PCR Metilacion

1. CEDEÑO RUIZ JUAN RAMON 8PM3
TÉCNICAS PARA DETERMINAR EL GRADO DE METILACIÓN
La metilación del ADN consiste en la transferencia de grupos metilos (-CH3) a algunas de las
bases citosinas (C) del ADN situadas previa y contiguamente a una guanina (G). Estas islas CpG
son regiones entre 0.5 y 5.5 kb con un contenido de dinucleotidos CG de al menos 55% (suponen
un 1% del genoma y no suelen estar metiladas). Se concentran especialmente en la región
promotora de los genes. Los promotores son secuencias específicas de ADN localizadas en los
extremos 5'-terminales de los genes y contiene la información necesaria para activar o desactivar
el gen que regula. La ARN polimerasa se une a las secuencias de dichos promotores iniciando el
proceso de la transcripción.
Las células malignas van acompañadas de una hipometilación global que está asociada a la
activación de los genes necesarios para la invasión y metástasis –vía oncogenética- (técnicas de
cuantificación de la metilación) y de una hipermetilación local (islas CpG) relacionada con la
represión de los genes supresores de tumor –vía supresora- (técnicas para la detección de CpG de
determinados genes)
Existen múltiples técnicas aplicables para el análisis de la hipermetilación de promotores o
hipometilación general de ADN y basadas generalmente en diferentes métodos de electroforesis
capilar de alta resolución o mediante el uso de estrategias enzimáticas y químicas. Para elegir la
más adecuada hay que tener en cuenta tanto la naturaleza de la muestra como los resultados que
pretendemos obtener.
1. TÉNICAS PARA DETECTAR EL ESTADO DE METILACIÓN DE UN GEN EN
CONCRETO
El proceso de amplificación del ADN (PCR) hace que se pierda toda la información sobre la
metilación. Es necesario traducir un cambio epigenético en una modificación de la
secuencia para identificar la información epigenética.
MSP (Methyl spcecific PCR). En la técnica de MSP el ADN es tratado previamente con
bisulfito sódico, reactivo que transforma las citosinas no metiladas en uracilos, mientras
que la metilación protege a las citosinas de la transformación. Por tanto, se produce un
cambio de secuencia entre el ADN metilado y no metilado (Figura 1). A partir de aquí,
cualquier método para detectar una mutación puede ser utilizado para identificar la
metilación de una secuencia

2. MSP + ANALISIS DE RESTRICCIÓN
• COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) Combina la conversión del ADN por el
bisulfito y la digestión con enzimas de restricción que reconoce las secuencias modificadas.
• MS-MLPA (Methylation Specific-Multiple Ligation Probe Amplification). En el ensayo de MS-MLPA,
el set de sondas para la detección de metilación (llamadas “SALSAS”) contienen un

