Resumo biomol diagnostica 2

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Resumo de biologia molecular diagnostica2, abordando conceitos de clonagem, vetores utilizados, metodos, sequenciamento do DNA e etc

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Resumo biomol diagnostica 2

  1. 1. Biomol Diagnostica II 1 Biomol Diagnostica II 2Recordando....Os Nucleotídeos são formados por: base nitrogenada + açúcar (desoxirribose - pentose) + fosfato. I) Nucleases – rompem pontes fosfodiester, ocorre nas duas fitas de DNA. a) Exonuclease – removem nucleotídeos das extremidades de fita de DNA, essas enzimas são tempo dependente, qto mais expor a enzima ao DNA mais nucleotídeos serão retirados. b) Endonucleases – rompem pontes fosfodiéster de dentro da cadeia de DNA (enzimas de restrição). ligação fosfodiéster  Base nitrogenada Obs.: As bactérias não tem seu DNA quebrado por essas enzimas pois ele é metilado, as enzimas de As bases nitrogenadas são unidas por pontes de hidrogênio restrição reconhecem as duas fitas para corta-las (fitas são parlindromes). Grupo fosfato Extremidade 5’  Açúcar (pentose) Todo grupamento novo de nucleotídeo é  se tivesse um oxigênio aqui é RNA (ribose) adicionado aqui na hidroxila (extremidade 3’)As fitas de DNA são ligadas através das pontes de hidrogênio. As bases nitrogenadas ficam na parte interna e ogrupo fosfato para fora.O grupamento fosfato é ligado a hidroxila do açúcar por meio da ação da DNA polimerase, formando a pontefosfodiéster.A nova fita sintetizada sempre será no sentido (fosfato) 5’ 3’ (OH livre do açúcar), assim o novo nucleotídeo seráadicionado à hidroxila livre do açúcar.Condições das enzimas in vitro: figura 1.1Toda e qlq enzima necessita de um tampão apropriado para agir, esse tampão precisa conter: Fatores que influenciam a atividade das enzimas de restrição: composição do tampão, concentração • tampão – mantém a proteína dentro de uma faixa de pH. da enzima, temperatura, metilação do DNA. • sal (NaCl) que estabiliza a PTN. • íons divalentes (Mg++) requeridos para a atividade enzimática. o Endonucleases sem especificidade (quebra pontes fosfodiesteres aleatoriamente), ex.: • glicerol (para estoque), vem na enzima estabiliza a estrutura da enzima, não deixando que a estrutura DNAse I primaria seja perdida pela formação de cristais de gelo. • EDTA – agente quelante de íons positivos (vem dentro do tubo da enzima), quelar é se ligar a uma substancia II) Ligases roubando-a da solução. a) Ligases – restabelece as pontes fosfodiester (na presença de ATP) Todas as DNA ligases requerem um fosfato no terminal 5’ e um OH livre no terminal 3’ para formação da ponte fosfodiéster.Condições das enzimas em vivo – temperatura, pH, cofator ou coenzima. b) Polimerase – promove replicação do DNA a partir de um molde (fita simples).Enzimas modificadoras do DNA Só ocorre no sentido 5´ 3´da fita de DNA. • Nucleases – fragmenta a molécula de DNA de maneira aleatória • Ligases – unem fragmento de DNA (dupla fita) refazendo a ligação fosfodiester o DNA polimerase I Holoenzima (mais de um domínio catalítico e mais de uma atividade • Polimerases – sintetizam novas moléculas de DNA (utilizando um molde) enzimática, 1º atividade – polimerase 5’ 3’, 2º e 3º atividade exonuclease 5’ 3’ e 3’ 5’ • Fosfatases e quinases – adicionam ou removem grupamento de fosfato. reparo erros do DNA).
