Extração de nucleotideos

29.603 visualizações

Publicada em

Publicada em: Educação
1 comentário
8 gostaram
Estatísticas
Notas
  • Achei otimo esse slide, estava com muita dificuldade em encontrar material de qualidade para meu trabalho acadêmico. Parabens e obrigada!
       Responder 
    Tem certeza que deseja  Sim  Não
    Insira sua mensagem aqui
Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
29.603
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
4
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
370
Comentários
1
Gostaram
8
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide
  • Where can you find DNA? In the cells of any living thing. The only cells that do not have DNA are red blood cells. In the extraction procedure we use a blender to separate the cells from one another. The cell is surrounded by a sack (cell membrane). Where is DNA located in the cell? In the nucleus. (There is also some DNA in the mitochondria.) Notice in the diagram that the nucleus of the cell is also surrounded by a membrane sack.
  • Extração de nucleotideos

    1. 1. EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE DNA Dra. Adriana Dantas UERGS Bento Gonçalves
    2. 2. Objetivos Mobilizar conhecimentos adquiridos sobre Estruturas celulares e função de DNA e de enzimas Familiarizar os alunos com os procedimentos envolvidos na extração de DNA; Exemplificar que a extração de DNA é o primeiro passo de muitas aplicações biotecnológicas:  PCR  Clonagem-transferênciade genes  Tipagem molecular  Marcadores moleculares
    3. 3. • O que é DNA?•Aonde se localiza o DNA numa célula ?•Do que são formadas as membranas celulares ?• Qual a estrutura do DNA?
    4. 4. • DNA determina as características de todos os seres vivos.• DNA é composto de um alfabeto de 4-letras (nucleotídeo/ molécula) referido como A, T, C, and G.• A ordem do alfabeto determina as características do organismos, como as letras de nosso alfabeto determinam as palavras.• Cada célula do corpo humano contém >3 BILHÕES de letras.
    5. 5. CloroplastoNúcleo(DNA) Mitocôndria Vacúolo Citoplasma Parede celular Membrana celular
    6. 6. A única diferença entreos organismos vivos é aquantidade e ordem doalfabeto de DNA.
    7. 7. Componentes do DNADNA é um polímero, sendo os monômeros os nucleotídeos, chamado então de polinucleotídeo. Cada nucleotídeo consiste de um açúcar de 5 carbonos(desoxiribose), uma base nitrogenada ligada ao açúcar e um grupo fosfato. Quatro nucleotídeos, que diferem somente na base nitrogenada. A = adenina G = guanina C = citosina T = timina
    8. 8. Definições  A  combinação  de  uma  desoxirribose  e  uma  base constitue um desoxinucleosídeo. A combinação de um fosfato, de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleotídeo.
    9. 9. Adenina e Guanina são Purinas.As Purinas são as maiores bases. 9 átomos cada http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF
    10. 10. Timina e Citosina são chamadas Pirimidinas. 6 átomos cada http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF
    11. 11. A Hidroxila do carbono-3 dapentose do primeironucleotídeo se liga ao grupofosfato ligado à hidroxila docarbono-5 da pentose do segundonucleotídeo através deuma ligação fosfodiéster (ligaçãocovalente) http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/genetica/dna/Image27.gif
    12. 12. Com base na estrutura de dupla hélice do DNA e nascaracterísticas de hidrofobicidade das moléculas, aestrutura do DNA fica da seguinte forma:O grupo fosfato e o açúcar (parte hidrofílica) –estão localizados na parte externa da molécula. As bases nitrogenadas (parte hidrofóbica) –estão localizadas na parte interna da molécula.
    13. 13. Primeiro rascunho do FrancisCrick da estrutura do DNA http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/c/c8/FirstSketchOfDNADoubleHelix.jpg
    14. 14. Pontos importantes•Por convenção, um polinucleotídeo é lido da extremidade5´para a 3´.•As orientações das duas fitas é antipararela: suasdireções 5 - 3 são opostas.•As duas fitas são mantidas unidas pela energia demuitas pontes de hidrogênio (A=T e G=C) e interaçõeshidrofóbicas.
