MUTAÇÕES EMMICROORGANISMOSTipos, isolamento, caracterização e a natureza davariação
Como é os microorganismos evoluem?   Alterações na sequência dos genes podem ocorrer e resultar em    alterações no fenót...
Principais mecanismos que geram variabilidade,contribuindo assim para a evolução   Variações no Genótipo:     Mutações  ...
Obtenção de mutantes   Como estudar um ser vivo geneticamente?   Tipo original (tipo selvagem) x mutantes   Importante ...
Clones em microorganimso   Origem de uma única célula   Divisão celulares   Progressão geométrica   Muitas células = c...
Mutações em microorganismos   Mutações letais, quando expressas, resultam na morte do    microrganismo.   Mutações condi...
Mutações Bioquímicas   Mutações bioquímicas são mutações que causam uma    mudança na bioquímica da célula, causando    f...
Tipos de mutantes   Mutantes auxotróficos   Mutantes incapazes de utilizar certas fontes de carbono e nitrogenio   Muta...
Mutantes auxotróficos   Crescimento em meio definido ou mínimo – sais    minerais, fonte de carbono, aminoácidos, vitamin...
Mutantes deficiente por sintesesConvenciona-se três letras minúsculas:                             Lisina – lys¯          ...
Auxotróficos parciais   “leaky” = sintetiza somente uma pequena quantidade do componente essencial, parte é ´vazada` para ...
Mutantes incapazes de utilizar certasfontes de carbono e nitrogênio   Bacterias e fungos capazes de utilizar varias    fo...
Mutante que não usa lactose Mutantes lac- em E. coli apresentam  coloração rosada em meio com eosina e  azul em meio de m...
Mutantes incapazes de utilizar fontesde nitrogenio   Utilizados em fungos   Incapazes de utilizar nitrato ou amonia   A...
 Obtenção   e caracterização dos mutantes nãoutilizadores de nitrato (mutantes nit)                    6 mm              ...
Mutantes nit               Nit1   Meio básico + NaNO3               nit2   Meio básico + hipoxantina               nit3   ...
Mutantes resistentes a agentes inibidores   Em bactérias, os mutantes resistentes a antibióticos e    quimioterápicos são...
Inibidores de crescimento demicroorganismos   Em fungos, são bem conhecidos os mutantes    resistentes a acertos fungicid...
Mutantes morfológicos   Mutações morfológicas modificam a morfologia    (forma) da colônia ou da célula do microrganismo....
Mutantes “minute” ou “petite   Colônias menores que a linhagem original,    largamente empregados em fungos, leveduras   ...
Topotecano (TPT) é capaz de induzir petite e se          acumula na mitocôndria.  (A) Teste da gota para testar o efeito d...
Mutantes com colônias com bordos enrrugados                              Experimento sobre a                              ...
Mutantes com baixo crescimento de hifas enão formação de conídios                     Fenótipo de um Neurospora crassa rho...
Fenótipos úteis em Genética Bacteriana   Sabe-se que, mudanças na estrutura das proteínas    podem levar a mudanças nas s...
Serratia marcescens                                                                             WTFotografia de estirpes d...
Staphylococcus aureus                       Formação de biofilmes por estirpes de                        S. aureus em pol...
Aspergillus nidulans                      Fungo com conídios de coloração verde,                       os mutantes amarel...
Mutantes para produção de substâncias liberadaspelas células.   Bacillus, Streptomyces, brevibacterium e fungos do genero...
Mutantes para locomoção e comportamento   Ausência de flagelos:   Mutantes mot¯: perdem a capacidade de locomoção   Mut...
Mutantes para patogenicidade   Isolamento de microorganismos não patogênicos    obtidos de formas patogênicas            ...
Reversões   Mutação reversa pode ocasionar a volta das    características originais.   Pode ser verdadeira ou ocasionada...
Detecção, Seleção e Isolamento de mutantes   Gerar e isolar microrganismos mutantes revela-se muito    importante, pois o...
Como estudar os microrganismos?   Primeiro têm de ser detectados isolados eficientemente dos    organismos wild type e de...
Caracterizar mutantes   Quando se pretende obter mutantes de um determinado microrganismo, é    necessário a partida, ou ...
