pressure in Pregnancy”, 2000).2 Em ambos os grupos, os critérios de exclusão foram: presença de doenças crônicas,3 infecção urinária, comprometimento da função renal, avaliado através de dosagem de4 clearance de creatinina, e estar em uso de medicamentos.5 Os dados demográficos de nossas pacientes foram obtidos por meio de seus6 prontuários no Serviço de Arquivo Médico (SAME) do Hospital de Clínicas da UFTM, e7 constam no Apêndice A. As características demográficas de ambos os grupos de pacientes8 estão sumarizados na Tabela 1 e foram reportados por meio de médias ± desvios padrões9 ou percentuais.10 Tabela 1. Dados demográficos de gestantes normotensas e pré-eclâmpticas Característica Gestantes normotensas (n=11) Gestantes pré-eclâmpticas (n=14) Idade materna (anos) * 27,4 ± 4,9 21,1 ± 5,8 Idade Gestacional (semanas) * 34,0 ± 2,3 31,0 ± 2,1 Número de gestações Primigestas Duas ou mais gestações 3 (27,3%) 8 (72,7%) 9 (64,3%) 5 (35,7%) Pressão Arterial Sistólica (mmHg) ** 112,7 ± 9,0 152,1 ± 10,5 Pressão Arterial Diastólica (mmHg) ** 71,8 ± 7,5 104,3 ± 5,1 Proteinúria (mg/24 hs) ** 122,2 ± 23,4 3.366,4 ± 3,3 *Diferença estatística significativa entre os grupos (p<0,05); **Diferença estatística altamente significativa entre os grupos (p<0,0001); Foram coletadas amostras de urina de 24 horas sem conservante e amostras de 611 horas com conservante, para prevenir crescimento microbiano, consecutivamente, por12
  40. 40. Materiais e Métodos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 38 micções espontâneas, e mantidas em banho de gelo. O frasco para coleta da amostra de1 urina de 6 horas continha 10 mL de HCl 6N, o que manteve o pH da maioria das nossas2 amostras abaixo de 4,0. As amostras foram filtradas em papel de filtro Whatman SS 50 e3 congeladas a -20°C até o momento dos procedimentos laboratoriais.4 Uma amostra de urina de um paciente do sexo masculino com proteinúria5 significativa do tipo glomerular foi coletada e processada sob as mesmas condições, e6 utilizada como padrão de proteinúria glomerular.7 As pacientes do estudo foram submetidas à punção venosa (20 mL) em tubo,8 contendo 0,1 mL de uma solução de citrato de sódio (0,05 M). Em seguida o sangue foi9 centrifugado a 3000 rpm, durante 10 minutos, a 4°C. Os sobrenadantes foram separados e10 mantidos congelados a -20°C até o momento do uso.11 4.2. Avaliação do perfil protéico das amostras de urina Realizou-se a avaliação do perfil protéico das amostras de urina por meio de12 eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), de13 acordo com o método descrito por Laemmli (1970). Foram realizadas eletroforeses em géis14 com 10% de acrilamida:bisacrilamida e corados pelo método da prata amoniacal (TUÑON15 e JOHANSON, 1984), conforme descrito no Anexo C. Em todas as canaletas aplicou-se a16 mesma quantidade de proteínas (20 µg), tanto para as amostras provenientes de pré-17 eclâmpsia quanto para as controles. Os padrões de massa molecular utilizados foram:18 anidrase carbônica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa) e albumina bovina (66 kDa).19
  41. 41. Materiais e Métodos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 39 Determinou-se a massa molecular das bandas protéicas mais intensas e bem1 definidas de cada amostra de urina a partir da corrida eletroforética. Para isso, mediu-se a2 distância correspondente à migração do tampão da amostra, demarcada pelo azul de3 bromofenol, e as distâncias correspondentes à migração das bandas dos padrões de massa4 molecular e das amostras, sendo a medição realizada no meio da banda protéica. Calculou-5 se o quociente de cada valor obtido para a migração das bandas protéicas pela medida da6 frente de migração do tampão de amostra, para a obtenção do Rf (relativo à frente). Os7 quocientes obtidos para os padrões de massa molecular foram utilizados para a confecção8 de um gráfico em papel semilog, com os valores de massa molecular no eixo das ordenadas9 e os valores de Rf no eixo das abscissas. Em seguida, por interpolação gráfica, encontrou-10 se o valor da massa molecular aparente de cada banda protéica investigada, a partir de seus11 valores de Rf, conforme descrito por Zwaan (1967).12 4.3. Determinação da concentração de proteínas totais das amostras de plasma Determinou-se a concentração de proteínas totais das amostras de plasma por meio13 do método do Biureto (GORNALL, BARDAWILL e DAVID, 1949), utilizando o conjunto14 de reagentes comercial da Labtest Diagnóstica® .15 Quanto ao procedimento técnico, utilizou-se tubos de ensaio em número16 dependente da quantidade de amostras, incluindo dois tubos: um para a dosagem do padrão17 e outro, para a leitura do branco. Em todos os tubos, adicionou-se 2,5 mL do reagente de18 Biureto. Ao tubo branco, acrescentou-se 0,05 mL de água destilada e deionizada, ao tubo19 padrão, 0,05 mL do reagente padrão e aos tubos testes, 0,05 mL das amostras.20