    15. 15. Extração e Quantificação Ácidos Nucleicos
    16. 16. DNA Eletroforese  Extração  Purificação  Separação
    17. 17. Extração O DNA pode ser extraído de diferentes materiais, desde fósseis e amostras herbarizadas a tecidos frescos: raízes, folhas, sementes, embriões, endosperma, pólen, cultura de calos ou de células em suspensão O objetivo de qualquer protocolo de extração consiste em obter DNA de alta qualidade, em quantidade, de forma rápida e eficiente. Os protocolos de extração devem evitar a degradação do DNA pelas DNAses. Eliminar os polissacarídeos que inibem a ação de enzimas Eliminar as substâncias fenólicas ou outros compostos secundários que podem danificar o DNA.
    18. 18. Isolamento e purificaçao Para o isolamento e purificação de ácidos nucléicos, é necessário separá-los efetivamente dos outros constituintes celulares. No caso especial dos ácidos nucléicos, também é fundamental manter a integridade das moléculas, que devem permanecer inalteradas durante o procedimento de extração, pois as informações contidas tanto no DNA quanto no RNA dependem da sua sequência. Existem vários métodos descritos na literatura, e a escolha depende do balanço entre a praticidade, qualidade requerida a finalidade de uso do ácido nucléico
    19. 19. DNA na minha comida???
    20. 20. DNA na minha comida??? CURIOSIDADE:Cada célula contém cerca de 3 metros de DNA. Refeição = 55.000.000 células ou Cerca de 150.000 km de DNA.
    21. 21. Processo de extração  O processo de extração de DNA vegetal consta inicialmente, do rompimento da parede celular e membranas celulares, liberando a molécula de DNA.  O rompimento da parede celular e membranas celulares de grande quantidade de material pode ser feito por maceração após o congelamento do tecido em nitrogênio líquido ou diretamente no tampão de extração em tubo de microcentrífuga, quando a quantidade de tecido é pequena.  Todavia, junto à molécula de DNA, moléculas de proteínas, polissacarídeos, RNA e outras são extraídas.  Para que o DNA possa ser considerado de boa qualidade, essas moléculas devem ser eliminadas, utilizando tampões de extração, que são compostos por elementos que as eliminam da amostra de DNA.
    22. 22. Ruptura dos tecidos
    23. 23. Detergentes CTAB, Sarcosil e SDS são utilizados para auxiliar na liberação de componentes celulares por lise das membranas celulares. Juntamente com NaCl, esses detergentes ajudam na precipitação do DNA ao final do processo e reduzem a contaminação da amostra com polissacarídeos.
    24. 24. Rompimento da membrana
    25. 25. Ação das DNAses Para manter o pH em um valor que impeça a ação das nucleases que degradem o DNA, utiliza-se um tampão específico (geralmente Tris-Cl), para manter o pH em torno de 8,0. A adição de EDTA inibe a ação das DNAses, pois esse composto é um quelante de cátions bivalentes, como o Mg+2 e o Ca+2, que são cofatores das enzimas. A desnaturação de proteínas e eliminação de polifenóis oxidantes da molécula de DNA é feita pela adição de 2-mercaptoetanol e polivinilpirrolidona (PVP) ou polivinilpolipirrolidona (PVPP),pois possuem efeito antioxidante, assim como a eliminação dos polissacarídeos pela adição de PVP, PVPP ou soroalbumina bovina (BSA) e o RNA é eliminado pela adição de RNAse.
    26. 26. Recuperação dos ácidos nucléicos A adição de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (CIA) promove a extração de lipídios, proteínas e polissacarídeos, que são dissolvidos nesse solvente orgânico (inferior), enquanto o DNA permanece na fase aquosa (superior), fases estas separadas após centrifugação. Essas duas fases são então separadas por centrifugação e o sobrenadante contendo o DNA é retirado do tubo. Alguns protocolos incorporam ainda fenol ou proteases (proteinase K) para facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina. Recuperação dos ácidos nucleicos totais por precipitação em álcool (isopropanol e/ou etanol) desidratam a molécula de DNA e na presença de NaCl permitem sua precipitação ao final do processo, formando um sedimento visível na fase líquida do tubo.
    27. 27. Precipitação do DNA A eliminação do RNA ë obtida por digestão com RNAse, ou separação de RNA e DNA por solubilidade diferencial em sais. Sob condições de alta concentração de sais (ex.: 7,5 M de Acetato de sódio), DNA e os RNA pequenos permanecem em solução, enquanto que o RNA (> que 60 bases) precipita. Os ácidos nucléicos são poliânicos solúveis em água. Os sais de sódio e potássio de ácidos nucleicos são insolúveis na maioria dos solventes orgânicos, incluindo numa mistura de etanol e água, mas eles não são desnaturados por solventes orgânicos. O detergente catiônico CTAB solubiliza membranas celulares, e dependendo da concentração de NaCl no tampão, CTAB forma um complexo com o DNA, e é utilizado para precipitar DNA seletivamente.