  2. 2. Biomol Diagnostica II 3 Biomol Diagnostica II 4 o Klenow fragment: Passos necessários para a clonagem: - Preenchimento da extremidade simples de DNA – qdo vc fornece os nucleotídeos a) Isolar o fragmento desejado (por PCR ou digestão com enzimas de restrição). prevalece o dominio de polimerase completando a fita simples. b) Seleção do vetor apropriado (plasmídeo, fago, células eucarióticas). c) Ligação de vetor-inserto (DNA vetor + DNA inserto = DNA recombinante). - Digestão de extremidade fita simples – qdo vc não coloca os nucleotídeos o domínio de d) Escolha da célula hospedeira. exonuclease prevalece retirando os nucleotídeos de fita simples. e) Inserção do vetor na célula hospedeira.O que determina a função de uma enzima é sua estrutura espacial (tridimensional). As Taqs diferem entre si pela f) Seleção dos clones recombinantesestrutura tridimensional. Porque clonar um fragmento ao invés de utilizar o PCR ? o DNA polimerase III - 5´-3´polimerase ● Armazenamento - por meio da clonagem é possível armazenar o DNA para utilizar futuramente. Enquanto o o DNA polimerase termoestável (Ex: TaqDNA polimerase) mesmo DNA em um tubo de PCR com o tempo irá se deteriorar. ● Sequenciamento – para a realização do sequenciamento a molécula de DNA precisa estar clonada (ligada a umQuinases – Transferem/adicionam grupamento fosfato para uma molécula de DNA. Sempre 5’ 3’. São usadas na vetor)preparação do DNA para a ligação e na marcação de DNA. ● Proteína – produto resultante do gene clonadoFosfatases - Catalisam remoção de fosfatos das extremidades 5’ do DNA. Ao remover o grupo o DNA é desforilado e O objetivo final da clonagem dificilmente é apenas obter um número grande de cópias de um fragmento de DNA,assim é impedido de realizar novas ligações. Usado no tratamento do vetor antes da ligação com o inserto, assim ele seu emprego é múltiplo.não se ligará sozinho sem o inserto. O método de clonagem se baseia na replicação da fita utilizando a maquinaria existente em uma célula hospedeira. O Vetor deve:Corrida de gel - Permite a estabilização da molécula na célula hospedeiraO gel de poliacrilamida é bem mais delgado, em comparação com o de agarose, e produz poros bem menores (malhamais fina). Assim o gel de poliacrilaminda tem uma resolução maior, isto é, é capaz de diferenciar ‘mais’ as pb de - Permite a replicação da molécula na célula hospedeirabases, de até 1 pb. Também é utilizado na corrida de gel de RNA. - Permite a identificação da molécula na célula hospedeiraO DNA é marcado com brometo de etídeo na corrida de gel; O brometo se intercala nas pontes de hidrogênio. Os vetores podem ser de clonagem ou de expressão. Os de expressão apresentam toda a parafernália do deÉ possível purificar os fragmentos de DNA direto do gel. Corta-se o pedaço desejado com um bisturi e aplica-se uma clonagem com alguns ‘extras’ que permitem a expressão do produto gênico.substancia capaz de digerir a molécula de agarose.SMEAR é o padrão de corrida ‘arrastado’. Muito comum no DNA genômico, por causa do tamanho do DNA. Por serum DNA muito grande, e sua digestão produz muitos diferentes tamanhos fica difícil diferenciar um do outro por Características essenciais nos vetores:estarem muito próximos. ● Polylinker ou síƟo de restrição (região que contém vários sítios para enzimas de restrição) ● Origem de replicação pra DNA polimeraseClonagem gênica – inserção dos vetores na célula hospedeira ● Método de seleção da bactéria recombinante, por exemplo, gene de resistência a algum antimicrobiano b.VetoresClonagem: 1. Plasmídeos 4. Bacteriofagos • Proporciona a produção de copias de uma molécula de DNA em larga escala. 2. Fagos 5. Outros vetores (BAC e YAC) • É feito a partir de um DNA recombinante – DNAs de origens diferentes. • Utiliza um vetor, que identificação, replicação e estabilização do inserto. 3. Cosmídeos
