1. Cultivo in vitro de meristemo apicales de Phragmipedium
peruvianum “Zapatito rojo” para la obtención de plantas libres
de virus.
1
ÁVILA, José.; 1
PEDRAZA, Ana.; 1
ROJAS, Stefany.; 1
SALAS, Marysabel.; 2
QUIÑONES, Mauro.
1
Investigadores. Laboratorio de Biotecnología y Fisiología Vegetal. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.
2
Asesor. Especialista en Biotecnología y Fisiología Vegetal. Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Universidad Ricardo Palma
RESUMEN
Phragmipedium peruvianum (Orchidaceae: Cypripedioideae) conocido como “Zapatito rojo” es una
orquídea terrestre de gran importancia económica debido a la belleza de su inflorescencia. En el
presente trabajo se tiene como objetivo principal realizar el cultivo in vitro de meristemos apicales de
Phragmipedium peruvianum “Zapatito rojo” para la obtención de plantas libres de virus. Para ello se
empleó un protocolo estandarizado. Los explantes utilizados fueron estrictamente esterilizados y los
meristemos aislados fueron introducidos en tubos de ensayo con medio de cultivo MS
enriquecido con 6-BAP. Los tubos fueron llevados al cuarto de cultivo para ser incubados a una
temperatura entre 24 – 27 ° C y en condiciones de fotoperiodo de 14 horas. Los meristemos
sembrados se mantuvieron en observación, para descartar la presencia de agentes
contaminantes o fenolización, todo el procedimiento fue realizado en condiciones asépticas. De los
6 explantes sembrados, tan solo uno presentó cambios mínimos en su coloración y tamaño.
Los explantes restantes no presentaron cambios, contaminación ni necrosis del tejido luego de
seis semanas de cultivo
Palabras claves: Phragmipedium, meristemo, in vitro, virus.
ABSTRACT
Phragmipedium peruvianum (Orchidaceae: Cypripedioideae) known as "Red Slipper" is a
terrestrial orchid of great economic importance due to the beauty of its inflorescence. In the
present paper's main objective is to perform the in vitro culture of apical meristems
Phragmipedium peruvianum "Red Slipper" to obtain virus free plants. To do this we used a
standardized protocol. The explants used were strictly sterilized and isolated meristems were
introduced into test tubes with MS medium supplemented with 6-BAP. The tubes were taken
to the grow room to be incubated at a temperature between 24 to 27 ° C and under
photoperiod of 14 hours. Planted meristems were kept under observation to rule out the
presence of contaminants or Phenolization, the entire procedure was performed under aseptic
conditions. Of the 6 explants planted, only one had minimal changes in color and size. The

2. remaining explants were unchanged, contamination and tissue necrosis after six weeks of
culture.
Key words: Phragmipedium, meristem, in vitro, virus.

3. INTODUCCIÓN
La especie Phragmipedium peruvianun
“zapatito rojo” es una orquídea cespitosa,
litófita, de tres a más hojas basales de
posición dística, endémica de la región de
San Martín – Perú (Millán et al. 2007).
Posee un alto valor económico por la
belleza de su inflorescencia por lo que su
alta demanda ha hecho que esta especie
sea extraída indiscriminadamente de su
hábitat natural, trayendo como
consecuencia que, actualmente, se
encuentre en amenaza de extinción. La
propagación de esta especie se realiza a
través de sus semillas, sin embargo este
cultivo tradicional no satisface su actual
demanda.
La biotecnología nos permite reproducir
plantas y por ende salvar aquellas que
están en peligro de extinción. Una de las
formas más eficaces para la conservación
de cualquier especie es la propagación in
vitro (Mckendrick, 2002).
La micropropagación presenta grandes
ventajas sobre otros métodos, como por
ejemplo permite el incremento acelerado
del número de plantas por genotipo y la
reducción del período de multiplicación, lo
que permite un ahorro considerable en
espacio y energía (Mendieta M. 2002). De
igual manera se pueden enunciar ventajas
a la micropropagación de orquídeas, como
el establecimiento de híbridos y el
mejoramiento de la industria y del
comercio de orquídeas (Quiñonez, 200)
El presente trabajo tiene como objetivo la
obtención de plantas in Vitro para la
micropropagación clonal de P. peruvianum
mediante el cultivo de meristemos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las plantas de Phragmepidium peruvianum
“zapatito rojo”, fueron adquiridas en el
Vivero Manrique, ubicado en Surquillo, y
posteriormente trasladadas al Laboratorio
de Biotecnología Vegetal de la Universidad
Ricardo Palma. A partir de estas se
tomaron los explantes (yemas axilares de la
base de las hojas) y se colocaron en
beakers para ser lavados con agua y
detergente. Luego se trasladaron a la
cámara de flujo laminar y fueron
sumergidos en hipoclorito de Sodio por 10
minutos. Después fueron enjuagados 5
veces con agua destilada, con intervalos de
5 minutos entre cada enjuague. Una vez
esterilizados los explantes se transfirieron
a una placa petri estéril y, con ayuda de
un estereoscopio binocular, se procedió a
aislar el meristemo retirando todos los
primordios foliares. Los meristemos
aislados (1mm) se introdujeron en tubos de
ensayo con medio de cultivo MS
enriquecido con 6-BAP, utilizando pinzas y
bisturís estériles. Los tubos fueron sellados
con papel platino y llevados al cuarto de
cultivo para ser incubados a una
temperatura entre 24 – 27 ° C y en
condiciones de fotoperiodo de 16 horas. El
cultivo de los explantes tuvo una duración
de 5 semanas.
Adicionalmente se practicó la
micropropagación con la orquídea Cattleya
sp., separando y trasladando plántulas
obtenidas in vitro, a nuevos frascos con
medio de cultivo MS, colocando 4 por cada
frasco. Finalmente estos se sellaron con
papel platino y fueron llevados al cuarto de