  42. 42. Materiais e Métodos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 40 Após agitar os tubos e deixá-los em repouso durante 15 minutos, as absorbâncias1 dos testes e do padrão foram lidas em 545 nm em espectrofotômetro (Micronal B582),2 acertando o zero com o branco.3 A concentração de proteínas totais das amostras foi determinada a partir dos4 cálculos:5 (1) Proteínas totais (g/dL) = Fator de calibração x Absorbância do teste (2) Fator de calibração = Concentração do padrão Absorbância do padrão 4.4. Determinação da concentração de albumina das amostras de plasma Determinou-se a concentração de albumina das amostras de plasma por meio do6 método do Verde de Bromocresol (SMITH, DESAUTELS e DOWNEY, 1954), utilizando7 o conjunto de reagentes comercial da Analisa® .8 Quanto ao procedimento técnico, utilizou-se tubos de ensaio em número9 dependente da quantidade de amostras, incluindo dois tubos: um para a dosagem do padrão10 e outro, para a leitura do branco. Em todos os tubos, adicionou-se 2,0 mL do reagente de11 cor (Verde de Bromocresol). Ao tubo padrão, acrescentou-se 0,02 mL do reagente padrão e12 aos tubos testes, 0,02 mL das amostras.13 Após agitar os tubos e deixá-los em repouso durante um minuto, as absorbâncias14 dos testes e do padrão foram lidas em 630 nm em espectrofotômetro (Micronal B582),15 acertando o zero com o branco.16
  43. 43. Materiais e Métodos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 41 A concentração de albumina plasmática foi determinada a partir dos cálculos:1 (1) Albumina (g/dL) = Fator de calibração x Absorbância do teste (2) Fator de calibração = Concentração do padrão Absorbância do padrão 4.5. Avaliação do perfil protéico das amostras de plasma A avaliação do perfil protéico das amostras de plasma foi realizada através de2 eletroforeses em fitas de acetato de celulose coradas pelo Ponceau S (KOROTZER,3 BERGQUIST e SEARCY, 1961), conforme descrito no Anexo D. Estas fitas foram4 submetidas à determinação de absorbância em 520 nm em densitômetro digital (CELM –5 DS35) e os resultados foram expressos em porcentagens para cada fração protéica. As6 concentrações absolutas de cada fração foram calculadas com base nos valores obtidos7 para dosagem de proteínas plasmáticas totais de cada paciente.8 4.6. Análise Estatística dos Resultados Os resultados foram analisados estatisticamente construindo planilhas eletrônicas9 no programa Microsoft Excel® (Redmond, WA) e realizando cálculos e construindo10 gráficos no programa BioEstat 5.0.11 Para analisar a normalidade das variáveis, utilizou-se o teste de Lilliefors.12 Para verificar diferenças entre os grupos de gestantes normotensas e pré-13 eclâmpticas em relação a seus dados demográficos (idade materna, idade gestacional,14
  44. 44. Materiais e Métodos Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 42 pressão arterial e proteinúria de 24 horas) utilizou-se o teste de Mann-Whitney, devido à1 distribuição não-normal destes dados. Realizou-se também cálculo de frequência de2 primigestas em cada grupo de gestantes.3 Quanto aos perfis eletroforéticos das amostras de urina, realizou-se análise4 descritiva das bandas protéicas observadas em cada amostra de ambos os grupos de5 pacientes.6 Para verificar diferenças entre os grupos de pacientes do estudo quanto às dosagens7 plasmáticas realizadas (proteinemia e albuminemia), utilizou-se o teste t student, devido à8 normalidade na distribuição dos dados obtidos.9 Para correlacionar a excreção urinária de proteínas e a dosagem de proteínas10 plasmáticas de cada paciente com pré-eclâmpsia, utilizou-se o teste de correlação linear de11 Spearman, devido à distribuição não-normal dos dados.12 Quanto aos perfis eletroforéticos das amostras de plasma, comparou-se os dois13 grupos de pacientes quanto aos percentis e às concentrações de cada fração protéica14 plasmática. Para tal, utilizou-se o teste de Mann-Whitney, para amostras com distribuição15 não-normal, e o teste t student, para amostras com distribuição normal.16 O nível de significância para todos os testes foi de α=0,05.17
  45. 45. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 43 5. RESULTADOS 5.1. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 24 horas A avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 24 horas por meio de1 eletroforeses em géis de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi2 possível em dez amostras de gestantes com pré-eclâmpsia e nove amostras de gestantes3 normotensas, devido à visível contaminação microbiana nas demais amostras coletadas.4 A seguir, encontram-se esquemas demonstrando os padrões protéicos urinários5 obtidos por meio de SDS-PAGE das amostras de 24 horas (Figuras 5A e 5B) das gestantes6 com pré-eclâmpsia e das gestantes controles. Nos esquemas, observamos marcações7 referentes às bandas mais intensas e bem definidas de cada amostra utilizada no estudo, de8 acordo com sua massa molecular estimada, e sua frequência entre as amostras de cada9 grupo.10 As imagens das eletroforeses constam no Apêndice B, mostrando todos os perfis11 eletroforéticos das amostras de urina de 24 horas das gestantes com pré-eclâmpsia, das12 normotensas e os padrões de massa molecular utilizados.13 Quanto às amostras provenientes de gestantes com pré-eclâmpsia, em apenas uma14 amostra analisada por SDS-PAGE verificou-se ausência de bandas protéicas. Em todas as15 outras amostras analisadas, verificou-se a presença de bandas, que variaram em número,16 intensidade de coloração e distância de migração, havendo bandas distribuídas por toda a17 extensão do gel. As proteínas mais frequentes neste grupo foram aquelas com massa18 molecular em torno de 66 kDa (80%), 56 kDa (80%) e 45 kDa (70%). Apesar da proteína19
