Extracción pigmentos cloroplastos TLC

EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS DE LOS
CLOROPLASTOS.
CURSO : COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE …………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES
GRUPO : “B”
DOCENTE : ING. CASTRO ZAVALETA VICTOR
º…………………………………………………………………………………………………………….ºººººººAUGUSTO.
ALUMNO : VEGA VIERA JHONAS ABNER.
CICLO: “V”
NUEVO CHIMBOTE - PERÚ
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERIA
E.A.P AGROINDUSTRIAL

FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
extrae
secar
colocan
retiran las placas
calcular la Rf
Macerar.
agregar
El producto
iluminándolo
resultados.
EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS DE LOS
CLOROPLASTOS.
 Fluorescencia
 realizar la cromatografía de (TLC)
[Más alcohol etílico, seguir macerando y
repetir el proceso (No usar más de 60 ml)].
[Se utilizará para observar la fluorescencia
de la clorofila].
[Decantar y filtrar (con gasa y/o algodón)].
Espinaca con un poco de
alcohol etílico al 95 %
10g
[Con el secador de cabello con aire frío, para que no se
difunda las gota. Luego se coloca la segunda gota y se
repite las operación. Colocar en total no más de 5 gotas].
[Placas en la cuba de cromatografía, se tapa o se cubre
con vidrio para no perder la saturación de la misma y se
coloca en oscuridad hasta que ascienda el solvente
hasta 3/4 partes de la placa (aproximadamente 1
hora)].
[Parte del extracto con una jeringa y aguja para
insulina, se coloca una gota del extracto en la parte
inferior de la placa a 1 cm del borde blanco inferior].
[luego de haber verifique la separación siempre
tomándolas de los bordes, sin tocar la zona blanca].

activan las placas
separar
Poner
extracción de clorofilas y
carotenoides
Pesar.
triturar.
Filtrar con vacío
Pasar el extracto
Esperar unos minutos
Añadir
 Cromatografía en capa fina, ascendente simple (TLC).
[Colocan en el desecador el cual contiene una
caja de Petri con sílica gel, hasta que se enfríe].
[Mezcla de los solventes (75:25 éter de
petróleo-acetona), en la cuba de cromatografía
hasta saturar (tiempo estimado de 1 a 1:30 hs)].
[En una estufa colocándolas a una temperatura
de alrededor de 100º C, durante 15 minutos].
Material vegetal (peso fresco)
2g
[Mortero con una mezcla de acetona-hexano a
partes iguales].
[Reextrayendo si es necesario hasta que la pulpa
quede incolora y aforar el filtrado a 25 ml con la
mezcla de extracción].
[Obtenido a un embudo de decantación que
contiene 10 ml de hexano y añadir unos 25 ml de
agua destilada].alcohol metílico saturado de
KOH
5ml
[Agitar y dejar reposar hasta que se separe la
fase alcohólica con las clorofilas saponificadas, y
desechar éstas últimas.].

1. INTRODUCCIÓN.
La clorofila es un pigmento de las plantas, que les proporciona su color verde y que
absorbe la luz necesaria para la fotosíntesis. La clorofila absorbe principalmente luz
violeta roja y azul y refleja luz verde.
La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos vegetales es la
causa de que esas partes de las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila
es enmascarada por otros pigmentos. La extracción y reconocimiento de estos pigmentos
es interesante para es estudio y conocimiento de sus propiedades.
Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son moléculas químicas
que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un
pigmento depende de la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la
reflexión de otras. Constituyen el sustrato fisicoquímico donde se asienta el proceso
fotosintético.
Hay diversas clases de pigmentos:
• Clorofilas (a, b, c, d y bacterioclorofilas) de coloración verde.
• Accesorios:
• Carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloración amarilla y roja.
• Ficobilinas de coloración azul y roja presentes en las algas verdeazuladas, que
comprenden el filo de los Cianofitos.
La Clorofila, es el pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de
absorber la luz necesaria para realizar la fotosíntesis, proceso que posibilita la síntesis de
sustancias orgánicas a partir de las inorgánicas (CO2, H2O y sales minerales), mediante la
transformación de la energía luminosa en energía química. La clorofila absorbe sobre todo
la luz roja, violeta y azul, y refleja la verde. Generalmente la abundancia de clorofila en las
hojas y su presencia ocasional en otros tejidos vegetales, como los tallos, tiñen de verde
estas partes de las plantas.
 PIGMENTOS VEGETALES
Los colores que presentan los vegetales son debidos
a unos compuestos químicos llamados pigmentos. El
color que presenta un determinado órgano vegetal
depende generalmente del predominio de uno u
otro pigmento o la combinación de ellos. Además,
algunos de los pigmentos que condicionan el color
están estrechamente ligados a las actividades