Técnicas para isolamento e caracterização de                  mutantes
Como se procede então para isolar os mutantes lisina     auxotróficos?   Geram-se os mutantes tratando a cultura com um a...
Isolamento de mutantes auxotróficos. (Lisina negativos)Nas culturas em especial, alguns gêneros de enterobactérias.
Isolamentos dos mutante   A retirada dos mutantes é efetuada após a sua detecção, pode apresentar    alguns problemas prá...
Resistência aos Bacteriófagos   Figura 1 – Resistência aos    Bacteriófagos.   Bacteriófagos (Fagos) são    vírus que li...
Resistência a antibióticos   Considerando o exemplo    de bactérias wild type    sensíveis ao antibiótico    estreptomici...
Seleção de mutantes resistentes aantibiótico   Coloca-se em contato com o antibiótico (estreptomicina neste caso) a    cu...
Quebra de resistência   Esta técnica é importante na Quimioterapia, uma vez que, como é sabido,    não se deve abusar dos...
Teste de flutuação    As mutações ocorrem     independentemente ou     dependentemente do     agente seletor?    Será qu...
1a experiência   Tem-se um caldo de    bactérias do qual se    tiram alíquotas iguais e    semeiam-se em vários    meios ...
2a experiência:   Em vários tubos coloca-se a    bactéria, onde a replicação    de cada um é    independente;   Fazem-se...
   Não se obtém o mesmo resultado em todas as placas ou seja, o resultado    é diferente em cada tubo. Isto mostra então ...
Avaliações de mutações   Taxa de mutação é o número de mutações de um fenótipo    particular que ocorreram numa cultura e...
Informações sobre a taxa de mutações   O conceito de taxa de mutação é muito importante    porque nos dá a probabilidade ...
Mutantes em vírus
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Mutações em microorganismos

  1. 1. MUTAÇÕES EMMICROORGANISMOSTipos, isolamento, caracterização e a natureza davariação
  2. 2. Como é os microorganismos evoluem? Alterações na sequência dos genes podem ocorrer e resultar em alterações no fenótipo. Importantes para gerar variabilidade e contribuir, assim, para o processo de evolução dos microrganismos. Evolução requer variabilidade Requerendo a evolução variabilidade, face a uma mudança brusca no meio ambiente, as bactérias e outros microrganismos possuem um conjunto de mecanismos geradores de alterações genéticas que conduzem a variantes, fornecendo-lhes assim a possibilidade de ultrapassar situações que ponham em risco a sua sobrevivência. As variantes com características que melhor se adaptam à nova situação são selecionadas e sobrevivem em detrimento das menos adaptadas.
  3. 3. Principais mecanismos que geram variabilidade,contribuindo assim para a evolução Variações no Genótipo:  Mutações  Recombinações  Aquisição de novos genes  Rearranjos intramoleculares (translocação e inversão) Variações no Fenótipo (características visíveis):  Indução enzimática  As recombinações do DNA e as mutações são os mecanismos que mais contribuem para a evolução.
  4. 4. Obtenção de mutantes Como estudar um ser vivo geneticamente? Tipo original (tipo selvagem) x mutantes Importante para estudo genético em microorganismos Diferentes tipos com caracteristicas hereditárias distintas e bem definidas
  5. 5. Clones em microorganimso Origem de uma única célula Divisão celulares Progressão geométrica Muitas células = colônias em meio de cultura sólidos; Colônia visível a olho nu = clone = grupo de células todas iguais geneticamente
  6. 6. Mutações em microorganismos Mutações letais, quando expressas, resultam na morte do microrganismo. Mutações condicionadas, são as que são expressas apenas em determinadas condições ambientais, por exemplo, mutações de letalidade condicionada na E. Coli, podem ser expressas a altas temperaturas, mas não a baixas temperaturas; esse hipotético mutante (termossensível) crescerá então normalmente a baixas temperaturas, mas a altas temperaturas poderá morrer. U tilizam-se mutantes termossensíveis quando se quer atingir um gene que é essencial à integridade e viabilidade da célula. Ex. gene da DNA polimerase.