  46. 46. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 44 de 66 kDa estar presente em 80% das amostras analisadas, do ponto de vista quantitativo,1 ela constituiu o principal componente protéico do perfil em apenas 20% das amostras,2 enquanto que a de 56 kDa predominou em 60% dos perfis eletroforéticos. A proteína de 453 kDa foi o componente predominante em apenas uma das amostras. Outras proteínas4 também se mostraram constantes entre estas amostras, como aquelas de massas5 moleculares de cerca de 40 kDa (60%), 38 kDa (60%) e 30 kDa (50%), sendo que em6 nenhuma amostra estas bandas foram as preponderantes do perfil protéico.7 Em relação às amostras de 24 horas das gestantes controles, verificamos ausência8 de bandas protéicas em apenas duas amostras, sendo que as outras apresentaram bandas9 que também variaram em número, intensidade de coloração e distância de migração,10 havendo bandas distribuídas por toda a extensão do gel. As proteínas mais frequentes entre11 essas amostras foram as de cerca de 50 kDa, 45 kDa, 38 kDa e 33 kDa, que apresentaram12 frequência de 55,5% cada uma dentro do grupo. A proteína de cerca de 66 kDa, massa13 molecular similar à albumina, também esteve presente entre os perfis observados neste14 grupo, apresentando frequência de 33,3% (3 amostras), sendo que em duas destas amostras15 esta banda protéica representava o principal componente. Entre as outras bandas protéicas,16 não foi observada a constância de uma banda predominante.17 Comparando os perfis entre os grupos de gestantes, observamos que os perfis18 eletroforéticos das gestantes com pré-eclâmpsia apresentam um número maior de bandas e19 que estas se coraram mais intensamente. Além disso, as bandas de 40 e 30 kDa estavam20 presentes em 60% e 50% das amostras do grupo de gestantes com pré-eclâmpsia,21 respectivamente, e não foram visualizadas em nenhuma amostra do grupo controle.22
  47. 47. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 45 AmostrasMassa Molecular Aparente 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 Frequência no grupo 95 kDa 90 kDa 20% 85 kDa 20% 80 kDa 30% 75 kDa 10% 66 kDa 80% 60 kDa 20% 56 kDa 80% 54 kDa 50 kDa 30% 48 kDa 40% 45 kDa 70% 42 kDa 30% 40 kDa 60% 38 kDa 60% 33 kDa 30% 30 kDa 50% 27 kDa 30% 24 kDa 20% 22 kDa 10% 20 kDa 30% 19 kDa 20% AmostrasMassa Molecular Aparente 15 16 17 18 19 20 22 23 24 Frequência no grupo 95 kDa 11,1% 90 kDa 85 kDa 11,1% 80 kDa 22,2% 75 kDa 66 kDa 33,3% 60 kDa 33,3% 56 kDa 44,4% 54 kDa 22,2% 50 kDa 55,5% 48 kDa 22,2% 45 kDa 55,5% 42 kDa 22,2% 40 kDa 38 kDa 55,5% 33 kDa 55,5% 30 kDa 27 kDa 22,2% 24 kDa 22 kDa 22,2% 20 kDa 11,1% 19 kDa 11,1% Figura 5. Esquema demonstrando o perfil urinário protéico das amostras de 24 horas de gestantes com pré-eclâmpsia (A) e normotensas (B), segundo a massa molecular das bandas, e demonstrando a frequência de cada banda no grupo A B
  48. 48. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 46 5.2. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 6 horas Avaliamos, por meio de SDS-PAGEs, o perfil protéico urinário das amostras de 61 horas em todas as 14 amostras de gestantes com pré-eclâmpsia e as 11 amostras de2 gestantes controles.3 A seguir, encontram-se esquemas demonstrando os padrões protéicos urinários4 obtidos por meio de SDS-PAGE das amostras de 6 horas colhidas com HCl 6N (Figuras5 6A e 6B) das gestantes com pré-eclâmpsia e das controles. Nos esquemas observamos6 marcações referentes às bandas mais intensas e bem definidas de cada amostra utilizada no7 estudo, de acordo com sua massa molecular estimada, e sua frequência entre as amostras8 de cada grupo.9 As imagens das eletroforeses constam no Apêndice C, mostrando todos os perfis10 eletroforéticos das amostras de urina de 6 horas das gestantes com pré-eclâmpsia, das11 normotensas e os padrões de massa molecular utilizados.12 Quanto às amostras provenientes de pacientes com pré-eclâmpsia, em todos os13 perfis eletroforéticos verificou-se a presença de bandas protéicas, que variaram, em14 número, intensidade de coloração e distância de migração, havendo bandas distribuídas por15 toda a extensão do gel. As proteínas mais frequentes foram aquelas com massas16 moleculares em torno de 16 kDa (78,6%), 10 kDa (71,4%) e 2,0 kD (71,4%). Bandas com17 massas moleculares estimadas em 50 kDa, 45 kDa, 37 kDa e 12,5 kDa foram encontradas18 na frequência de 50% cada uma dentro do grupo. Cinco pacientes pré-eclâmpticas (35,7%)19 apresentaram proteínas com massas moleculares ≥ 60 kDa, sendo que apenas uma (7,1%)20 apresentou uma banda com massa molecular semelhante à albumina.21
