Meio de cultura em microorganismos

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Meio de cultura em microorganismos

  1. 1. Exigências nutricionais e meio de cultura em microorganismos Prof. Dra. Adriana Dantas UERGS, Bento Gonçalves, RS
  2. 2. Nutrição e crescimentoNutrição microbiana Componentes necessários às células Meios de cultura Condições ambientaisCrescimento populacional Velocidade de crescimento Tempo de geração Medidas do crescimento
  3. 3. Proliferação de Microrganismos As bactérias são microrganismos unicelulares com uma estrutura muito simples, o que lhes permite replicarem- se muito rapidamente caso encontrem nutrientes, temperatura, pH, humidade e concentração de oxigénio favoráveis. Alguns casos, apenas 20 minutos são suficientes para que o número de bactérias duplique, o que significa que um número inicial de 10 bactérias num determinado local em condições favoráveis, se multiplicará de tal modo que se terão aproximadamente 16000000 bactérias ao fim de 8 horas.
  4. 4. Proliferação exponencial Esta proliferação exponencial aliada à sua resistência faz com que as bactérias se espalhem muito rapidamente, estando presentes em todos os locais, não só à nosso volta, no meio ambiente, como também no nosso próprio corpo: nas nossas mãos, nariz, boca, tracto gastrointestinal, etc.
  5. 5. Artificial x Natural
  6. 6. Meios de cultura Até cerca de 1880, os microrganismos eram cultivados em meios líquidos Robert Koch e a sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras), separando-as de espécies contaminantes. Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural.
  7. 7. Condições favoráveis de crescimento Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, pressão osmótica, humidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, micro aeróbia ou anaeróbia), entre outras...
  8. 8. Consistência dos meios Sólidos, quando contêm agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %); Semi-sólidos, quando a quantidade de ágar ou gelatina é de 0,075 a 0,5 %, obtendo assim uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade; Líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para activação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, entre outros.
  9. 9. Procedência dos constituintes Podem ser naturais ou complexos:  Ingredientes com composição química não definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.), de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura); Artificiais, sintéticos ou ainda quimicamente definidos:  Composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e os seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, azoto, vitaminas, energia, sais minerais, entre outros, quando são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. Meios de cultura básicos  São os que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigência em especial; Meios de cultura complexos:  Cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos, como meio de infusão de cérebro e coração, ágar sumo de tomate, ágar sangue, etc.
  10. 10. Funções dos meios de cultura Meios de pré-enriquecimento:  Permitem a dessensibilização de microrganismos injuriados, i.e., para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada. Meios de enriquecimento:  Proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. Meios Diferenciais:  Contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), Ágar MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, Ágar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).
  11. 11. Funções dos meios de cultura Seletivos são os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. A maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colónias (sólidos) dos microrganismos. Meios de triagem são os meios que avaliam determinadas actividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos. Identificação, prestam-se para a realização de provas bioquímicas e  verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação. Dosagem, são empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos Contagem, são empregados para a determinação quantitativa da população microbiana. Estocagem ou manutenção são utilizados para conservação de microrganismos no laboratório, i.e., garantem a viabilidade de microrganismos.
  12. 12. Meios de proliferação naturais No nosso dia-a-dia convivemos com bactérias, dormimos com bactérias, comemos bactérias, e não conseguimos viver sem elas. Elas estão por todo o lado e reproduzem-se em todo o lado, apenas querem um local com condições propícias. Por isso, há que ter muito cuidado nas nossas casas, pois apresentam-se como os melhores locais para a proliferação das bactérias, tendo em conta que nelas podem encontrar alimento, calor, humidade.
  13. 13. Nutrição de microrganismos Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados. Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas, enquanto outros são tão exigentes quanto o homem. Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório: - Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais. - Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas. Ex: Mycobacterium leprae (causador da hanseníase) precisa de hospedeiro para ser cultivado.
  14. 14. Meios de cultura adequados Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais. Os elementos químicos principais para o crescimento das células são denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P). O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano. Com exceção para CO2, os compostos orgânicos são os que contém carbono
  15. 15. Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade. - Tem papel importante na estrutura e metabolismo.Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas. - Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas C N H P, S, K, Na ... célula Matéria seca Água
  16. 16. Componentes necessários a célula Fonte de carbono: - Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): carboidratos lipídeos proteínas - Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgânicos. Fonte de Nitrogênio: - É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %. (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.) A capacidade de algumas moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos) bactérias em utilizar o moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2) nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida de todos os seres.
