1. Predavanja iz kliničke hemije
Ispitivanje statusa gvožña
Prof Vesna Spasojević-Kalimanovska
Prof Violeta Dopsaj
Farmaceutski fakultet
Univerziteta u Beogradu
2009/2010
2. CiljeviCiljevi predavanjapredavanja –– analitikaanalitika gvogvožžñaña
• Parametri u ispitivanju statusa gvoždja
• Biohemijski markeri funkcionalnog i
deponovanog Fe
• Preanalitički faktori u ispitivanju statusa
gvožña
• Analitičke metode
3. Parametri za ispitivanje statusa gvožña
• Hematološki parametri
• Biohemijski parametri
• Parametri za procenu funkcionalnog gvožña
• Parametri za procenu rezervi gvožña
6. Hemoglobin
• Koncentracija hemoglobina je prvi
parametar izbora u proceni anemije
• Nedostatak Fe → snižena sinteza Hb
anemija
• utvrdjivanje nedostatka Fe
• praćenje terapije preparatima Fe
• preklapanje rezultata (anemija i normalni)
7. Morfologija eritrocita
• nedostatak Fe
hipohromna mikroeritrocitoza
• nalaz mikrocita
– kod talasemija
– sideroblastna anemija
• koncentracija mikrocita ukazuje na stepen
anemije
8. Razmaz krvi zdrave osobe
Razmaz krvi osobe sa
hipohromnom
mikrocitnom anemijom.
Uočava se anizocitoza i
poikilocitoza
9. Hematološki parametri
Broj eritrocita ????????????
Metode
• Brojanje, fotometrijski i na brojaču
Anemija - Smanjenje mase eritrocita u
perifernoj krvi
M: 4,5-6,3 x 10 12/L
Ž: 4,2-5,5 x 10 12/L
Hematokrit: udeo krvnih ćelija u L krvi
Anemija - Smanjenje hematokrita
Metode:
• Mikrohematokrit metodom i na brojaču
M: 0,40-0,54 L/L
Ž: 0,37-0,47 L/L
11. Kriterijumi
• izgled eritrocita u razmazu
• prosečan volumen eritrocita (MCV)
• prosečna konc. Hb u pojedinačnom eritrocitu (MCH)
• prosečna konc. Hb u eritrocitima (MCHC)
MORFOLOŠKA KLASIFIKACIJA ANEMIJA
Mikrocitne→ poremećaj sinteze Hb zbog
nedostatka gvoždja ili hronične bolesti
Normocitne → hipoproliferativni ili
hipoplastični mehanizmi
Makrocitne → nedostatak vit.B12 ili folne
kis.
12. Eritrocitni indeksi
MCV: prosečna zapremina eritrocita
Mean cell volume
hematokrit (L/L)
MCV (µ m3) =
broj eritrocita (1012 /L)
µm3 = 10-15 L = femtolitar (fL)
Normalan: 80 - 94 fL
13. MCH prosečna količina hemoglobina u eritrocitu
Mean cell hemoglobin content
Hemoglobin (g/L)
MCH (pg) =
Broj eritrocita (1012 /L)
Normalno: 25-30 pg
pg (pikogram) = 10-12 g
Eritrocitni indeksi
14. MCHC prosečna koncentracija hemoglobina u
eritrocitima
Mean cell hemoglobin concentration
Koncentracija hemoglobina (g/L)
MCHC (g/L) =
Hematokrit (L/L)
Normalno: 300-360 gHb/L Er (g/L)
Maksimalno: 370 g/L
Eritrocitni indeksi
16. RDW Red cell distribution width
Širina distribucije zapremine eritrocita
Indeks varijacije veličine eritrocita
Značaj:
• Detekcija anizocitoze
• Deficijencija Fe RDW ↑↑↑↑ i MCV ↓↓↓↓
Eritrocitni indeksi
17. RDW = RBC DISTRIBUTION WIDTH (CV) %
RDW
RDW = COEFICIENT OF VARIATION OF RBC VOLUME
18. RDWRDW
Širina distribucije zapremine eritrocita
Indeks anizocitoze
RDW zavisi od vrste hematološkog brojača (15.8 ± 2.9 %)
RDW (%) = SD (širina histograma) x 100
MCV (fL)
MCV nizak MCV normalan MCV visok