    28. 28. Análise do DNA Para a análise de DNA, com a utilização da digestão por enzimas de restrição (ex. RFLP, AFLP), existe a necessidade obter-se DNA de boa qualidade. Contaminantes (polifenóis, polissacarídeos, etc.) interferem na atividade dessas enzimas, reduzindo a eficiência das mesmas. A contaminação por polissacarídeos consiste na principal contaminação afetando a pureza do DNA extraído de plantas. Esses carbohidratos podem inibir a atividade de várias enzimas usadas em manipulações biológicas de DNA, tais como ligases, polimerases e enzimas de restrição. A maioria dos métodos de extração empregados não separam eficientemente o DNA dos polissacarídeos provavelmente devido a similaridade estrutural entre esses dois tipos de polímeros. A contaminação de polissacarídeos depende da espécie, tecido, condições fisiológicas da planta. Certas espécies “produzem” um DNA muito contaminado por polissacarídeo, tomando difícil a ressuspensão do pellet. (DNA precipitado).
    29. 29. Quantificação de DNA Quantificação DNA (gel agarose 0,8%)20 50 100
    30. 30. Protocolos A maior parte dos protocolos de extração disponíveis derivam basicamente do método descrito por Dellaporta et al. (1983) e aqueles que utilizam CTAB (brometo de hexadeciltetrametilamônio) (Doyle e Doyle, 1987, 1990) onde o DNA é solúvel sob altas concentrações de sal. Para maiores detalhes consultar Brasileiro e Carneiro (1998).
    31. 31. PROTOCOLO CTAB (DOYLE E DOYLE,1987) Este protocolo mais utilizado em espécies vegetais, pois possibilita a extração de DNA a partir de pequenas amostras de tecido, não exige preparação prévia do tecido e é adaptável a vários tipos de materiais. O CTAB é um detergente catiônico (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) que solubiliza as membranas celulares, formando um complexo com o DNA, que facilita uma posterior precipitação diferencial desse complexo
    32. 32.  Pode-se extrair o DNA, preparando-se uma solução de banana tratada com sal, água destilada, e shampoo (detergente) . O detergente quebra a membrana celular, dissolvendo os lipídeos (moléculas de gordura) e proteínas da célula, além de quebrar as ligações que mantêm a membrana celular intacta. Introdução
    33. 33.  O detergente forma então um complexo com os lípídeos e proteínas, permitindo que sejam filtrados para fora da solução com um filtro de café. O DNA das células ficam no filtrado. O sal permite que o DNA precipite com a adição de álcool (íons Mg e Cl). Introdução
    34. 34.  Em um liquidificador, misturar uma banana com um copo de água destilada (250ml). Extração de DNA
    35. 35.  Bater por for 15-20 segundos, até a solução virar uma mistura. Extração de DNA
    36. 36.  Num copinho de café, fazer uma solução contendo 1 colher de chá de shampoo ou detergente e 2 pitadas de sal de cozinha.Extração de DNA
    37. 37.  Adicionar 20 ml (4 colheres de chá) de água destilada. Dissolver o sal e o shampoo/ detergente mexendo devagar para evitar fazer espuma.Extração de DNA
    38. 38.  À solução do passo 2, adicionar 3 colheres cheias da solução de banana do passo 1. Misturar a solução com a colher por 5-10 minutos.Extração de DNA
    39. 39.  Enquanto uma pessoa mistura a solução de banana, outra coloca um pedaço (cone) de filtro de café dentro do outro copo de plástico. Dobre as abas do filtro para fora para que não encoste no fundo do copo.Extração de DNA
    40. 40.  Filtre a mistura no filtro e deixe a solução drenar por vários minutos até ter cerca de 5 ml (cobrindo o fundo do copo) do filtrado para testar.Extração de DNA
    41. 41.  Pegar um tudo com álcool gelado. Para melhores resultados, o álcool deve estar o mais gelado possível.Extração de DNA
    42. 42.  Encher a pipeta de plástico com a solução de banana.Extração de DNA
    43. 43.  Adicionar a solução ao álcool. Deixe descansar por 2 a 3 minutos sem mexer o tubo. É muito importante não agitar o tubo.Extração de DNA
    44. 44.  Você pode assistir o precitado branco de DNA na camada de álcool. O DNA tem uma aparência de um muco esbranquiçado e como se fosse uma nuvem.Extração de DNA
    45. 45. Extração com Fenol Fenol é usado para desnaturar e remover proteínas de soluções que contêm ácidos nucléicos. 1. Homogeneização do material (nitrogênio líquido ou banho de gelo seco e etanol), com tampão. 2. Adicionar o mesmo volume de fenol à amostra, colocar no vortex ou agitar. 3. Centrifugar para separar 2 fases (de fenol embaixo e aquosa acima). Transferir fase aquosa para novo tubo. Repetir 2 e 3.