fisiológicas del propio vegetal.
El color verde en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente
emparentados llamados clorofila A y clorofila B. Se encuentran prácticamente en todas las
plantas con semilla, helechos, musgos y algas. También aunque aparentemente falten en
algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de
estas, puede comprobarse incluso allí la presencia de las clorofilas, que estaban
enmascaradas por los demás pigmentos. Asociados con las clorofilas, existen también en
los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son los
xantofilas y carotenos.
 CLOROFILAS
En las plantas superiores, la fotosíntesis es posible debido a la presencia en el cloroplasto,
concretamente en las membranas tilacoidales, de una serie de pigmentos que tienen
capacidad para captar la luz. Existen dos tipos básicos de pigmentos fotosintéticos:
Clorofilas. Compuestas por una porfirina que lleva incorporado un átomo de magnesio
en el centro del núcleo tetrapirrólico . El ión Mg2* está coordinado con los cuatro átomos
de nitrógeno centrales, lo que hace de la clorofila un complejo extraordinariamente
estable. La "cabeza" que acabamos de describir, está unida a una "cola", el fitol, que es un
alcohol de 20 átomos de carbono. Cabeza y cola se unen a través de un enlace éster en el
que intervienen el grupo alcohólico del fitol y el grupo carboxilo de un ácido propiónico
que está unido al anillo IV del núcleo tetrapirrólico. Existen varios tipos de clorofilas, las
más importantes de las cuales son la "a", y la "b". La clorofila a tiene un grupo -CH3 en el
anillo II mientras que la clorofila b tiene un grupo -CHO en esa misma posición.
Carotenoides. Actúan como pigmentos
accesorios en el proceso de la
fotosíntesis. Existen dos tipos de
pigmentos carotenoides: carotenos y
xantofilas.
Los carotenos son hidrocarburos
isoprenoides que no contienen oxígeno y
están formados por largas moléculas con
un sistema de enlaces conjugados
alternantes, dobles y sencillos,
rematados en cada extremo por un anillo
de ciclohexano insaturado- tienen color
amarillo-anaranjado.

Las xantofilas tienen una estructura muy similar a la de los carotenos y su diferencia
estriba en la incorporación de oxígeno en los extremos de la molécula. Según el grupo que
se incorpore existen variedades dentro de las xantofilas. Son de color amarillo.
Como se señalo anteriormente la energía lumínica pueda ser utilizada por los sistemas vivos,
primero debe ser absorbida y quienes realizan esta función son los pigmentos fotosintéticos. Los
pigmentos son sustancias que absorben luz; algunos absorben luz de todas las longitudes de onda y,
por lo tanto, parecen negros. Otros, solamente absorben ciertas longitudes de onda, transmitiendo
o reflejando las longitudes de onda que no absorben. La clorofila, el pigmento que hace que las
hojas se vean verdes, absorbe luz en las longitudes de onda del violeta y del azul y también en el
rojo. Dado que refleja la luz verde, parece verde.
 CROMATOGRAFÍA
Las técnicas cromatográficas para el análisis y purificación de los productos de reacción
son ampliamente utilizadas en el laboratorio orgánico.
La técnica cromatográfica de purificación consiste en separar mezclas de compuestos
mediante la exposición de dicha mezcla a un sistema bifásico equilibrado.
Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los componentes de la
mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta
las sustancias que se separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase
estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un
sólido o un líquido. Las combinaciones de estos componentes dan lugar a los distintos
tipos de técnicas cromatográficas que aparecen en la siguiente tabla:
 Cromatografía de adsorción.
Dentro de esta técnica pueden diferenciarse dos tipos de cromatografías de adsorción
denominadas cromatografía cromatografía de columna y de capa fina (abreviada TLC, del
inglés Thin Layer Chromatography).
Para la técnica de cromatografía de adsorción en columna se emplean columnas verticales
de vidrio cerrada en su parte inferior con una llave que permita la regulación del flujo de la