  49. 49. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 47 Em relação às amostras controles, visualizou-se a presença de bandas protéicas em1 36,4% das amostras, sendo a banda de 2,0 kDa a mais frequente no grupo. Uma proteína de2 massa molecular de 20 kDa estava presente em 27,3% destas amostras, sendo a segunda3 banda mais frequente no grupo. Proteínas com massas moleculares de 50 e 45 kDa, apesar4 de frequentes entre as gestantes com pré-eclâmpsia, não foram visualizadas entre os perfis5 das gestantes normotensas. A banda protéica de 12,5 kDa foi visualizada em apenas 26 gestantes controle (18,2%) apesar de sua alta frequência (50%) entre as pré-eclâmpticas.7 Comparando-se os perfis eletroforéticos obtidos com as amostras urinárias de 248 horas com os perfis obtidos com as amostras de 6 horas com conservante, observou-se9 expressivas diferenças nos padrões de bandas exibidos. Nos perfis das amostras de 6 horas10 com HCl, há predomínio de bandas com massas moleculares mais baixas e peptídeos, além11 do desaparecimento de algumas bandas e surgimento de outras.12
  50. 50. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 48 Figura 6. Esquema demonstrando o perfil urinário protéico das amostras de gestantes com pré-eclâmpsia (A) e normotensas (B), segundo a massa molecular das bandas, e demonstrando a frequência de cada banda no grupo AmostrasMassa Molecular Aparente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Frequência no grupo 75 kDa 7,1% 66 kDa 7,1% 60 kDa 35,7% 50 kDa 50% 45 kDa 50% 37 kDa 50% 27 kDa 35,7% 22 kDa 35,7% 20 kDa 35,7% 16 kDa 78,6% 12,5 kDa 50% 10 kDa 71,4% 8,4 kDa 42,9% 7,5 kDa 28,6% 3,0 kDa 42,9% 2,0 kDa 71,4% AmostrasMassa Molecular Aparente 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Frequência no grupo 75 kDa 66 kDa 9,1% 60 kDa 50 kDa 45 kDa 37 kDa 9,1% 27 kDa 22 kDa 20 kDa 27,3% 16 kDa 9,1% 12,5 kDa 18,2% 10 kDa 9,1% 8,4 kDa 7,5 kDa 3,0 kDa 2,0 kDa 36,4% A B
  51. 51. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 49 5.3. Determinação da concentração de proteínas totais e albumina plasmáticas Na Tabela 2, encontram-se os valores médios obtidos para proteínas totais e1 albumina das amostras de plasma de pacientes com pré-eclâmpsia e normotensas. Os2 valores obtidos para cada amostra constam no Apêndice D.3 Verificamos que a média das concentrações de proteínas totais e albumina4 plasmáticas no grupo de pré-eclâmpticas foi de 5,1 (±0,9) g/dL e 2,6 (±0,7) g/dL,5 respectivamente. As gestantes normotensas mantiveram médias de 6,3 (±0,6) g/dL para6 proteínas totais plasmáticas e 3,8 (±0,5) g/dL para albumina.7 Proteínas totais* (g/dL) Albumina* (g/dL) Pré-eclâmpsia 5,1 ± 0,9 2,6 ± 0,7 Controle 6,3 ± 0,6 3,8 ± 0,5 Ao comparar estes parâmetros plasmáticos entre os grupos, verificou-se diferenças8 estatisticamente significantes. O grupo controle apresentou níveis mais elevados tanto para9 proteínas totais (p=0,0006) quanto para albumina plasmática (p=0,0001), conforme10 evidenciado nas Figuras 7 e 8.11 Tabela 2. Valores médios de proteínas totais e albumina das amostras de plasma das gestantes com pré-eclâmpsia e controles. *Diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p<0,05)
  52. 52. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 50 Figura 7. Concentração de proteínas totais plasmática no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia (PE) e no grupo de gestantes normotensas (C). Figura 8. Concentração de albumina plasmática no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia (PE) e no grupo de gestantes normotensas (C). p=0,0006 p=0,0001
  53. 53. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 51 5.4. Avaliação do perfil protéico plasmático As eletroforeses em fitas de acetato de celulose das amostras de plasma não1 apresentaram alterações visuais relevantes entre os grupos, conforme verificado no2 Apêndice E. Analisamos as frações albumina e α1-globulinas conjuntamente devido ao fato3 de não ter havido separação efetiva destas frações.4 A análise densitométrica permitiu a estimativa dos percentis de cada fração protéica5 plasmática e o cálculo de suas concentrações absolutas com base na concentração de6 proteínas totais plasmáticas de cada paciente, verificadas no Apêndice F. Os valores7 médios para os percentis e para as concentrações das frações protéicas de ambos os grupos8 são mostrados nas Tabelas 3 e 4.9 Frações protéicas plasmáticas (%) Albumina e α1* α2* β γ Pré-eclâmpsia 53,0 ± 3,8 13,8 ± 3,1 16,6 ± 2,0 16,7 ± 3,1 Controle 56,4 ± 3,3 11,4 ± 1,7 15,6 ± 2,2 16,6 ± 2,4 Frações protéicas plasmáticas (g/dL) Albumina e α1* α2 β* γ* Pré- eclâmpsia 2,72 ± 0,59 0,69 ± 0,18 0,84 ± 0,15 0,85 ± 0,2 Controle 3,59 ± 0,44 0,73 ± 0,18 0,98 ± 0,11 1,05 ± 0,19 Tabela 3. Valores médios de percentis estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas. Tabela 4. Concentrações médias estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas. *Diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p<0,05) *Diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p<0,05)