  7. 7. Mutações Bioquímicas Mutações bioquímicas são mutações que causam uma mudança na bioquímica da célula, causando frequentemente deficiência ou mesmo inativando uma via biossintética da bactéria, ou seja, é eliminada a capacidade da bactéria sintetizar uma macromolécula essencial, como aminoácidos ou nucleótidos. Os microrganismos que sofrem esta alteração são chamados mutantes auxotróficos, dizem-se auxotróficos para a molécula que não conseguem sintetizar. Um outro tipo de mutantes bioquímicos são os chamados mutantes resistentes. Estes organismos sofrem mutações e adquirem resistência a agentes antimicrobianos, como antibióticos.
  8. 8. Tipos de mutantes Mutantes auxotróficos Mutantes incapazes de utilizar certas fontes de carbono e nitrogenio Mutantes resistentes a agentes inibidores Mutantes morfológicos Mutantes para produção de substancias liberadas pelas celulas Mutantes para locomoção e comportamento Mutantes para patogenicidade Mutantes mais sensíveis a agentes inibidores Reversões Mutantes em vírus
  9. 9. Mutantes auxotróficos Crescimento em meio definido ou mínimo – sais minerais, fonte de carbono, aminoácidos, vitaminas e outros componentes de natureza conhecida. Crescimento em meio completo – peptona, extrato de levedura, caseína hidrolisada, extrato de carne Microrganismos que não crescem em meio mínimo, em oposição à linhagem original, chamada de prototrófica. Se um mutante auxotrófico não for capaz de crescer em meio mínimo, mas crescer em meio completo ou mesmo em meio mínimo adicionado de um aminoácido, por exemplo, triptofano, esse mutante é chamado de triptofano deficiente nutricional para a síntese de triptofano, triptofano – ou trp- .
  10. 10. Mutantes deficiente por sintesesConvenciona-se três letras minúsculas: Lisina – lys¯ Prolina – pro ¯ Biotina - bio ¯ Vários genes para mesma síntese: 1 letra maiúscula é adicionada Ex. 3 genes que afetam a síntese de triptofano: trpA, trpB e trpC Vários mutantes do mesmo gene: designados por números: trpA1, trpA2, trpA3, etc.Essa nomenclatura é convencionada para todos os tipos de mutantes em microorganimos
  11. 11. Auxotróficos parciais “leaky” = sintetiza somente uma pequena quantidade do componente essencial, parte é ´vazada` para fora da célula. Estratégia para a geração de clones condicionalmente gene alvo. CDNAs Ts mutante de um gene de interesse pode ser projetado com base nas informações dos mutantes ts fermento, se disponível. Seguindo o protocolo padrão para gerar ts células mutantes, cada cDNA mutação é introduzido por uma integração orientada para o locus endógenas do gene em células DT40 heterozigotos (+/-) mutante. As células resultantes devem ser homozigotos (-/-) células mutantes e
  12. 12. Mutantes incapazes de utilizar certasfontes de carbono e nitrogênio Bacterias e fungos capazes de utilizar varias fontes de carbono: glicose, galactose, lactose, maltose, acetato e outras. Mutantes para fontes de C em bactérias têm a vantagem de serem distinguíveis morfologicamente em certos meios especiais com adição de corantes. Mutantes são incapazes de usar galactose (gal¯) tipo selvagem (gal+)
  13. 13. Mutante que não usa lactose Mutantes lac- em E. coli apresentam coloração rosada em meio com eosina e azul em meio de metileno, enquanto os selvagens são colônias de coloração vermelho-brilhante Tipo seilvagem : lac+
  14. 14. Mutantes incapazes de utilizar fontesde nitrogenio Utilizados em fungos Incapazes de utilizar nitrato ou amonia A classificação dos mutantes, de acordo com a via de utilização do nitrato, em nit1, nit2, nit3 e nitM, será realizada de acordo com BROOKER et al. (1991) Hipoxantina Xantina Ácido úrico Purina desidrogenase nit M Co-fator Molibdênio Nitrato Nitrito redutase redutase Nitrato Nitrito Amônio nit1 nit3Via de utilização de nitrato no metabolismo de fungos