fase móvil. Las columnas se rellenan con un adsorbente, como alúmina o gel de sílice (fase
estacionaria), mojado con el disolvente que se vaya a emplear en el proceso
cromatográfico. En la parte superior de la columna se pone la disolución de la mezcla a
separar y a continuación un depósito que contenga el eluyente (fase móvil) que se va a
utilizar en la separación. Se abre la llave inferior de manera que el eluyente comience a
bajar por la columna. En este proceso, los componentes de la mezcla son adsorbidos por la
fase estacionaria con diferente intensidad, de manera que el proceso de adsorción-
desorción hace que unos componentes avancen más rápidamente que otros. El líquido que
sale por la parte inferior de la columna se recoge de manera fraccionada. Si los
componentes de la mezcla avanzan a muy diferente velocidad se podrán obtener
fracciones cromatográficas constituidas por un solo componente.
En toda cromatografía hablaremos de los siguientes términos:
• matriz de la columa. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en
la columna. También se denomina el lecho de la columna.
• longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna.
Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco
importante en otras como la cromatografía de afinidad.
• volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna
cromatográfica.
• volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la
columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el
volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que
empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de
cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna.
• 'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen de
solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella.
Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que
contiene las proteínas no afines al ligando.
2. OBJETIVOS
 Escoger el material adecuado para extraer clorofilas
 Aplicar experimentalmente la extracción por solventes
 Empacar y desarrollar una columna de fraccionamiento
 Indicar los diferentes pigmentos fotosintéticos en la columna de acuerdo a su
polaridad

3. MATERIAL
 2 vasos de precipitado de 250 ml
 1 vaso de precipitado de 150mL
 1 probeta de 100ml
 Papel filtro
 1 mechero
 1 columna cromatografíca (2X20cm)
 1 lana de vidrio
1. MATERIAL BIOLÓGICO
Hojas de espinaca frescas.
4. PROCEDIMIENTO
Se tomar algunas hojas verdes
y tiernas de espinacas
Se separó los pecíolos y
venas grandes de las
hojas y posteriormente se
picó cada uno de ellas.
Se llegó a cortar en pequeñas
partes la espinaca
Se pesó aproximadamente 10g
de espinaca

4.1. FLUORESCENCIA.
Colocar en un mortero trozos de hoja
lavadas (quitando las nerviaciones)
Se agregó a la espinaca
triturada menos de 60ml de
alcohol de 99.7° luego se
siguió Triturando sin golpear
hasta que el líquido adquiera
una coloración verde intensa.
Filtrar, recogiendo el filtrado en un vaso
precipitado. Se obtiene así una solución
en alcohol de pigmentos.
Se utilizó una gota del líquido de espinaca en la placa.

Cuidadosamente
colocamos las placas e
el microscopio.
Podrimos observar en el microscopio la clorofila α, la cual se obtuvo en
mayor cantidad ya que esta es la que constituye aproximadamente el 75% de
toda la clorofila en las plantas verdes y se pudo observar de color verde
azulado. Seguida por la clorofila beta que fue la que se obtuvo en segundo
lugar en cantidad en color verde amarillento.

4.2. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA, ASCENDENTE SIMPLE (TLC)
Posteriormente añadimos 5ml de alcohol metílico saturado de KOH,
previamente agitando y dejando reposar hasta que se separe la fase
alcohólica con las clorofilas saponificadas, y luego desechamos los estados
últimos quedandándonos de esta manera.
Pesamos 2g Trituramos
Filtramos
En el embudo decantación que contiene 10ml
de hexano añadimos 25ml de agua destilada
Podrimos observar un arito en la
parte inferior de la mezcla de
sustancias y esos son los carotenos
que la sustancia contenía.

4.1. REALIZAR LA CROMATOGRAFÍA (TLC)
Posteriormente calculamos RF.
Luego en el espectrofotómetro
medimos la cantidad de energía
radiante que absorbe un sistema
químico en función de la longitud
de onda de la radiación, y a las
mediciones a una determinada
longitud de onda.
La teoría ondulatoria de la luz
propone la idea de que un haz de
luz es un flujo de cuantos de
energía llamados fotones; la luz
de una cierta longitud de onda
está asociada con los fotones, cada
uno de los cuales posee una
cantidad definida de energía.
Con la solución donde está
contenido los carotenos
Se procedió extraer
todo el liquido.
Carotenos
Una vez que se verifique la separación se retiran
las placas, siempre tomándolas de los bordes,
sin tocar la zona blanca; se las coloca sobre una
mesa, se marca sobre los costados el frente del
solvente (para luego calcular la Rf), luego se seca
la placa con el secador de aire frío.