  54. 54. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 52 Ao compararmos os percentis entre os grupos, verificamos que houve diferença1 significativa apenas na fração de albumina-α1-globulinas (p=0,0231) e de α2-globulinas2 (p=0,032) (Figura 9), sendo que o grupo de pré-eclâmpsia apresentou percentis mais baixos3 para albumina-α1-globulinas e mais elevados para α2-globulinas. Os percentis médios das4 demais frações protéicas plasmáticas não diferiram significativamente entre os grupos5 (Figura 9).6 Ao compararmos as concentrações absolutas entre os grupos, verificamos que7 houve diferença significativa nas frações albumina-α1-globulinas (p=0,0008), β-globulinas8 (p=0,0016) e γ-globulinas (p=0,019) (Figura 10), sendo que o grupo controle manteve9 níveis mais elevados das três frações. As demais frações protéicas plasmáticas não10 diferiram significativamente entre os grupos de pacientes (Figura 10).11
  55. 55. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 53 Figura 9. Percentis das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas (PE) e gestantes normotensas (C). Em A, albumina e α1-globulinas, em B, α2-globulinas, em C, β-globulinas e em D, γ-globulinas. p=0,5470 C A p=0,0248 p=0,032 B D p=0,9563
  56. 56. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 54 p=0,0005 A p=0,36 B p=0,0016 C p=0,019 D Figura 10. Concentrações das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas (PE) e gestantes normotensas (C). Em A, albumina e α1-globulinas, em B, α2-globulinas, em C, β-globulinas e em D, γ-globulinas.
  57. 57. Resultados Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 55 5.5. Correlação entre proteínas totais no plasma e na urina Não houve correlação entre as concentrações de proteínas totais no plasma e na1 urina das pacientes com pré-eclâmpsia (p=0,71) (Figura 11).2 Figura 11. Correlação entre as concentrações de proteínas totais na urina e no plasma de gestantes com pré-eclâmpsia.
  58. 58. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 56 6. DISCUSSÃO A pré-eclâmpsia é uma complicação que pode ocorrer na segunda metade da1 gestação, durante o parto ou logo após ele, caracterizada por hipertensão, quantidades2 anormais de proteínas na urina, e outros distúrbios sistêmicos. É uma condição3 potencialmente letal para a mãe, o feto ou ambos, inclusive nos países desenvolvidos,4 apesar de ser mais raro (REDMAN e SARGENT, 2005). A pré-eclâmpsia não pode ser5 prevenida, tendo como fatores de risco: gestação prévia complicada por pré-eclâmpsia,6 história familiar de pré-eclâmpsia, primiparidade, obesidade, gestações múltiplas e doenças7 crônicas, tais como hipertensão e diabetes (DUCKITT e HARRINGTON, 2005).8 Entre as pacientes participantes do nosso estudo, verificamos uma diferença9 significativa na idade materna entre os grupos com pré-eclâmpsia e sem a doença, sendo as10 gestantes saudáveis as que se mantiveram em uma média de idade mais alta (27,4 ± 4,911 anos versus 21,1 ± 5,8 anos). Estudos já demonstraram que mulheres nos extremos de12 idade são mais susceptíveis à pré-eclâmpsia (LYELL, LAMBERT-MESSERLIAN e13 GIUDICE, 2003). Sibai, em 1990, relatou que mulheres abaixo de 21 anos ou acima de 3514 apresentam um maior risco para a doença. Apesar da média de idade do grupo de pacientes15 com pré-eclâmpsia do nosso estudo ter sido de 21,1 anos, 71,4% destas gestantes16 apresentavam menos de 21 anos no momento do estudo, enquanto que no grupo controle17 todas as pacientes tinham idade superior a esta.18 Em nossos resultados, a frequência de primigestas foi maior no grupo de pré-19 eclâmpsia (64,3% versus 27,3%) e diversos estudos já relataram uma associação entre20 primiparidade e susceptibilidade à pré-eclâmpsia (LYELL, LAMBERT-MESSERLIAN e21 GIUDICE, 2003; REDMAN e SARGENT, 2005; IRMINGER-FINGER, JASTROW e22
  59. 59. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 57 IRION, 2008). De acordo com Chesley (1984), aproximadamente três quartos das1 mulheres com pré-eclâmpsia estão em sua primeira gestação.2 A média de idade gestacional entre os grupos diferiu-se de forma significativa,3 sendo que no grupo com pré-eclâmpsia esta média (31,0 ± 2,1 semanas) apresentou-se4 mais baixa que no grupo controle (34,0 ± 2,3 semanas). A idade gestacional das pacientes5 com pré-eclâmpsia não reflete o tempo de doença, pois o diagnóstico pode ser realizado6 durante uma consulta de rotina pré-natal ou quando a paciente procura o serviço de saúde7 devido a algum sintoma, sendo então compreensível, a média de idade gestacional mais8 baixa no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia.9 Os dados a respeito da pressão arterial e proteinúria de 24 horas das pacientes nos10 mostram diferenças estatísticas altamente significantes entre os grupos, com médias mais11 elevadas destes parâmetros entre as gestantes com pré-eclâmpsia, o que evidencia que o12 quadro clínico das pacientes estava bem caracterizado.13 As eletroforeses das amostras de urina de 24 horas de todas as pacientes incluídas14 no estudo foram analisadas visualmente e verificou-se nítidas diferenças nos padrões15 protéicos urinários entre os grupos de gestantes. Além disso, verificamos diferenças16 relevantes entre os padrões protéicos presentes nas amostras de urina de pacientes pré-17 eclâmpticas e na amostra de urina de um paciente com proteinúria do tipo glomerular18 (dado não mostrado). Verificamos também que algumas bandas apresentaram constância19 entre as amostras dos grupos de pacientes.20 Analisando as eletroforeses das amostras de urina de 24 horas, verificamos que21 diversas bandas são comuns entre as gestantes com pré-eclâmpsia e as gestantes controles,22 mas diferem do ponto de vista quantitativo, sendo que no grupo de pré-eclâmpticas estas23 bandas são mais abundantes. Este resultado poderia complementar a conclusão obtida por24