  3. 3. Biomol Diagnostica II 5 Biomol Diagnostica II 6 meios contendo o antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência, como forma de seleccionar as bactérias resistentes (ou seja, transformadas). Desenvolvem-se então colónias de bactérias com o plasmídeo recombinante.Os vetores de clonagem molecular são moléculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cópias, ainformação genética que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vetores possuindo cada um particularidades 2)FAGOSque lhe são próprias. O fago mais utilizado na clonagem molecular é o bacteriófago λ que se comporta como um vírus da E. coli. É assim, uma partícula viral constituída por proteínas e DNA em igual quantidade, e que se apresenta como 1)PLASMÍDEOS uma molécula linear de cadeia dupla (cerca de 48.500 pares de bases). É injetado na célula hospedeira por possuir a particularidade das suas extremidades (sítio cos) serem de cadeia simples, constituídas por cerca Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA de cadeia dupla, que de 12 nucleótidos que, sendo complementares na sequência de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma contêm os elementos necessários à sua replicação e um gene que confere circular antes da sua inserção. O genoma do fago λ codifica para 50 proteínas, aproximadamente. resistência a um antibiótico. Podem estar presentes em duas ou mais cópias na célula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este plasmídeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, são utilizados como vetores de clonagem. Para isso, têm que possuir certas propriedades: ▲ Figura 3: Clonagem em bacteriófagos λ. O vector contém • Ter uma origem de replicação, que consiste numa sequência de DNA um sítio de restrição (por exemplo, para EcoRI) para que permite a replicação do vetor na célula hospedeira; Figura 1 - Plasmídeo. Plasmídeo com inserção do DNA clonado. Adicionalmente, sítios cos, • Possuir Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), ou seja, vários locais sequências que conferem resistência à necessários para o empacotamento do DNA nos fagos, estão únicos de clivagem para endonucleases de restrição, os quais ampicilina e tetraciclina. Apresenta ainda uma origem de replicação (ori) e sítios de presentes em ambas as extremidades do vector de DNA. O constituem o sítio de inserção no vetor de clonagem; restrição para a EcoRI, SalI e PstI. DNA inserido é ligado ao vector e as moléculas • Conter um gene que codifique uma substância que possa distinguir recombinantes são empacotadas nos fagos. Os fagos uma célula transformada de uma não transformada. Muitas vezes, são utilizados genes que conferem recombinantes são então usados para infectar bactérias, resistência a um antibiótico, destacando-se, devido à sua grande utilização, o gene que confere resistência à tais como a E. coli. Cada fago recombinante, que carrega um ampicilina. Assim, as células que possuem este gene são capazes de crescer em meios com ampicilina, fragmento único do DNA clonado, forma uma placa única no enquanto que as restantes não sobrevivem. interior da cultura bacteriana.Estes vetores constituem parte essencial no processo de clonagem, sendo necessária a atuação das enzimas derestrição para ligar o DNA a ser clonado ao DNA do vetor, através da produção de extremidades coesivascomplementares (ou extremidades abruptas). Seguidamente, a molécula híbrida resultante é inserida numa célula hospedeira, muitas vezes bactérias, por um processo denominado transformação. O vetor pode assim sofrer replicações e proceder à consequente amplificação do número O fago é usado na clonagem molecular por possuir certas vantagens: de cópias. Como foi referido anteriormente, estas células são identificadas devido a novas características concedidas pelo O DNA inserido é empacotado in vitro. A eficiência do empacotamento é somente de 10% plasmídeo (por exemplo, sobreviver num meio contendo um aproximadamente, no entanto, uma vez empacotado, a eficiência de inserção na célula E. coli hospedeira é dado antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência). de 100%; Figura 2: Clonagem em plasmídeos. Um plasmídeo é uma pequena molécula circular que contém uma origem de Mais eficiente que a transformação bacteriana com plasmídeos, pois esta na melhor das hipóteses tem replicação (ori), gene que confere resistência a um antibiótico 108 transformantes por μg de DNA, o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos são transformados. (no exemplo ampicilina, Amp) e sítio(s) de restrição (no exemplo, sítio de restrição para a EcoRI), o qual pode ser usado para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido é ligado ao vector e os plasmídeos recombinantes são transformados em bactérias, tais como aE. coli. As bactérias são plaqueadas em