Muestra Nº1

Muestra

CLROFILA A: rojo
CAROTENO: anaranjado
CLROFILA A: azul
CLROFILA B:

CLROFILA B: CLROFILA A: azul
CAROTENO: anaranjado
CLROFILA A: rojo

5. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS:
En esta práctica pudimos observar los distintos pigmentos fotosintéticos que se
encuentran dentro de las hojas de espinaca a través de la cromatografía, En primer lugar al
romper las células en el mortero los pigmentos que se hallaban encerrados en los
cloroplastos dentro de ellas pasan al metanol. En numerosas ocasiones uno de los
pigmentos es más abundante y enmascara a los demás que no se pueden observar. como
vimos en nuestra introducción, el pigmento más soluble en el metanol es el que forma una
banda coloreada en la parte superior.
Según Bedui 1993 El color de los alimentos es un atributo que tiene mucho peso dentro
del juicio del consumidor, este puede llegar a ser determinante para que un comestible sea
aceptado o rechazado.
Según Vázquez, 2001 El colorante obtenido de las semillas de achiote (Bixa orellana),
esta compuesto en su mayoría por el carotenoide bixina, que se utiliza en la industria
láctica, cárnica, condimentaría, cosmética, farmacéutica, etc.; es un colorante natural
exento de certificación. La extracción más rudimentaria se basa en un lavado con agua en
ebullición y a escala industrial se ha implementado un proceso de extracción alcalino que
es de fácil aplicación, pero que tiene el inconveniente de que el producto final contiene al
máximo 30 a 40% de pigmentos.
Según Richter, 1972 y Barceló Coll et al., 1992 Cuando una solución de clorofila es
iluminada con luz blanca o azul se produce un fenómeno de excitación molecular,
observable por la emisión de luz de color rojo vinoso intenso. La luz emitida por
fluorescencia es siempre de mayor longitud de onda y de menor energía que la luz
incidente, pues siempre algo de esa energía se disipa en forma de calor.
6. CONCLUSIONES
 Se obtuvieron los pigmentos fotosintéticos de la clorofila, que son los que le dan color
a las hojas de las plantas ya que la fotosíntesis es un proceso que permite a los
vegetales obtener la materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones
vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de
pigmentos, capaces de captar la energía lumínica.
 Se obtuvieron los pigmentos fotosintéticos de la clorofila, que son los que le dan color
a las hojas de las plantas ya que, como vimos en nuestra introducción, la fotosíntesis
es un proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que
necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia
en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía
lumínica. Gracias a esta práctica, se logró observar cómo cambian las tonalidades de
estos pigmentos fotosintéticos que componen a las plantas y se encuentran en los
cloroplastos de la célula vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz visible,
además de que son los que constituyen el sustrato fisicoquímico de la fotosíntesis.
 Gracias a esta práctica, se logró observar cómo cambian las tonalidades de estos
pigmentos fotosintéticos que componen a las plantas y se encuentran en los

cloroplastos de la célula vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz visible,
además de que son los que constituyen el sustrato fisicoquímico de la fotosíntesis.
 Los diferentes pigmentos existentes en los alimentos captan diferentes longitudes de
onda, de acuerdo a la color aunque pueden coincidir en algunos colores como es el
caso de la clorofila a y b que pueden captar colores entre azul y violeta, a diferencia de
los carotenos que se encuentran en amarillo y naranja
7. RECOMENDACIONES
 Para observar los colores en su naturaleza se recomienda usar papel absorbente para
filtrar la cual nos mostrara los colores donde podremos observar de forma natural.
Los resultados de colores fueron obtenidos atraves del espectrofotómetro conectado
a una computadora que da una lectura de barrido desde 300nm hasta los 900nm.
 Se recomienda utilizar alcohol en lugar de agua porque la clorofila no es
soluble en agua.
 Recomendamos hacer un escurrido con mas calma y repetirlo varias veces ya que no
obtuvimos clorofila sino que también los grumos, eso podría ser porque se vertió todo
al mismo tiempo y como consecuencia todo bajó.
CONTRASTAR
He buscado páginas para comparar; en las páginas encontradas que se utiliza alcohol, agua
y también una mezcla al 50% de acetona y alcohol para la cromatografía de tinta verde. Y
se comprobó que es más eficaz con alcohol que con agua, ya que ésta no es disolvente de la
tinta. El alcohol permite separar los diferentes colorantes de la tinta y los pigmentos de la
clorofila. En otra página se utiliza el agua salada como disolvente y la hoja se frota al papel
de cromatografía en lugar de macharla y extraer la clorofila. También se pueden utilizar
otras vegetales que contengan clorofila como la lechucha, el apio, acelga etc
Papel absorbente Espectrofotómetro

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