RDW α i β talasemija Anemija hroničnih bolesti Aplastična anemija
normalan (heterozigoti)
Anemija zbog
RDW deficijencije gvožña Bolesti jetre Deficijencija folata
visok Hemoglobin H HLL, HGL (perniciozna anemija)
S-β talasemija Mjelofibroza Hemolizna anemija
19. RETIKULOCITI
Prelazni oblik izmeñu eritroblasta sa jedrom i zrelih
eritrocita bez jedra sa remnantima ribozomalne RNK
Prisustvo retikulocita u krvi ukazuje na aktivnu kostnu srž
Zadržavaju se 2-3 dana u kostnoj srži i 1 dan u perifernoj krvi
U stimulisanoj eritropoezi su 2-3 dana u perifernoj krvi,
dvostruko je povećan broj retikulocita u cirkulaciji, tzv stresni
retikulociti
21. Hematološki nalaz kod pacijenata sa anemijom zbog
deficijencije gvožña. Zapaža se nizak hemoglobin,
nizak hematokrit, mikrocitoza (nizak MCV),
hipohromatoza (nizak MCH) i RDW je povećan
22. Mikrocitna
anemija
(MCV < 80 fL)
Feritin
Saturacija transferina
Snižene
vrednosti
Normalne
vrednosti
Hronični gubitak krvi
Smanjen unos Fe
hranom
Normalan broj
retikulocita
Povišen broj
retikulocita
Hronična
inflamacija
Hemoglobinopatija
Alogoritam u ispitivanju mikrocitne anemije
29. Biohemijski parametri statusa Fe
• Gvožñe u serumu
• TIBC i saturacija transferina
• Slobodni eritrocitni protoporfirini
• Cink protoporfirin
• Feritin
• Serumski transferinski receptori
• Eritropoetin
30. Biohemijski parametri statusa Fe
• Gvožñe u serumu
Odreñivanje Fe bez TIBC ima mali klinički
značaj
Fe se uvek odreñuje istovremeno sa TIBC da bi
se pravilno interpretirao rezultat
31. Metode odreñivanja Fe
• Metoda sa deproteinizacijom
• Metoda bez deproteinizacije
– Slepa proba (bilirubin, hemoglobin, zamućenost)
Direktne metode
• brze, jednostavne
• manja zapremina uzorka
• manja opasnost od kontaminacije in vitro
• na automatima
• dodatak deterdjenta Triton X-100 zbog
zamućenja
32. Metode odreñivanja Fe
• Spektrofotometrijsko
– stvaranje kompleksa sa visokim apsorpcionim
koeficijentima
1. Odvajanje Fe od proteina
– kisela sredina (HCl, H2SO4, CCl3COOH)
2. Redukcija Fe+3
– hidrazin, ditionit, sulfit, tioglikolna kiselina,
hidroksilamin, askorbinska kiselina
3. Reakcija Fe+2 sa hromogenom (-N=C-C=N-)
Hromogeni
– Batofenantrolin disulfonat
– Tripiridil triazin
– Ferozin
– Terozit
33. Serumsko gvožñe
Fe ↓↓↓↓
• kod anemija
• akutne i hronična
inflamatorna stanja
• kod terapije anemija
– perniciozne anemije
vit B12
• akutno ili skoro
krvarenje
• davaoci krvi
• menstruacije
Fe ↑↑↑↑
• kod nagomilavanja Fe
– hemohromatoza
– uzimanje Fe
– akutno trovanje Fe
• upotreba kontraceptiva
• megaloblastna anemija
• talasemija
• hipoplazija koštane srži
• nekroza ćelija jetre
34. Kapacitet vezivanja gvožña
• Transferin 1/3 zasićen Fe
• TIBC Total iron binding capacity
– Ukupan kapacitet vezivanja gvožñja
• UIBC Unsaturated iron binding capacity
– Slobodan (nezasićen) kapacitet vezivanja gvožña
TIBC = UIBC + Fe
• Zasićenje transferina
Anemija
Fe ↓
TIBC ↑
UIBC ↑
Zasićenje transferina ↓
35. Metode odreñivanja kapaciteta vezivanja Fe