  60. 60. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 58 Redman e Sargent (2003) de que a pré-eclâmpsia seria apenas a exacerbação de alterações1 que ocorrem em gestações normais, com sobreposição de diversas características.2 Entretanto, algumas bandas, como as de massas moleculares de cerca de 40 kDa e de 303 kDa, foram frequentes entre as gestantes com pré-eclâmpsia, e não foram observadas em4 nenhuma amostra controle. Da mesma forma que algumas bandas apresentaram frequência5 mais elevada entre as gestantes controles do que entre as pré-eclâmpticas, instigando à6 busca de marcadores urinários para a doença.7 Raidt et al. (1984), em um estudo baseado em SDS-PAGE de amostras urinárias,8 biópsia renal e seguimento clínico de pacientes com hipertensão gestacional e gestantes9 controles, relatou que o perfil apresentado por diversas pacientes com hipertensão10 gestacional era característico de proteinúria glomerular. A pré-eclâmpsia tem sido11 considerada como uma das principais causas de doença glomerular no mundo todo (revisto12 por HLADUNEWICH, 2005), e de acordo com Kasiske e Keane (2000), a albumina13 constitui de 60 a 90% da proteinúria total quando há dano glomerular. Entretanto no nosso14 estudo não verificamos, através dos perfis eletroforéticos das amostras de 24 horas das15 gestantes, características que nos levassem a supor uma causa puramente glomerular para a16 proteinúria de todas as gestantes com pré-eclâmpsia. Justificado pelas nítidas divergências17 entre a maioria dos perfis protéicos das amostras de gestantes pré-eclâmpticas e o perfil18 característico de proteinúria glomerular (dado não mostrado) e, também, pela baixa19 frequência de perfis demonstrando uma proteinúria tipicamente glomerular. Em nossos20 resultados, apesar de termos encontrado em 8 das 10 pacientes com pré-eclâmpsia uma21 banda protéica com massa molecular similar à massa da albumina, em apenas 2 delas esta22 banda era a mais intensa e abundante do perfil, havendo, nos outros casos, prevalência de23 outros tipos de proteínas. Sendo assim, nossos resultados concordam com a sugestão feita24
  61. 61. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 59 por Shinagawa e Saitoh, em 1983, de que o termo “proteinúria” seja mais adequado que1 “albuminúria” para descrever esta condição da pré-eclâmpsia.2 Em outros estudos, em que se realizou dosagem de albumina urinária por métodos3 como ELISA, aglutinação do látex, imunoturbidimetria e radioimunoensaio, relatou-se um4 aumento na concentração urinária de albumina entre as pacientes com pré-eclâmpsia,5 quando comparadas a gestantes sem intercorrências (LI, CHU e ZHOU, 1995; HAYASHI6 et al., 2002; POON et al., 2008; BROWN et al., 1994). Mostrou-se, inclusive, aumento de7 excreção de albumina na pré-eclâmpsia grave mesmo na ausência de aumento da excreção8 de proteínas totais (BROWN et al., 1994).9 A SDS-PAGE tem se mostrado uma técnica bastante útil para a diferenciação entre10 a proteinúria glomerular e tubular em gestantes hipertensas (BOESKEN, KOPF e11 SCHOLLMEYER, 1973; PESCE, BOREISHA e POLLAK, 1972), entretanto, poucos12 estudos reportam os padrões protéicos urinários fisiológicos em gestações normais13 (NESSELHUT et al., 1989; KUROKAWA et al., 1985). Nesselhut et al. (1989)14 descreveram o perfil das gestantes controles com presença de albumina, de proteínas de15 massas moleculares diversas entre 20 e 200 kDa e de uma banda de 105 kDa de forte16 intensidade, muito semelhante aos perfis de indivíduos de ambos os sexos e não-gestantes.17 Entre os perfis das gestantes controles do nosso estudo, verificamos a presença de bandas18 protéicas que se distribuíram por toda a extensão do gel, identificadas com massas19 moleculares de 19 a 95 kDa e em 33,3% destas amostras, observamos a presença de bandas20 com massas moleculares similares à albumina.21 Yamamoto et al. (1992) relataram que em urinas de pacientes com pré-eclâmpsia22 grave foi observado a presença de um perfil protéico misto, com bandas protéicas de23 massas moleculares variadas, o que concorda com nossos resultados, já que encontramos24 perfis diversos e bandas com massas moleculares que variaram de 19 a 90 kDa. Através de25