  15. 15.  Obtenção e caracterização dos mutantes nãoutilizadores de nitrato (mutantes nit) 6 mm Extrato de malte 3,5% + KClO3 1,5% 10 Isolados com diascrescimento ralo, com pouco ou nenhum micélio aéreo Meio mínimo Mutantes nit
  16. 16. Mutantes nit Nit1 Meio básico + NaNO3 nit2 Meio básico + hipoxantina nit3 Meio básico + NaNO2 nitM Meio básico + tartarato de amômio
  17. 17. Mutantes resistentes a agentes inibidores Em bactérias, os mutantes resistentes a antibióticos e quimioterápicos são largamente utilizados não só para estudos básicos de genética como pela sua importância aplicada. Mutantes resistentes:  Estreptomicina – strR  Tetraciclina: tetR  Cloranfenicol: chlR
  18. 18. Inibidores de crescimento demicroorganismos Em fungos, são bem conhecidos os mutantes resistentes a acertos fungicidas:  Benomil: benR  Cloronel: chlR  Corantes como acriflavina AcrR Os inibidores ainda incluem outros componentes :  Metais pesados (mercúrio, arsênio, cobre, zinco, cálcio, etc.)  Agentes biológicos (vírus)  Agentes físicos (luz UV, temperaturas elevadas)
  19. 19. Mutantes morfológicos Mutações morfológicas modificam a morfologia (forma) da colônia ou da célula do microrganismo. Aqueles que apresentam modificações:  Coloração  Tamanho  Formato da colônia  Formação de estruturas  Formação de conídeos
  20. 20. Mutantes “minute” ou “petite Colônias menores que a linhagem original, largamente empregados em fungos, leveduras Eletromicrografia de Células leveduras. (A) estrutura das mitocôndrias normais. (B) mitocôndria em um mutante petite. Em mutantes petite, todos os produtos de genes mitocondriais codificadas estão faltando, a organela construida inteiramente a partir de proteínas do núcleo-codificado.
  21. 21. Topotecano (TPT) é capaz de induzir petite e se acumula na mitocôndria. (A) Teste da gota para testar o efeito do tratamento TPT sobre o crescimento do fermento. O indicador foram expressas sob controle do promotor GAL1 e as células foram cultivadas em placas com ou sem 20 mg / ml TPT. Note-se que petite induzida em galactose pela expressão de mt125Top1-103 sob o controle do GAL1p cresceu mais lentamente do que petite induzida em galactose pela expressão de mt125Top1-103 sob o controle do MET25p. (B) Localização intracelular da CPT e TPT. Usando as configurações para a detecção de DAPI, a TPT intracelular e localização CPT foi determinada pela sua auto-fluorescência. pRWE129 foi expressa para GFP-local do núcleo. CPT é principalmente enriquecido em vacúolos, enquanto TPT a coloração de fluorescência (seta branca). Barra branca representa 5 mM. de la Loza M C D , Wellinger R E Nucl. Acids Res. 2009;37:e26-e26© 2009 The Author(s)
  22. 22. Mutantes com colônias com bordos enrrugados Experimento sobre a transformação pneumocócica: (a) ratos são resistentes ao tipo de bactéria Streptococcus pneumoniae R, (b) são mortos por injeção com virulência de bactérias do tipo S; (c) com injeção de calor bactérias virulentas mortas não matam ratos, mas (d) Tipe S bactérias são misturados com bactérias não-virulenta Tipo R, eles têm a capacidade de transformar não- virulenta Tipo R em virulenta Tipo S .
  23. 23. Mutantes com baixo crescimento de hifas enão formação de conídios Fenótipo de um Neurospora crassa rho-4 mutante. (A) Hifas de N. crassa do tipo selvagem e conídios após 5 dias de crescimento em placas. (B) Um mutante rho-4 na forma de micélio fino com manchas de vazamento de citoplasma (setas pretas) e sem conídios. (C) Hifas N. crassa do tipo selvagem corados com calcofluor (1 mg / ml), mostram coloração brilhante nas paredes e septos celulares. Uma seta aponta para um conídio. (D) rho-4 mutante hifas coradas com calcofluor (1 mg / ml) da parede celular mostram coloração, mas não septadas e sem coloração. rho-4 mutantes sofrem fusão celular. Área marcada de evento recente fusão celular. Coloração de calcofluor não apresenta um septo, mas aNeurospora crassa parede celular das hifas intervir de fusão, que é degradada após a conclusão da fusão de hifas. Bar, 10 mM.