  4. 4. Biomol Diagnostica II 7 Biomol Diagnostica II 8 Virulentos: ciclo lítico Temperados: ciclo lisogênico + ciclo lítico 3)COSMÍDEOS O aparecimento da clonagem em cosmídeos deu-se para ultrapassar algumas limitações da clonagem em fagos 5)OUTROS TIPOS DE VECTORES e plasmídeos. No fago λ, os fragmentos de DNA a serem inseridos não podem ultrapassar os 15 kb, e, apesar de, • BAC (cromossoma artificial bacteriano): derivado de plasmídeos naturais de E. coli, denominado de por vezes, ser o suficiente para conter um gene completo com as suas sequências limitadoras, na maior parte factor F. A origem de replicação e as outras sequências do factor F, permitem a sua replicação das vezes, os genes são de maiores dimensões (35 a 40 kb) o que torna impossível a sua inserção. enquanto plasmídeosestáveis, possuindo inserções de 120-300kb. Devido à sua estabilidade, Os cosmídeos são assim, plasmídeos (com origem de replicação e genes que conferem resistência a antibióticos), capacidade de aceitar grandes fragmentos de DNA e facilidade de manuseamento, são agoraque contêm um fragmento de DNA do fago λ incluindo o local cos. São utilizados como veículos de clonagem os vectores de clonagem preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos.molecular através do empacotamento in vitro (técnica já referida na clonagem em fagos, que, neste caso, reconstituia estrutura do fago em cabeça e cauda, sendo assim utilizado para infectar a célula hospedeira). As enzimas de • YAC ( cromossoma artificial de levedura): contém origens de replicação de leveduras e outrasempacotamento reconhecem dois locais cos com distância de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos sequências (centrómeros e telómeros), quepassíveis de serem empacotados. Assim, o DNA é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes permitem a sua replicação como moléculasfragmentos de DNA que se vão ligar ao cosmídeo anteriormente clivado com uma enzima semelhante. Numa lineares do tipo cromossómico em célulassituação ideal, cada fragmento de DNA genômico possui um local cos nas suas extremidades que, durante o de levedura.empacotamento, vão ser reconhecidos por enzimas (caso estes locais estejam situados a uma distância de 49 kb). ▲ Figura 5: YAC. Os YAC (Yeast ArtificialSeguidamente, uma vez injetado no interior da célula hospedeira, vai circularizar e replicar como um plasmídeo Chromossome) permitem a clonagem denormal, sem exprimir qualquer função do fago, sendo igualmente reconhecido com base na resistência adquirida a moléculas de DNA relativamente grandes.um antibiótico específico. TEL, CEN e ORI correspondem a telómero, centrómero e origem de replicação, respectivamente, para a levedura Saccharomyces cerevisiae. BamHI e EcoRI correspondem a sítios de restrição para as respectivas enzimas de restrição. As sequências A e B codificam enzimas que servem como marcadores de selecção, permitindo um fácil isolamento das▲ Figura D4: Esquema de clonagem em cosmídeo. leveduras que apresentarem o cromossoma artificial.4. BacteriófagosParasitos celulares - para se reproduzirem precisam infectar umacélula. Interação célula-vírus é específica. Bacteriófagos - vírus que infectam bactérias c. Ligação de vetor-inserto Vírus vegetais ou animais - infectam células animais ou A reação de ligação entre vetor (ex.: plasmideo) e inserto (o vegetais. fragmento de DNA) é feito através de uma enzimaA informação genética dos vírus pode estar contida em moléculas chamada DNA ligase(pag.2) que ira unir o vetor e o inserto.de DNA ou de RNA. Exemplos: Para que essa ligação ocorra disponibilizamos de alguns RNA - R17, MS2, f2, Q artifícios, as extremidades do inserto e vetor podem ser coesivas e blunt (ver pagina 2, figura 1.1), a fim de evitar DNA circular ss - φX174, M13 ligações inespecíficas (extremidades coesivas). DNA circular ds - T4, T5, T7, P1, λ A ligação com extremidade blunt requer mais gasto de energia para que ocorra. A reação de ligação é feita em umOs bacteriófagos podem ser:
  5. 5. Biomol Diagnostica II 9 Biomol Diagnostica II 10termociclador com temperatura, tampão ideais para o funcionamento da enzima. ladorO plasmideo vem “fechado” então precisamos abri lo com uma enzima de restrição, a escolha dessa enzima é abri-lobaseada no sitio de clonagem (polylinker) que o plasmideo possui, para tanto o fa bricante nos fornece o mapa do fabricanteplasmideo(figura 1.3). Para evitar a re-ligação do vetor depois de ser “digerido” pela enzima de restrição, o vetor pode ser tratado com uma enzima a fosfatase, ela desfosforila (tira fosfatos) evitando assim sua religação.Se vc tiver um vetor com a extremidade coesiva e seu insertofor blunt ou vice-versa podemos fazer uso de adaptadorespara que essa ligação ocorra(figura 1.4). Para essa reação éultilizado a enzima T4 DNA ligase. Figura 1.4 Figura 1.3 – Mapa de um d. Células hospedeiras plasmideo. Tipos de células hospedeira: - Células eucarióticas: leveduras, células de ou organismos tecidos variados - Células procarióticas: bactérias d. Inserção do vetor na célula hospedeira Para inserir o vetor recombinante na célula hospedeira essa precisa de um tratamento que pode ser: • Transformação - a célula hospedeira é tornada quimicamente competente para o vetor de clonagem ser introduzido. Se as DNAs polimerases da célula hospedeira reconhecerem os sítios de replicação do DNA exógeno, a bactéria vai replicar o DNA exógeno junto com seu próprio DNA. As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio e sofrem um choque térmico. Os íons cálcio têm a função Figuras 1. 2 – Passos para inserir o de neutralizar as cargas negativas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela inserto no vetor. membrana no momento do choque térmico. Figura 1.5 – Os pontos vermelhos representam o cloreto de cálcio que se ioniza (em Cl- e Ca2+), o Ca2+ será atraído pela parede bacteriana (que é neg), formando uma película que promove a aproximação do DNA
  6. 6. Biomol Diagnostica II 11 Biomol Diagnostica II 12 exógeno (plasmideo) que possui carga neg. • Eletroporação - a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido A eletroporação é uma inserido. técnica na qual se misturam bactérias e o vetor num único tubo e aplica-se um choque e se elétrico na mistura, com o objetivo de desestabilizar a membran e permitir a entrada do vetor na bactéria. Ela é então tivo membrana rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37ºC para que se possa recuperar após o choque. • Transfecção - quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser transfectada para receber a molécula recombinante São utilizados fagos geneticamente modificados recombinante. utilizados como vetor. Foram mantidos genes essenciais a reprodução vira viral.Crescimento em meio líquido de cultura - Incubação à 37ºC com agitação durante 1 hora, Sem antibiótico. No Para que o DNA seja injetado na cel hospedeira ele precisatubo, crescerão todas as bactérias viáveis (com e sem plasmideo recombinante). estar dentro do fago. Um vírus precisa ser montado em volta do DNA in vitro (figura ao lado). Após isso coloca-se as bactérias em meio de cultura liquido se juntamente com os fagos, e induz o ciclo lisogênico , (integração do DNA recombinante do fago no DNA da bacteria) essa indução é feita com a temperatura a 37ºC 37ºC. Depois essa cultura de meio liquido é plaqueado em meio de cultura semissólido pois assim tem maior motilidade motilidade. O meio sólido contém: Antibiótico,X-Gal, Infecção ou tr transfecção IPTG, Incubação durante 18 horas a 37ºC. 1. O fago injeta o DNA na Placa com os clones, colônias azuis bactéria. sem o plasmideo recombinante, 2. Esse DNA é replicado colônias branca presença do 3. Dentro da cel começa a plasmideo recombinante ser montado as partículas fagicas, e o DNA recombinante é encapsulado. 4. Com isso ocorre a lise da célula hosp e a liberação dos fagos no meio de cultura (semi (semi-solido) e eles podem infect outras bactérias. infectar Essa figura é oq ocorre no meio de cultura semi solido. O ciclo lítico (lise da semi-