  62. 62. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 60 imunoblot, Yamamoto et al. (1992) identificaram a presença de grandes quantidade de1 imunoglobulina G (IgG) (150 kDa), imunoglobulina M (IgM) (970 kDa), fibronectina (4402 kDa) e β2-microglobulina (11,8 kDa) nas amostras de urina das gestantes pré-eclâmpticas.3 Outras proteínas também já foram identificadas em amostras de urina de gestantes com4 pré-eclâmpsia como: albumina (69 kDa), transferrina (79,5 kDa), inibidor de inter-α-5 tripsina (180 kDa), α1-antitripsina (500 kDa), imunoglobulina A (IgA) (150-350 kDa), α2-6 HS-glicoproteína (39 kDa), α1-glicoproteína ácida (44 kDa), Gc-globulina (58 kDa), α1-7 anti-quimiotripsina (52 kDa), hemopexina (70 kDa), ceruloplasmina (132 kDa), pré-8 albumina (54 kDa), haptoglobulina (65 kDa), anti-trombina III (58 kDa) e α2-9 macroglobulina (725 kDa) (SHINAGAWA e SAITOH, 1983). Comparando-se as massas10 moleculares destas proteínas com as massas moleculares das bandas identificadas nos11 perfis eletroforéticos das amostras de urina de 24 horas das pacientes pré-eclâmpticas do12 nosso estudo, verificamos que entre as bandas mais frequentes entre estas amostras estão:13 uma de cerca de 66 kDa, similar à massa molecular da albumina, uma de 56 kDa, que se14 aproxima das massas moleculares da pré-albumina, da anti-trombina III, da α1-anti-15 quimiotripsina e da Gc-globulina e uma de 45 kDa, que se aproxima da massa molecular16 da α1-glicoproteína ácida, todas relatadas por Shinagawa e Saitoh (1983). Entretanto, como17 não realizamos métodos para identificação das proteínas contidas nas bandas protéicas, não18 podemos afirmar que se tratam das mesmas proteínas.19 A baixa frequência de visualização da banda de massa molecular similar à albumina20 entre as amostras de 24 horas das gestantes com pré-eclâmpsia como a principal banda do21 perfil (20%) foi um dado que nos surpreendeu, pois a disfunção glomerular é considerada22 uma característica da doença e é a principal causa de proteinúria patológica (STONE,23 1989). Observamos ainda que parece não haver relação entre a intensidade da proteinúria e24 aparecimento de albuminúria, já que as pacientes com níveis mais altos de proteinúria de25
  63. 63. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 61 24 horas não foram as mesmas que demonstraram predomínio de albumina em seu perfil1 eletroforético. Frente a esses dados, supomos que a proteinúria da pré-eclâmpsia não possa2 ser atribuída à excreção significativa de albumina, o que, de qualquer forma, acabaria por3 levar a uma diminuição plasmática desta proteína no grupo de gestantes com a doença em4 relação ao grupo controle, conforme observado em nossos resultados.5 A grande maioria dos estudos encontrados na literatura, a respeito da excreção6 protéica total urinária na pré-eclâmpsia ou na hipertensão induzida pela gestação, foi7 realizada com amostras de urina de 24 horas, ao passo de que o nosso trabalho utilizou-se8 tanto de amostras colhidas durante 24 horas quanto de amostras colhidas durante 6 horas9 com conservante. A coleta de urina de 24 horas deve apresentar resultados mais fidedignos10 a respeito da real proteinúria das gestantes, devido às variações circadianas na excreção de11 proteínas, especialmente a albumina (KOOPMAN et al., 1985; DOUMA, et al., 1995). Por12 outro lado, a amostra colhida com conservante durante um período de 6 horas apresenta a13 vantagem de impedir o crescimento de agentes microbianos, cujos metabolismos, além da14 presença do microorganismo por si só, poderiam interferir no perfil protéico das amostras15 de urina.16 Um estudo realizado na Índia (SONI et al., 2009) concluiu que a proteinúria17 analisada em amostras de urina de 2 e 4 horas poderiam ser usadas para uma avaliação18 inicial da pré-eclâmpsia, visto que análises estatísticas não mostraram diferenças19 significantes nas médias de excreção protéica nem entre amostras de 2 horas versus20 amostras de 24 horas e nem entre amostras de 4 horas versus amostras de 24 horas. Sendo21 assim, nossas amostras também podem ser consideradas adequadas para analisar a22 proteinúria da pré-eclâmpsia, tanto no aspecto quantitativo, quanto no aspecto qualitativo,23 já que estudos eletroforéticos da urina de pacientes pré-eclâmpticas já foram realizados24 inclusive em amostras randômicas (LI, CHU e ZHOU, 1995).25
  64. 64. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 62 Nossos resultados demonstraram diferenças interessantes entre os perfis observados1 nas amostras coletadas com e sem conservante (HCl). Observamos nos perfis das amostras2 com HCl das gestantes, uma prevalência de bandas de baixa massa molecular e, inclusive,3 o desaparecimento de bandas, como ocorreu com a maioria das amostras de gestantes4 controles. Além disso, peptídeos de massa molecular muito baixa foram visualizados com5 mais frequência nas amostras com HCl. Estas observações nos levam a supor que tenha6 ocorrido hidrólise de proteínas nestas amostras, o que tornaria a análise do perfil protéico7 urinário equivocada. A presença de bandas de baixas massas moleculares constantes entre8 as amostras de gestantes com pré-eclâmpsia nos leva a propor que esteja ocorrendo9 hidrólise enzimática nestas amostras, e formação de fragmentos comuns, o que torna10 necessário a presença de substrato(s) e enzima(s) comuns nas amostras. Uma provável11 enzima que poderia estar atuando neste caso seria a uropepsina, uma protease ácida da12 classe das aspartil-proteases, já identificada em urina de gestantes com pré-eclâmpsia13 (RESENDE et al., 2008). Estando a urina acidificada, a enzima encontraria as