  24. 24. Fenótipos úteis em Genética Bacteriana Sabe-se que, mudanças na estrutura das proteínas podem levar a mudanças nas suas funções que, por sua vez, podem alterar o fenótipo de um organismo (as suas propriedades visíveis). Aspecto das colônias. Esta figura evidencia como o aspecto das colônias da mesma bactéria é diferente consoante se trate de um WT (wild type) – organismo não mutante – ou de um organismo mutante. Wild type (WT) é a forma prevalente de um gene e o seu fenótipo associado
  25. 25. Serratia marcescens WTFotografia de estirpes do tipo selvagem de Serratia marcescens ATCC 274, Serratia sp. ATCC39006 e Serratia sp diferente. ATCC 39006 mutantes biossintéticos cultivados em meio peptonaglicerol. As cepas são indicados (a partir do topo, em sentido horário), Serratia 39006 mutantebiossintético, Serratia 39006 tipo selvagem, três Serratia 39006 mutantes biossintéticas e S.marcescens ATCC 274 do tipo selvagem. As bordas pigmentadas dos três mutantes biossintéticosna metade inferior do resultado da placa de ágar a partir de onde ocorre a alimentação cruzada deintermediários.
  26. 26. Staphylococcus aureus  Formação de biofilmes por estirpes de S. aureus em poliestireno: (C) Em pocinhos de vidro (D) Biofilme bacteriano formado durante o cultivo de noite em placas de poliestireno foram coradas com safranina. (E) Poços: 1) S. aureus ATCC 35556 do tipo selvagem, 2) icaADBC mutante; 3) dltA mutante; 4) dltA mutante complementada com pRBdlt1 plasmídeo, 5) S. TM300 carnosus.
  27. 27. Aspergillus nidulans  Fungo com conídios de coloração verde, os mutantes amarelos, brancos  Aspergillus nidulans oferece um excelente sistema experimental.  É fácil de cultivar em laboratório, gera mutantes haplóides e podem ser facilmente isoladas e tem um bom sistema genético.  Uma variedade de ferramentas moleculares, incluindo um sistema de transformação nos permitem manipular sequências in vitro e então re-introduzir o DNA no organismo.  A seqüência do genoma de Aspergillus nidulans já está disponível.
  28. 28. Mutantes para produção de substâncias liberadaspelas células. Bacillus, Streptomyces, brevibacterium e fungos do genero Penicilliume Aspergillus: liberam antibióticos, ácidos orgânicos, enzimas , aminoácidos, vitaminase outras usbtanciuas Mutantes incapazes de liberar ou que liberam em excesso certos componentes (ácidos orgânicos, enzimas, amino-ácidos, vitaminas). São de grande importância par estudos genéticos e para a indústria. Ex. Penicillium – produção de penicilina
  29. 29. Mutantes para locomoção e comportamento Ausência de flagelos: Mutantes mot¯: perdem a capacidade de locomoção Mutantes che¯: têm comportamento alterado em comparação com o tipo original em relação à quimiotaxia
  30. 30. Mutantes para patogenicidade Isolamento de microorganismos não patogênicos obtidos de formas patogênicas Mutantes de Meganasporte grisea I-22 cultivados em meio completo
  31. 31. Reversões Mutação reversa pode ocasionar a volta das características originais. Pode ser verdadeira ou ocasionada por supressão dentro do gene mutado (intragênica) ou por outro gene que não o mutado (intergênica) Reversão de auxotrofia para prototrofia é usada para detecção de substâncias mutagênicas, pratico para estimar o numero dessas reversões. Utiliza-se o meio mínimo que não possibilita o surgimento de mutante original, mas permite o aparecimento e contagem de colônias reversas.
  32. 32. Detecção, Seleção e Isolamento de mutantes Gerar e isolar microrganismos mutantes revela-se muito importante, pois o seu uso e estudo no laboratório e na indústria é de grande interesse. As bactérias são excelentes modelos para estudar os mecanismos moleculares subjacentes ao aparecimento de mutações, devido ao fato de serem organismos haplóides, isto é, possuem uma única cópia de cada um dos genes que formam o seu genoma. Assim, qualquer mutação adquirida é imediatamente expressa na geração descendente conduzindo diretamente a uma alteração fenotípica, ou seja, uma mudança de uma característica observável numa espécie, como já foi referido.