  7. 7. Biomol Diagnostica II 13 Biomol Diagnostica II 14 célula bacteriana) é induzido por temperatura a 42ºC. Como preparar um sistema recombinante Nessa figura podemos observar que após o crescimento das a. Isolar e preparar o DNA ou cDNA - Por clivagem com enzimas de restrição ou PCR, fazer a reação de A B bactérias + fagos vc tem um tapete de bactérias(A). Depois de transformação ou transfecção um certo tempo é possível observar mais halos na placa isso mostra que esta ocorrendo o ciclo lítico (B). C e D mostra o ciclo lítico com o passar do tempo. O fago recombinante produzirá durante a cultura placas de lise com o centro claro morfologicamente fácil de ser visualizada. Escolher o sistema apropriado – escolher o vetor de expressão (que contenha origem de replicação, promotor, Após isso é possível recortar os halos com uma ponteira, sitio polylinker, sitio de ligação do ribossomo, sitio de purifica-los e utilizar o DNA recombinante dos fagos. poliadenilação - terminador, marcadores seletivos – antibióticos e um gene reporter).Após a transformação, as bactérias são incubadas em condições adequadas para que se possam multiplicar e, aseguir, plaqueadas em meio sólido, para que se possam isolar colônias. A identificação das colônias recombinantes éfeita utilizando as características conferidas pelos plasmídeos. Assim, se foi utilizado um plasmídeo que confereresistência ao antibiótico A, podem isolar-se as colônias que foram transformadas simplesmente plaqueando-as nummeio de cultura com antibiótico A (as bactérias não transformadas não terão resistência ao antibiótico e morrerão).Uma vez identificadas as bactérias que contêm o vetor recombinante de interesse de entre as várias colônias b. Escolher o sistema apropriadoplaqueadas, basta transferir a colônia para meio líquido para que se obtenham milhões de cópias da bactéria e, Características avaliadas em cada sistema de expressãoconsequentemente, do vetor recombinante desejado. Através da reação de extração de DNA chamada mini-prep. Taxa de crescimento celular, Complexidade do meio de cultura, Custo do meio de cultura, Nível de expressão, Capacidade de expressar extracelularmente, Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como: dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação.Expressão de proteínas recombinantes em cels hospedeirasUso de uma célula para produção de uma proteína de outro organismo Vantagens dos sistemas de expressão eucarióticos Desvantagens dos sistemas de expressão eucarióticosPor que produzir proteínas recombinantes? Pesquisa em estrutura e prots, imunização, produção de AC, farmacos(vacinas, hormônios, fatores de coagulação etc). Dobramento das proteínas mais semelhantes Níveis de expressão mais baixos Adequado para proteínas ricas em cisteinas-pontes Poucos vetores disponíveis dissulfetoJustificativa da expressão de proteínas recombinantes Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o Necessita de equipamentos adequados uso de equipamentos próprios (fermentadores) • Dificuldade de se purificar do tecido original • Proteínas do tecido podem estar contaminadas • Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas (modificadas) Vantagens dos sistemas de expressão Bacterianos Desvantagens dos sistemas de expressão Bacterianos • Processo completamente controlado • Especificidade Facilidade no crescimento e purificação Não há modificações pós-transducionais (glicosilação, • Quantidade ribosilação, acetilação)