1. Dodavanje Fe u višku (feri-amonijum citrata)
• višak nevezanog Fe(III) se uklanja (MgCO3)
• centrifugiranje
• u supernatantu se odredi koncentracija Fe TIBC
UIBC = TIBC - serumsko Fe
2. Dodavanje Fe u višku
• redukcija viška Fe(III)
• Fe vezano za transferin ne reaguje
• Reakcija sa hromogenom
UIBC = Dodato Fe - Fe u višku
36. Transferin u serumu
Transferin je negativni reaktant akutne
faze
• TIBC ↓
– trauma, infekcije, nefrotski sindrom (gubitak
proteina)
– glukokortikoidi ili ACTH
37. Zasićenje transferina
Saturacija transferina
• Udeo transferina zasićenog gvožñem u odnosu na
njegov ukupan kapacitet vezivanja gvožña
koncentracija Fe u serumu / TIBC
Referentne vrednosti:
muškarci………....0,20-0,50
žene………………0,15-0,50
Povišena saturacija transferina >>>> 45 %
• Hemohromatoza, hemosideroza, talasemija, terapija
kontraceptivima, unos Fe
Snižena saturacija transferina <<<< 15 %
• Anemija zbog deficijencije gvožña
38. Zasićenje transferina
• Granica merenja TIBC do ~ 180 µmol/L
• Fe i TIBC > 180 µmol/L
– visoke koncentracije feritina
• hepatocelularna oštećenja- virusni hepatitis
– injekcije gvožñem dekstranom
39. Izračunavanje koncentracije transferina
Transferin
• imunohemijske metode
– RID, nefelometrija, turbidimetrija
• Izračunavanje
Tf (g/L) = 0,0405 x TIBC (µµµµmol/L)
Mm = 81000 ; 1 mol transferina - 2 atoma Fe
TIBC stvarna količina Fe-transferina:
– vezivanje Fe za druge proteine
– MgCO3 ne uklanja kvantitativno slobodno Fe
Dobra korelacija izračunatog transferina i
odreñenog transferina- imunohemijskom
metodom
• Prednost imunohemijske metode mala količina uzorka
40. Preanalitičke varijacije pri odreñivanju
statusa Fe
Fiziološke varijacije
Fe TIBC
• Dnevni ritam
– ujutru N N
– uveče ↓ N
• Menstruacija ↓ N
• Pre-menstrualni period ↑ N
• Kontraceptivi ↑ ↑
• Trudnoća (uz terapiju Fe) ↑ ↑
41. Preanalitičke varijacije
pri ispitivanju statusa Fe
Interferencije lekova
Fe ↓↓↓↓
• aspirin (velike doze)
• alopurinol i do 40 % posle terapije od 1 meseca
• holestiramin zbog otežane apsorpcije
Fe ↑↑↑↑↑↑↑↑
• davanje gvožña dekstrana intravenozno zbog
spore eliminacije
42. Preanalitičke varijacije pri odreñivanju Fe
• Uzorak
– serum
– plazma (heparin) EDTA, oksalat, citrat vezuju Fe
– uzimanje ujutru
– interferencija jaka hemoliza
• Čistoća
– reagensi
– sudovi: preko noći u 6 mol/HCl, ispiranje 6 x sa vodom
– voda dejonizovana
Preporuke za pravilno uzimanje uzorka
– Vakutejner sistemi ili plastične epruvete
za jednokratnu upotrebu
43. Referentne vrednosti
Uticaj pola i godina
• Fe
– novorodjenčad……………...17,9 - 44,7 µmol/L
– deca do 1 god……………......7,2 - 17,9 µmol/L
– deca > 1 god………………........9,0 - 21,5 µmol/L
– muškarci……………………......11,6 - 30,4 µmol/L
– žene………………………...........9,0 - 30,4 µmol/L
• UIBC……………………….......32 - 45 µmol/L
• TIBC………………………….....45 -80 µmol/L
44. Feritin
• Koncentracija u krvi niska
– svega 1 % Fe u plazmi
• Feritin zavisi od količine rezervnog Fe
• 1µg/L feritina u serumu ≅ 140 µg rezervnog Fe/kg t.t.