  33. 33. Como estudar os microrganismos? Primeiro têm de ser detectados isolados eficientemente dos organismos wild type e de outros mutantes sem interesse. Passa-se agora à descrição de algumas técnicas usadas na sua detecção, seleção e isolamento. Como o código genético é degenerado, há mutações que não modificam as propriedades de uma estirpe bacteriana. A detecção de mutantes numa população Mutantes auxotróficos Fenótipo condicionado à presença ou ausência da macromolécula não sintetizada Mutantes resistentes a agentes antimicrobianos
  34. 34. Caracterizar mutantes Quando se pretende obter mutantes de um determinado microrganismo, é necessário a partida, ou seja, as suas características normais – as características do wild type – para assim se reconhecer o fenótipo alterado. Os mutantes podem ser detectados muitas vezes de uma forma direta – através da observação visual da cor da colônia, ou de uma forma mais complexa, como é o caso da técnica utilizada para detectar e isolar mutantes auxotróficos. A técnica deve permite a distinção entre mutantes e linhagem wild type, tendo por base a sua capacidade de crescimento na ausência de um produto final biossintético particular. Os mutantes lisina auxotróficos, como não têm a capacidade de sintetizar o aminoácido lisina, não vão crescer num meio mínimo sem lisina (meio sem quantidades adequadas de lisina) mas vão crescer num meio mínimo com este aminoácido.
  35. 35. Técnicas para isolamento e caracterização de mutantes
  36. 36. Como se procede então para isolar os mutantes lisina auxotróficos? Geram-se os mutantes tratando a cultura com um agente mutagênico; Semeia-se a cultura contendo mutantes auxotróficos e Wild Type numa placa de Petri com meio completo e deixa-se incubar; Depois das colônias se desenvolverem, coloca-se um veludo estéril na superfície da placa de Petri e transferem-se as bactérias para duas placas de petri diferentes. As bactérias são semeadas para as duas placas na mesma posição que se encontravam na primeira placa; Após incubação, verifica-se que há colônias que cresceram no meio mínimo com lisina, mas que não cresceram no meio mínimo sem lisina – são lisina negativas (mutantes); Determina-se então a localização destes mutantes (Lys -) e são depois isolados.
  37. 37. Isolamento de mutantes auxotróficos. (Lisina negativos)Nas culturas em especial, alguns gêneros de enterobactérias.
  38. 38. Isolamentos dos mutante A retirada dos mutantes é efetuada após a sua detecção, pode apresentar alguns problemas práticos, pelo que se deve recorrer a eficientes sistemas de seleção, que utilizam fatores ambientais para separar os mutantes da linhagem wild type. As técnicas utilizadas para efetuar a seleção envolvem condições de incubação que favorecem o crescimento do mutante, enquanto que o wild type não é favorecido. Muitas vezes, as células wild type são susceptíveis ao ataque de vírus (Figura 1), ou ao tratamento com antibióticos (Figura 2), sendo assim possível fazer crescer a bactéria na presença de um desses agentes e observar microrganismos sobreviventes.
  39. 39. Resistência aos Bacteriófagos Figura 1 – Resistência aos Bacteriófagos. Bacteriófagos (Fagos) são vírus que lisam e portanto, matam as bactérias. Ao expor-se uma cultura de E.Coli num meio contendo o agente seletor Fago T2 e incubando-se depois, verifica-se que resistem 4 clones - são os mutantes resistentes a esse fago
  40. 40. Resistência a antibióticos Considerando o exemplo de bactérias wild type sensíveis ao antibiótico estreptomicina: Como se procede para selecionar mutantes resistentes a esse antibiótico? Figura 2. Mutantes resistentes ao antibiótico estreptomicina.