  17. 17.  Hidrogênio:- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos. (água, sais e gases) Função: Manutenção do pH Formação de ligações de H entre moléculas Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração• Oxigênio: - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos)- É obtido a partir das proteínas e gorduras. Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.
  18. 18. Outros macronutrientes:  P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP  S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas  K – Atividade de enzimas  Mg – Estabilidade dos ribossomos  Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos  Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal.  Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
  19. 19. Outros componentes Metais em quantidades muito pequenas (traços) necessários na composição de um meio de cultura: Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação) - Nem sempre sua adição é necessária - Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura podem apresentar deficiências desses elementos.Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte o N2 para NH3 durante a FBN.
  20. 20. Água e aditivos Água:- Componente absolutamente indispensável (com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas) No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.Aditivos: Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH: Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos EDTA, ácido cítrico, polifosfatos. Inibidores Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico
  21. 21. Outros aditivos Tampões - Carbonato de cálcio - Fosfatos - Proteínas (peptona)Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores. Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilaseAntiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma  Remoção de células, perda do produto, contaminação  Redução do volume do meio álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
  22. 22. Meios de cultura Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.Não existe um meio de cultura universal, masExistem vários tipos meios para diversas finalidadesPara obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessárioo conhecimento de suas exigências nutricionais, para que osnutrientes sejam fornecidos de forma e proporçãoadequada. Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água) Classes Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite, solo e rúmem de bovino)
  23. 23. Meios de cultura
  24. 24. Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as necessidades nutricionaisAté 1880 os microrganismos eramcultivados em meios líquidos.Robert Koch introduziu os meiosde cultura sólidos, os quaispermitiram o estudo de espéciesisoladas (culturas puras). Meio de cultura solidificado com 1,5 % de ágar. Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.
  25. 25. Meios de cultura Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades. Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex. Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey
  26. 26. Microplacas com diferentesmeios de cultura paraidentificação deenterobactérias.
  27. 27. Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de cultura. As bactérias podem ser autotróficas ou heterotróficas.Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas
  28. 28. Meios de cultura para fungos • Todos os fungos são heterotróficos Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja. Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias. Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
  29. 29. Como determinar a composição inicial?Passo 1: utilizar dados da composição elementar Composição elementar média (% do peso seco)Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessáriosde 1,3 g (13%) de Nou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N) Elemento Bactéria FungoObs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem Carbono 52 51 introduzir o excesso de um deles. hidrogênio 7 7 Nitrogênio 13 8,5Com relação ao carbono considerar também fração para Fósforo 2,5 0,4-4,5energia e manutenção (heterotróficos) Enxofre 0,6 0,1-0,5Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de Potássio 2,5 0,2-2,5glicose (40% de C) Sódio 0,75 0,02-0,5Fração para energia e manutenção (45%): Cálcio 0,55 0,1-1,4YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose Magnésio 0,25 0,1-0,5 Cloro 0,5 -Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1 Ferro 0,1 0,15 Relação C:N média 4:1 6:1e assim por diante. Relação C:N:P:S 85:23:4:1Passo 2: otimização
  30. 30. Condições ambientais (fatores abióticos)  Temperatura  Oxigênio  pH  Pressão osmótica, atmosférica, hidrostática  Radiação eletromagnética
  31. 31. Temperatura Grupos• Psicrófilos – temperatura ótima abaixo de 15 o C, suscetíveis de crescer a 0 oC.• Mesófilos – temperatura ótima 20o - 40 oC, maioria dos patógenos humanos.• Termófilos – temperatura ótima acima de 45 o C.
  32. 32. Efeito do oxigênio no crescimento microbiano Meio gelatinosoDurante as reações de com indicadorredução do O2 são redox:formados vários Rosa quando oxidado Incolor quando reduzidointermediários tóxicos.Ex: H2O2, OH°, O2-Os microrganismosaeróbios e facultativosutilizam enzimas como acatalase para destruir asformas tóxicas Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante
  33. 33. Sistema para cultivo de anaeróbios
  34. 34. Sistema para cultivo de aeróbiosEquipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura
  35. 35. pH Ao contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá, Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto em todas as condições de pH. Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos. Necessário a adição de um tampão ao meio.
  36. 36. Pressão osmótica Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se.Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.

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