    46. 46. Pontos Importantes O fenol é usado para remover proteínas e outros contaminantes da solução aquosa do DNA. • O clorofórmio ajuda desnaturar proteínas e a remover o fenol residual. • O álcool isoamílico é geralmente adicionado ao clorofórmio para reduzir espuma.
    47. 47. Extração simples Material + Tampão de Lise: Tris, EDTA, SDS, NaCl e proteinase K. • Digestão a 37 ºC (células, 2-3 hs) ou 55 ºC (tecido, overnight) sob agitação. • Precipitação com isopropanol • Resgatar o precipitado (nuvem) e ressupender em água ou TE.
    48. 48. Extração de DNA plasmidial •Plasmídeos: pedaços de DNA extracromossômicos, covalentemente fechados;•Codificam genes de resistência àantibióticos ou metais pesados, produçãode pigmentos, de virulência, etc.Também possuem genes para sua própria replicação • 1-20 kb x ~ 5000 kb em E. coli, sendo fácil a separação dos DNAs
    49. 49. Extração de DNAplasmidial •Depois de crescer o plasmídeo recombinante em bactéria, temos que nos livrar dos outros componentes das células bacterianas (membranas, parede celular, ribossomos, RNA e DNA cromossomal•Centrifugar cultura e ressuspender pellet emtampão Tris EDTA (que liga divalentemente acátions Ca e Mg e com isto ajuda adesestabilizar a membrana de E. coli).• Então adicionamos uma solução com NaOH(que aumenta o pH e desnatura o DNAcromossomal e não o do plasmídeo) e SDS (quevai solubilizar as membranas e causar a lise 5 min – 6000 rpmdas células).
    50. 50. Extração de DNA plasmidial •Decrescemos o pH com acetato de potássio (o DNA cromossomal não poderá a voltar a sua estrutura original e sairá de solução) • Ao centrifugarmos, o DNA cromossomal precipitará e o plasmidial ficará em solução junto com proteínas e sais. • Purificar o DNA com extração com fenol e clorofórmio, seguido de precipitação com etanol ou com uma membrana de sílica gel (o DNA vai se ligar à membrana sob altas concentrações de sais e se “desligar” com a redução da concentração de sais, ao contrário das proteínas e sais que passarão direto. Após lavagem com etanol para lavar os sais o DNA pode ser eluído •O DNA pode se livrar do RNA pelo tratamento com RNAse A
    51. 51. Extração de RNA• Envolve desnaturante forte para quebrar células, solubilizar seus componentes e desnaturar RNAses endógenas simultaneamente.• Envolve lise das células, desnaturação das proteínas da membrana celular e depois os passos normais como em DNA Solução Desnaturante:  Tiocianato de Guanidina 4M  Citrato de Sódio 25 mM  0.5% Sarcosil  Beta-Mercaptoetanol 0.1 M
    52. 52. Extração de RNA em tecidofoliar liofilizado A extração de RNA realizada em tecido foliar liofilizado Utiliza-se 300 mg de tecido liofilizado. O tampão de extração: 100 mM Tris HCl pH 7,5; 10 mM EDTA pH 8,0; 1 M NaCl; 0,1% SDS ; 1% β Mercaptoetanol (colocado na hora de uso) e 1 mM ATA (solúvel em etanol). Completado o volume com água ultra-pura DEPC.
    53. 53. Quantificaçao do RNA Espectrofotômetro em leitura de 260-280nm. Corrida em gel de agarose 1,5% com 1µL brometo de etídeo (10 mg/mL) Eletroforese em 200 Volts por ± 15 minutos.