  41. 41. Seleção de mutantes resistentes aantibiótico Coloca-se em contato com o antibiótico (estreptomicina neste caso) a cultura de microrganismos contendo mutantes resistentes ao mesmo; morrem todas as colônias exceto as resistentes ao antibiótico; Faz-se a seleção positiva dos mutantes bacterianos com um agente de seleção – estreptomicina - ou seja, põe-se de novo em contacto o antibiótico com os mutantes resistentes ao mesmo e incuba-se. Apenas se desenvolve a linhagem de microrganismos que não reverteu à mutação, ou seja, apenas se desenvolvem os microrganismos que continuaram com a mutação após contacto sucessivo com o antibiótico – são os resistentes ao mesmo. Assim, selecionam-se os mutantes resistentes em detrimento dos mutantes que, nalguma geração, reverteram à mutação, ou seja, nalguma geração deixaram de a ter.
  42. 42. Quebra de resistência Esta técnica é importante na Quimioterapia, uma vez que, como é sabido, não se deve abusar dos antibióticos pois, como demonstrado nesta técnica, ao expor-se o antibiótico aos microrganismos de um modo sucessivo, vão- se eliminando os que não são resistentes, ficando apenas os que resistem, que poderão então crescer e multiplicar-se de uma forma mais eficaz. Também pode ser utilizada esta técnica de seleção no isolamento de reversíveis à lisina auxotróficos (Lys -). Coloca-se uma população destes microrganismos num meio sem lisina e deixa-se incubar. Examinando depois o desenvolvimento e formação das colônias, verifica-se que apenas as células que reverteram à mutação cresceram, pois têm a capacidade de sintetizar lisina.
  43. 43. Teste de flutuação As mutações ocorrem independentemente ou dependentemente do agente seletor? Será que é necessário o contacto com o agente seletor para surgir a mutação, ou esta surge espontaneamente, acontece? Para se saberem estas respostas realiza-se o teste de flutuação. Figura 5 – Teste de Flutuação: 1a experiência (controle) e 2a experiência
  44. 44. 1a experiência Tem-se um caldo de bactérias do qual se tiram alíquotas iguais e semeiam-se em vários meios iguais com o mesmo agente seletor (Fago T1); Incuba-se. Após incubação, observa-se que houve formação de colônias, mas a sua quantidade é constante ao longo de todas as placas, ou seja, houve pouca flutuação no número de colônias.
  45. 45. 2a experiência: Em vários tubos coloca-se a bactéria, onde a replicação de cada um é independente; Fazem-se espalhamento dos tubos onde existe 109 bactérias para placas com fago T1; Incuba-se. Após incubação obtém-se uma flutuação do número de colônias resistentes nas placas.
  46. 46.  Não se obtém o mesmo resultado em todas as placas ou seja, o resultado é diferente em cada tubo. Isto mostra então que as mutações ocorrem independentemente do contacto com o agente seletor (neste caso o fago T1). Não é por não haver contacto com o agente seletor que deixa de haver mutações de resistência. Então, a que se deve a variação? As mutações ocorrem espontaneamente, quando ocorre a replicação do DNA durante o crescimento. São variáveis, aleatórias, não precisam do agente seletor, é uma questão de probabilidade. Neste caso, ocorreram várias mutações de 103 bact./mL para 109 bact./mL. Figura 6 – Teste de flutuação. Quanto mais cedo ocorre a mutação, maior será o número de mutantes nas Caixas.
  47. 47. Avaliações de mutações Taxa de mutação é o número de mutações de um fenótipo particular que ocorreram numa cultura em crescimento, dividido pelo número total de gerações celulares (divisões) no mesmo intervalo de tempo. TM = número de bactérias resistentes (mutantes) /Número de gerações celulares a – taxa de mutação m – número médio de mutações que ocorreram na cultura N – número total de divisões celulares
  48. 48. Informações sobre a taxa de mutações O conceito de taxa de mutação é muito importante porque nos dá a probabilidade de ocorrência de mutações. Perceber esta probabilidade é também muito importante para detectar bactérias resistentes a um antibiótico e prever, assim, a sua eficácia. Se a probabilidade é baixa, o antibiótico é bom, se por outro lado, a probabilidade de ocorrência de mutações é elevada, o antibiótico não é muito bom. Conclui-se assim que a taxa de mutação é muito útil para se avaliar a performance de um futuro antibiótico.
  49. 49. Mutantes em vírus

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