4. cultivo a las condiciones adecuadas. El
cultivo de las plántulas in vitro tuvo una
duración de 4 semanas.
RESULTADOS
De los 6 explantes sembrados, tan solo uno
presentó cambios mínimos en su
coloración y tamaño (Fig. 1). Los explantes
restantes no presentaron cambios,
contaminación ni necrosis del tejido luego
de seis semanas de cultivo.
Las plántulas de Cattleya sp. que fueron
micropropagadas no presentaron
contaminación alguna luego de cuatro
semanas de haber sido introducidas in
Vitro (ver Fig. 2).
DISCUSIÓN
El género Phragmipedium sp. se caracteriza
por ser uno de los géneros de orquídea
más difíciles de ser cultivados in vitro,
careciendo, por lo tanto, de una
metodología adecuada para su cultivo
(Arditti, 2008).
Para el cultivo in Vitro de meristemos, se
suele mantener 1 a 3 primordios foliares
junto al domo meristemático (Salazar et al.,
2009). En otros casos, el tamaño del
explante es vital para el éxito del cultivo.
Kaur y Bhutani en 2009 demostraron que
explantes de Vanda testacea mayores a 1
cm. no producían respuesta alguna,
mientras que aquellos que presentaban
dimensiones mucho menores tan solo
respondían a ciertas combinaciones de
suplementos en el medio de cultivo. En el
presente trabajo, los explantes utilizados
fueron de menos de 1 cm.
(aproximadamente 1 mm.) y no se
conservó ningun primordio foliar.
En general, la extracción del domo
meristemático es un procedimiento dificil,
de la cual resulta muy complicado obtener
una planta completa. Para ello, es
necesario un medio de cultivo con
concentraciones de hormonas y sales
equilibradas y condiciones ambientales
estrictas, por consiguiente, esto ha llevado
a que los resultados en ese sentido sean
muy pobres. Por esta razón, en la mayoría
de los casos, se utiliza el domo
meristemático acompañado de 1 ó 2
primordios foliares (Conci, 2010).
Los primordios foliares juegan un rol
importante durante el desarrollo de la
planta. Estas estructuras sirven como
protección para el domo meristemático,
provee de productos fotosintéticos a la
zona meristemática, la cual carece de
Fig 1. Tubo conteniendo el meristemo axilar de hojas
de P. peruvianum. Luego de seis semanas de cultivo no
se aprecian cambios significativos
Fig. 2. Plántulas de Cattleya sp. Luego de cuatro semanas
de haber sido micropropagadas. No se observa indicio
alguno de contaminación.