    54. 54. O RNA está INTACTO??? Gel de agarose desnaturante: para desfazer a estrutura secundária do RNA
    55. 55. Revelação da extração deRNA G0 Gp F0 Fp DNA RNA 28S mRNA RNA 18S RNA 5.8S RNA mensageiro (nuvens) Gel de agarose 1,5% com 1 µL brometo de etídeo (10 mg/mL)G0 - Gala sem inóculo; Gp - Gala com inóculo (pool de períodos);F0 - Fuji sem inóculo; Fp - Fuji com inóculo (pool de períodos)
    56. 56. Extração de RNAm• 1,5 a 5% do RNA celular• Usada para RNAm raros, para fazer sondas ou para bibliotecas de cDNA.  Eucariotos: usa-se colunas de celulose e oligo dT ou magnetic beads e oligo dT (uma cadeia sintética de 20-30 timinas)
    57. 57. G0 Gp F0 Fp DNA RNA 28S mRNA RNA 18S RNA 5.8S RNA mensageiro (nuvens)Gel de agarose 1,5% com 1 µL brometo de etídeo (10 mg/mL)G0 - Gala sem inóculo; Gp - Gala com inóculo (pool de períodos);F0 - Fuji sem inóculo; Fp - Fuji com inóculo (pool de períodos)
    58. 58. Quantificação  Mais usada com Espectrofotômetro A260 dá estimativa da concentração  Leitura da absorbância a 260 e 280 nm• OD260 = 1.0, dsDNA = 50 µg/mL; RNA = 40 µg/mL• Desvantagens: interferência com material para extração, inabilidade de diferenciar entre DNA e RNA, sensibilidade: 50-250 ng DNA/ mL • RNA e pH (>7,5): pH ácido afeta a absorção com A260, ajustar com Na2HPO4 (conc. final de1mM)
    59. 59. Tabela 2. Diluições com água DEPC para 2 µg / µL de mRNA para as reações de cDNA RNA total (µg /µL) mRNA (µg/µL) Diluições (µL) [ ] (µg/ 1Amostras µL)Fuji zero 9 6,48 12 0,54Fuji pool (inoc) 14 10.08 18,7 0,54Gala zero 6,2 4,32 8 0,54Gala pool (inoc) 3,12 2,16 4 0,54Tabela 3. Quantificação do RNA total 260 nm 280 nm 260/280 µg / µLAmostrasFuji zero 1,13 0,64 1.76 9Fuji pool (inoc) 1,75 0,96 1,82 14Gala zero 0,78 0,45 1,73 6,2Gala pool 0,39 0,23 1,69 3,12(inoc)Tabela 4. Análise de pureza do RNA (livre de polissacarídeos) 260 nm 280 nm 260/280 ResultadoAmostrasFuji zero 0,66 0,33 2,0 Sem resíduoFuji pool (inoc) 0,37 0,19 1,94 Sem resíduoGala zero 1,03 0,51 2,0 Sem resíduoGala pool 0,68 0,34 2,0 Sem resíduo(inoc)Tabela x. Calculo do RNA total no tubo e do mRNA 40 x µg / µL µg / 40 µL mg mRNA (1,8%)AmostrasFuji zero 40 x 9 360 0,36 6,48 µg / µLFuji pool (inoc) 40 x 14 560 0,56 10,08 µg / µLGala zero 40 x 6,2 248 0,24 4,32 µg / µLGala pool 40 x 3,12 124,8 0,12 2,16 µg / µL(inoc)
    60. 60. Cálculos OD260 x F. D. x 50 (µg/mL) DNA [ ] (µg/µL) = 1000 F.D. = fator de diluição Ex.: 3µl de DNA + 97µl H20; OD260 =0,0157 DNA [ ]= 0,0157 x 33,33 x 50 / 1000 = 26,16 ng/ µl
    61. 61. Pureza DNA: Razão A260/A280 >= 1,75 - 1,80 < 1,75 contaminação com lipídeos ou proteínas RNA: Razão A260/A280 ~ 2,0 < 2,0 contaminação com guanidina (da extração) > 2,0 contaminação com fenol ou clorofórmio
    62. 62. OUTROS MÉTODOS  Fluorímetro: utiliza material fluorescente que se liga ao ácido nucléico sem problemas com proteínas (picoGreen; sondas de cianina). Seletivos para dsDNA. • Vantagem maior é a sensibilidade: 0,5 ng/ mL (100 a 1000 vezes maior que o espectrofotômetro)
    63. 63. OUTROS MÉTODOS Gel de agarose: aplicando-se as amostras de DNA juntamente com padrões de concentração conhecida 100 a 300 ng de plasmídeo
    64. 64. Por meio decorrida juntoa um marcadorde DNA http://www.neb.com/nebecomm/productfiles/778/images/N3231.gif