3. sitio de restricción de la enzima endonucleasa HhaI, sensible a la metilación. La reacción
genera dos muestras: una muestra sin digerir para la detección del número de copias mediante
MLPA y otra muestra digerida para la detección de metilación.: Las sondas digeridas no
pueden ser amplificadas de manera exponencial durante la PCR y por lo tanto, no producirá
señal durante la electroforesis capilar. Por el contrario, si el ADN de la muestra está metilado,
está protegido contra la digestión de HhaI y generará señal en la electroforesis (Figura 2).
MSP + PCR CUANTITATIVA
• MS-QPCR (Methylation Specific Quantitative PCR) Método basado en PCR a tiempo real en
ADN tratado con bisulfito. El producto de PCR se somete a un gradiente creciente de
temperatura a la vez que se detecta la fluorescencia emitida (curva de temperatura de fusión).
Según incrementa la temperatura, el producto de PCR se desnaturaliza, el fluorocromo se
libera y deja de emitir fluorescencia. El cambio de secuencia dará lugar a una diferente
temperatura de fusión, siendo mayor en el ADN metilado que en el no metilado.
MSP + DESNATURALIZACIÓN DEL ADN
• MS-DGGE (Methylation Specific Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Este método se
basa en las propiedades inherentes a la secuencia de los productos amplificados mediante
MSP, que les hacen ser fácilmente reconocibles en un gel de poliacrilamida sometido a un
gradiente de temperatura.
• MS-DHPLC (Methylation-Specific Denaturing High Performance Liquid Chromatography) En
esta técnica, muy similar a la anterior, los fragmentos de ADN obtenidos tras MSP se
desnaturalizan por calor y se vuelven a hibridar. La Temperatura de fusión de los fragmentos
rehibridados define el tiempo que son retenidos en la columna cromatográfica.
• MS–SSCA (Methylation-Specific Singlestrand Conformation Analysis) Se basa en la diferente
movilidad de las cadenas sencillas de ADN previamente tratadas por MSP. El producto de la
PCR se desnaturaliza y se realiza una separación electroforética en condiciones
desnaturalizantes.
MSP + ASO-PCR
• MS-SNuPE (Methylation Sensitive Single Nucleotide Primer Extension) Se basa en un
tratamiento inicial con bisulfito y después una PCR con un primer que acaba inmediatamente
antes de cada isla CpG a estudiar. Se utilizan nucleótidos marcados (ddCTP y ddTTP).
Después de la electroforesis, los productos son analizados por fosfo-imagen. Se pueden
analizar de dos a cuatro islas CPG en más de 40 muestras en sólo 5 horas. MSP +

4. SECUENCIACION
• PIROSECUENCIACIÓN DE BISULFITO
Después del tratamiento de bisulfito se realiza el análisis en tiempo real de secuencias de DNA
de una longitud relativamente corta (hasta 80 pb) mediante un proceso enzimático.
2. TÉNICAS PARA CUANTIFICACIÓN DEL ESTADO DE METILACIÓN.
El objetivo de estas técnicas es obtener el perfil de metilación de múltiples genes. El soporte
para el análisis de este perfil suele ser los microarrays debido a su cada vez más bajo coste y
la posibilidad de estudiar las islas CpG de cientos de genes al mismo tiempo en el mismo
ensayo (Figura 3).
MICROARRAYS + MSE
• MS-ARRAYS (Methil Sensitive Array) Incorpora el tratamiento de bisulfito previo a cada una
de las PCR que deben ser diseñadas especialmente para arrays Aunque requiere una PCR
específica para cada gen, el método puede analizar varios islas CpG dentro de cientos de
genes al mismo tiempo;
MICROARRAYS + ENZIMAS DE RESTRICCION
• DMH-ARRAYS (Differential Methylation Hybridization Array) El ADN es digerido por
endonucleasas (Mse I, Tsp509I, Nla III o BfaI), en las islas CpG no son frecuentes los sitios de
restricción de estas enzimas por lo que tras una combinación de las mismas se obtienen
fragmentos de entre 0.2 y 2kb enriquecidos en islas CpG. Estos fragmentos son nuevamente
digeridos por enzimas sensibles a la metilación (BstUI y Hpa II). Los fragmentos hipermetilados
resisten a la digestión y pueden ser amplificados. Los resultados comparados con un control
son visualizados en un microarray.
• RLGS (Restriction landmarks genome scaning) es un método para detectar una gran cantidad
de señales de restricción en un solo experimento. Combina una electroforesis en un gel de dos
dimensiones de alta resolución, en vez de un array, con la metilación y digestión con enzimas
de restricción (NotI y ASCI). Permite establecer los perfiles de metilación de miles de loci a la
vez.

5. MICRO-ARRAYS +INMUNOPRECIPITACIÓN
• MeDIP (Methylated DNA inmunoprecipitation). El ADN total es sonicado y el metilado se
inmunoprecipita utilizando anticuerpos anti-methylcytosine Los ADN se diferencian por distintos
fluorocromos y cohibridan en microarrays de ADN.