• Indikator veličine rezervnog dela Fe
Odreñivanje feritina
• IRMA, RIA, EIA (ELISA), FIA
Referentne vrednosti – uticaj pola i godina
• odrasli muškarci…………………20-300 µg/L
• odrasle žene……………………..15-120 µg/L
• novorodjenčad……………………25-200 µg/L
• deca 1 m………………………… 200-600 µg/L
• deca 2-5 m………………………..50-200 µg/L
• deca 6 m - 15 g…………………….7-142 µg/L
45. Feritin
Feritin je osetljiv pokazatelj nedostatka Fe
• rani pad feritina (latentna anemija)
• Feritin ↑ protein akutne faze pozitivan
– hronične bolesti: infekcije, zapaljenja, bolesti bubrega
– maligne bolesti: limfomi, leukemije, karcinom dojke, neuroblastomi
– virusni hepatit, toksično oštećenje jetre, alkohol
– hemosideroza, hemohromatoza
•Ukoliko pored deficijencije Fe postoji i infekcija rezultat
feritina mora se veoma oprezno tumačiti
•Feritin <10 µg/L uvek ukazuje na hipohromnu anemiju
•Feritin > 80 µg/L sigurno isključuje deficit gvožña i anemiju
•Koncentraciju feritina ne treba odreñivati neposredno posle terapije
•Feritin je neophodan u diferencijalnoj dijagnozi
Tumačenje rezultata feritina
46. Odreñivanje solubilnih transferinskih receptora u
serumu
• za procenu funkcionalnog dela Fe
• cirkulirajući transferinski receptori
• imunohemijske metode
• Deficijencija Fe:
– porast transferinskih receptora u serumu
– Vrlo visok porast 2-3 x kod anemije u odnosu na
zdrave osobe
– Visoka specifičnost i osetljivost u otkrivanju
subkliničkih i kliničkih deficijencija gvožña kod
pacijenata kod kojih je indikovana suplementacija Fe
48. Slobodni eritrocitni porfirini FEP
• Protoporfirin IX
• Porast FEP kod anemije i trovanja olovom
Cink protoporfirin (ZPP)
Kod anemije i kongenitalne eritropoetske porfirije
Eritropoetin
• utvrdjivanje uzroka hronične anemije
• kod renalnih bolesti izvor eritropoetina je
uništen
50. Parametri za ispitivanje anemije
• Hemoglobin snižen
• Sideropenična anemija
• Kompletna krvna slika
• Makrocitna, normocitna i hipohromna
• Sniženi MCV i MCH
51. Parametri za ispitivanje anemije
Feritin
• Manji od 12 ug/L
• Protein akutne faze
• Uticaj inflamacije
52. Parametri za ispitivanje anemije
Serumski transferin i TIBC
• Inverzni feritinu kod anemije
• Saturacija transferina < 15 %
53. Ispitivanje anemije
Glavni problem kod dijagnoze anemije u
hospitalizovanim bolesnicima je
razlikovanje kod hroničnih oboljenja
anemije nevezano od deficita Fe
Serumski transferinski receptori
najbolji diskriminator prave
deficijencije gvožña
54. Zaključci
Ispitivanje viška gvožña
Parametri za ispitivanje opterećenja gvožñem:
• Feritin
• Saturacija transferina > 45 %
Dijagnostika hemohromatoze
• Histohemijska ili hemijska analiza Fe pri
biopsiji jetre
– Praćenje izlučivanja Fe urinom
– Kod terapije deforksaminom
• Metode molekularne biologije
• HFE protein
• Mutacija Cys282Tyr