    65. 65. Ácidos Nucléicos  Estabilidade DNA versus RNA• Nucleases• Cuidados: autoclavagem de materiais e tampões; estocagem (DNA e RNA).• TE (10 mM tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) x nucleases e DEPC x RNAses
    66. 66. Armazenagem de DNA e RNA DNA: 4°C (em TE) ou - 20°C (maior tempo) RNA: manter sempre no gelo quando manipulado e a -70°C (maior tempo)
    67. 67. Pontos Importantes Maioria das nucleases precisam de Mg para atividade, o EDTA ajuda na inativação delas. • RNA é normalmente armazenado em ddH20 que foi previamente tratada com DEPC (0,1%) para inativar as RNAses. • Muitas RNAses sobrevivem à autoclavagem então DEPC deve ser usado também para soluções. • Importante inativar DEPC antes de usar pois pode modificar o RNA e inativar enzimas (RT e quinases) • DEPC é altamente tóxico para humanos !!! • DEPC é incompatível com TRIS !!!
    68. 68. ANIMAÇÃO http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/extraction/
    69. 69. Extração de comida
    70. 70. Extração dos fungos: meio BDA sólido
    71. 71.  Repicagem dos fungos: meio BD líquido
    72. 72.  Liofilização dos fungos:
    73. 73.  Schäfer and Wöstemeyer (1992) e modificada por Junghans et al. (1998) Desestruturação das Ruptura dos membranas celulares Material tecidos 1.5 1.0 0.5 0.1 Ressuspensão Adição de Precipitação dos Precipitação das do Pellet Etanol ácidos nucléicos proteínas e polissacarídeos 1.5 1.5 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.1 0.1 0.1 0.1
    74. 74.  Quantificação do DNA: gel de agarose 0,8%
    75. 75.  Quantificação do DNA extraído: A ηg/μL 50 100 200 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 7 8 8 9 9 10 11 11 12 12 14 14 15 15 16 16 18 18 19 B ηg/μL 20 50 100 200 5 8 9 34 38 1 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13 15 16 17 18 19 24 26 27 29 30 31 32 37 C1 C2 G9 Figura 3. Gel de agarose 0,8% para quantificação do DNA micelial dos isolados de Colletotrichum spp. A – DNA extraído ainda com impurezas; B – DNA extraído limpo e já diluído para a concentração desejada (≈10ηg).
    76. 76.  Amplificação do rDNA: A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36600 pb500 pb400 pb300 pb200 pb100 pb B M 37 38 39 40 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10C1 C2 C3 ― CN Figura 4. A e B – Produto do PCR resultante da utilização dos iniciadores ITS1 e ITS4, em gel de agarose 2% (M – ladder 100 pb e CN – controle600 pb500 pb negativo).400 pb300 pb200 pb100 pb
    77. 77. Quantificaçao em gel deagarose MÉTODO MINIGEL Aplicar DNA - 2 µL Aplicar TC - 3 µL Carregamento em gel de agarose 0,8% Amostras padrão Amostras d e DNA (20; 50; 100; 200 ng /µ L)
    78. 78. COMPARAR A INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA DA AMOSTRAPADRÃO E ESTIMAR A QUANTIDADE DE DNA DA AMOSTRA Amostras padrão Amostras de DNA (50; 100; 200 ng/µL) bandas 50 100 200 1 2 3 4 5 Estimativa ( ng/µL) Amostra 1 300 Amostra 2 50 Amostra 3 50 - 100 Amostra 4 mais de 300 Amostra 5 200
    79. 79. Process Common procedure Chemical •SDS, sarcosyl •CTAB •Proteinase K Cell lysis Enzymatic •Lysozyme •Freezing Mechanic •Sonication •Grinding Organic solvents •Phenol •chloroformProtein removal Salt •Sodium chloride •Sodium acetate DNA binding •Membrane •BeadsDNA precipitation Alcohol •Ethanol •Iso-propanol

    ×