5. capacidad fotosintética, y se ha
demostrado que estimulan la
diferenciación del xilema en el
procambium (García, 2006; McAdam,
2008). Montero et al. en 2006 demostraron
que los primordios foliares presentan una
rápida respuesta organogénica directa
ante la incubación con fitohormonas,
pasando a formar yemas y vástagos
individuales (BAP 9mM + ANA 1.5mM) o
múltiples (MS complementado con BAP
2mg/L (8.7 uM)).
Debido a las razones expuestos, la falta de
respuesta de los explantes introducidos in
Vitro se debería a la ausencia de
primordios foliares acompañando al domo
meristemático, los cuales facilitan el cultivo
de meristemos y juegan un rol importante
en el desarrollo de la planta in Vitro.
CONCLUSIONES
• Los domos meristemáticos de las
yemas axilares de P. peruvianum
por si solos no pudieron producir
plantas in Vitro.
• Debido a la falta de respuesta de
los explantes, se utilizó plántulas
de la orquídea Cattleya sp. para la
micropropagación.
• La ausencia de primordios foliares
acompañando al domo
meristemático habría impedido el
desarrollo de plantas in Vitro.
RECOMENDACIONES
• Mantener las yemas el menos
tiempo posible expuestas al
ambiente luego de la desinfección,
para evitar el ennegrecimiento y
posibles oxidaciones de las yemas.
• Disminuir los errores de trabajo en
la etapa de lavado, desinfección,
extracción y sembrado; ya que
estos afectan directamente el
resultado para la obtención de
plantas libres de virus
• El corte del meristemo debe ser de
mayor tamaño.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• McKENDRICK, S. 2000. Manuel
para la germinación in vitro de
orquídeas, ceiba foundation. USFQ.
Quito, Ecuador. 76p
• MENDIETA MARIA. 2002. Estudio
técnico para la planificación y el
diseño de un laboratorio artesanal
para la produccion de orquideas in
vitro. Trabajo de graduación.
Universidad earth. Guácimo, Costa
Rica.
• QUIÑÓNES, M. 2000.
Micropropagación de orquídeas
Peruanas a escala piloto.
Universidad Ricardo Palma.
CONCUTEC. Lima, Perú. 98 p.
• Millán B., R. Bravo, M. Chocce & A.
Coz. 2007. Evaluación poblacional,
distribución y estado de
conservación de Phragmipedium
kovachii en el Perú. SERIE DE
PUBLICACIONES DE FLORA Y
FAUNA SILVESTRE. Instituto
Nacional de Recursos Naturales,
Lima, Perú.

6. • Arditti, J. 2008. Micropropagation
of orchids. Blackweel Publishing.
Volumen 1. pp. 61.
• García, F., Roselló, J. y Santamaría
Mª. 2006. Introducción al
funcionamiento de las plantas. Ed.
Universidad Politécnica de
Valencia. 88 pp.
• Kaur, S. y Bhutani, K.K. 2009. In
vitro Propagation of Vanda
testacea (Lindl.) Reichb.f. A Rare
Orchid of High Medicinal Value.
Plant Tissue Cult. & Biotech. 19(1):
1-7.
• Levitus, G., Echenique, V.,
Rubinstein, C., Hopp, E. y
Mroginski, L (ed.). 2010.
Biotecnología y mejoramiento
vegetal II. ArgenBio. Cap. 1 y 5.
• McAdam, J. 2008. Structure and
function of plants. Ed. Wiley-
Blackwell. 78 pp.
• Montero, C., Macías, E. y Wong-
Vega, L. 2006. Organogénesis
directa y múltiple en tejidos
juveniles de guandú o gandul
[Cajanus cajan (L.) Millsp.]. Invet.
pens. crit. 4:20-31.
• Salazar, E., Gonzales, P. y
Hernández, C. 2009. Multiplicacion
in vitro de Agave cocui trelease a
traves de yemas axilares.
Agronomía Trop..59 (2): 129-135.

7. • Arditti, J. 2008. Micropropagation
of orchids. Blackweel Publishing.
Volumen 1. pp. 61.
• García, F., Roselló, J. y Santamaría
Mª. 2006. Introducción al
funcionamiento de las plantas. Ed.
Universidad Politécnica de
Valencia. 88 pp.
• Kaur, S. y Bhutani, K.K. 2009. In
vitro Propagation of Vanda
testacea (Lindl.) Reichb.f. A Rare
Orchid of High Medicinal Value.
Plant Tissue Cult. & Biotech. 19(1):
1-7.
• Levitus, G., Echenique, V.,
Rubinstein, C., Hopp, E. y
Mroginski, L (ed.). 2010.
Biotecnología y mejoramiento
vegetal II. ArgenBio. Cap. 1 y 5.
• McAdam, J. 2008. Structure and
function of plants. Ed. Wiley-
Blackwell. 78 pp.
• Montero, C., Macías, E. y Wong-
Vega, L. 2006. Organogénesis
directa y múltiple en tejidos
juveniles de guandú o gandul
[Cajanus cajan (L.) Millsp.]. Invet.
pens. crit. 4:20-31.
• Salazar, E., Gonzales, P. y
Hernández, C. 2009. Multiplicacion
in vitro de Agave cocui trelease a
traves de yemas axilares.
Agronomía Trop..59 (2): 129-135.