condições14 ideais para sua ação, clivando seu(s) substrato(s) e liberando os fragmentos de proteínas,15 identificados nos perfis eletroforéticos em grande quantidade. A ausência de bandas16 protéicas em um perfil eletroforético obtido a partir de uma amostra sem conservante de17 gestante com pré-eclâmpsia e o consequente aparecimento de bandas no perfil proveniente18 da amostra com HCl da mesma gestante, nos sugeriu a possibilidade do(s) substrato(s) ser19 alguma(s) proteína(s) de alta massa molecular (acima de 100 kDa) que não pôde(puderam)20 ser(em) visualizada(s) em nossa metodologia. Entretanto, a confirmação a respeito da ação21 desta enzima nas amostras de urina de gestantes com pré-eclâmpsia e a identificação do(s)22 seu(s) substrato(s) só será possível com estudos utilizando inibidores enzimáticos e ensaios23 específicos para o(s) substrato(s).24
  65. 65. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 63 Em nossos resultados, verificamos uma significativa diferença entre os valores de1 proteínas totais e albumina no plasma de pacientes com pré-eclâmpsia e gestantes2 normotensas, sendo as primeiras, possuidoras de níveis mais baixos de ambos os3 parâmetros. Verificamos que as médias de proteínas totais e albumina plasmáticas do4 grupo controle se mantiveram dentro dos limites de valores de referência definidos para as5 populações, enquanto que as médias do grupo de pacientes com pré-eclâmpsia6 classificariam este grupo como hipoproteinêmicas e hipoalbuminêmicas. Nossos achados7 concordam em parte com a literatura, pois diversos outros estudos relatam a redução dos8 níveis plasmáticos de proteínas totais e/ou albumina em diferentes fases da gestação9 normal ou pré-eclâmptica, enquanto só notamos esta redução entre as gestantes com pré-10 eclâmpsia.11 Bagga e Dutt Mullick, em 1966, encontraram níveis reduzidos de proteínas e12 albumina plasmáticas em gestantes controles e níveis ainda menores em pacientes com pré-13 eclâmpsia. Freis e Kenny (1948) encontraram aumento de volume sanguíneo circulante e14 de quantidade absoluta de proteínas plasmáticas na gestação normal, enquanto que na pré-15 eclâmpsia não houve variação de volume plasmático e a quantidade de proteínas16 plasmáticas foi até menor do que a encontrada em amostras de mulheres não-gestantes.17 Blekta et al. (1970) demonstraram que tanto a quantidade absoluta quanto a concentração18 de proteínas séricas estava significativamente reduzida em pacientes com pré-eclâmpsia e19 que esta redução era devido a reduções tanto de globulinas quanto de albumina séricas,20 enquanto que na gestação normal ocorria diminuição de albumina e aumento de globulinas,21 com manutenção dos níveis de proteínas séricas. Este mesmo estudo relata a diminuição de22 volume circulante na pré-eclâmpsia. Brod (1962) utilizou-se destes achados para explicar23 os desenvolvimentos dos sintomas da pré-eclâmpsia.24
  66. 66. Discussão Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009 64 O organismo se protege de uma hipovolemia através da retenção de sal e1 água. O edema pode então aparecer concomitante ao aumento da pressão2 arterial e proteinúria. Este estado leva a respostas protetoras3 hemodinâmicas e humorais que levam ao quadro clínico da toxemia da4 gestação (BROD, 1962).5 A diminuição de proteínas totais e albumina plasmáticas encontrada entre as6 gestantes com pré-eclâmpsia do nosso estudo era esperada devido às perdas protéicas7 urinárias a que estas pacientes estão expostas, e não poderiam ser atribuídas ao edema8 gestacional, já que gestantes com pré-eclâmpsia apresentam diminuição do volume9 sanguíneo circulante. Entretanto, a diminuição de albumina plasmática foi bastante10 significativa, enquanto a visualização de bandas intensas de massas moleculares similares à11 albumina não foi tão expressiva no nosso grupo de estudo. Este fato, aliado a ausência de12 correlação observada entre a proteinúria de 24 horas e a proteinemia, nos leva a supor que13 proteínas originadas da unidade feto-placentária na pré-eclâmpsia possam estar14 contribuindo significativamente para a elevada proteinúria nesta condição.15 MacGillivray e Tovey (1957), por meio de eletroforese de proteínas séricas em16 papel corada por azocarmine B, relataram um decréscimo da fração albumina do início17 para o sétimo mês de gestação normal, a partir do qual os valores não se alteraram mais.18 As frações de α1-globulinas, α2-globulinas e β-globulinas se elevaram gradualmente19 durante a gestação normal. Já a fração de γ-globulinas apresentou um discreto aumento20 durante os três primeiros meses de gestação e reduziu-se à metade durante as últimas seis21 semanas. Ainda neste estudo, verificou-se que na pré-eclâmpsia, a fração albumina22 continua a decair durante os últimos três meses de gestação, ao invés de se estabilizar23 como na gestação sem intercorrências, e que a fração de γ-globulinas se mostrou diminuída24 em relação aos valores obtidos para as gestantes normotensas. Em nossos resultados,25 observamos uma diminuição significativa da fração albumina-α1-globulinas tanto em26

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