  8. 8. Biomol Diagnostica II 15 Biomol Diagnostica II 16Várias cepas e plasmídeos comerciais Tamanho do cDNA limitado e. Checar se a proteína foi expressa e se está solúvelComparativamente barato Não realiza secreção de proteínas Através de géis de poliacrilamida vc verifica a produção da proteínaSistemas de expressão bem conhecidos Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias. Se a proteína não for expressa – sequenciar o inserto e alterar os níveis de indução de expressão.Tecnologia relativamente simples Dobramento incorreto das proteínas f. PurificarEscolha do sistema – hospedeiros Fazer um extrato proteico – solubilizar as proteínas (dissolvidas em solução aquosa) desnatura desnatura-las conferindo cargaBactérias Gram-negativas – E. coli negativa.Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis Selecionar o clone de expressão e crescer em meio liquido com IPTG (indutor) para produzir a proteína, fazer o extrato proteico (proteínas totais) correr o gel em acrilamida.Leveduras – Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris omyces Vetor de expressão possui um gene reporter (GST ou His His Histidina) que ajuda na purificação por cromatografia de naFungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma afinidade (gruda na resina-prot repórter). protCélulas de mamífero GSTPlantas e animais transgênicos Vem antes da proteína recombinante, a resina tem a afinidade (AC GST ou glutationa), serve para proteínas completas c. Transformar hospedeiro -Eletroporação, transformação, transfecção etc. Eletroporação, pGEX – Glutationa S-Transferase - agarose agarose-glutationa 7X His his histidina d. Selecionar hospedeiro transformado Fica depois da proteina recombinante, não é uma proteína completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo níquel. a Uso de proteínas em fusão ou repórter: Existência de um gene em região anterior ao inserto que servirá como “isca” na purificação purificação Existência, na região posterior ao inserto, de uma cauda de Poli Poli-histidina Seleção Antibióticos: Ampicilina , Kanamicina, Cloranfenicol, Tetraciclina, Gentamicina, pQE, pET – tag de Histidinas - coluna de níquel Higromicina . Gel de poliacrilamida Vc faz o extrato celular da clonagem, soma o tamanho da tamanho da proteína (gene reporter + inserto) Seu controle negativo será o extrato celular sem o vetor de expressão para saber se sua proteína foi expressa. Seu controle positivo será a proteína purificada (Inserto + gene repórter) Purificação - Passar as proteínas - Lavar a coluna
  9. 9. Biomol Diagnostica II 17 Biomol Diagnostica II 18 - Eluir a proteína de interesse Vc pega o RNA total do organismo, seleciona o RNAm (que contem o oligo DT, para isso vc utiliza primers que tem cauda de poli A, dessa maneira só ira selecionar os RNAm), a partir do RNAm faz um RT-PCR com a enzima - Digestao com a protease trombina que separa o gene reporter da proteína de interesse transcriptase reversa, obtendo assim cDNA (sem introns – informação certa para codificação de prots), a partir do - Passar na coluna novamente e eluir (proteína de interesse) cDNA vc pode liga-lo no vetor de expressão apropriado. - Correr um gel para ver se deu certo Obs.: cada clone obtido ira expressar uma proteína diferente. Vantagem vc so terá oq é codificante só éxons, sem introns.Construção de bibliotecas genômicasÈ uma coleção de DNAs recombinantes Caracterização dos clones recombinantes de bibliotecas genômicas de DNAPara isso é necessário isolar as sequencias de interesse do gene + as regiões responsáveis pelo controle da sua Identificar os clones de cDNA (biblioteca genomica)expressão. 1° seleção ocorre durante a elaboração da clonagem (dupla seleção antibiótico e X-gal e IPTG).Os fragmentos são clonados em uma única clonagemPode ser de 2 tipos: 2° seleção a. biblioteca expressão (proteína) selecionada reação Ag-AC (western blot) Disso depende o Biblioteca genômica modo de screening b. biblioteca DNA somente – identificação com hibridização de DNA (sourthern blot) Total: é representativa de todo o conteúdo genético do tipo celular que se deseja estudar Parcial: contém parte do conteúdo genético do tipo celular que se deseja estudar a. biblioteca expressão – clones numa placa é feita a replica da placa com uma membrana de nitroceluloseBiblioteca de cDNA (marca a membrana com furos pra saber qual colônia foi), depois trata a membrana com solução de SDS (detergente) para lisar as bactérias e as proteínas se aderirem a membrana, a partir disso fazer o imunoblot. b. biblioteca DNA – Utiliza-se uma membrana de nylon fazendo uma replica da placa, lisar as bactérias naFinalidade - O isolamento da porção do DNA genômico que contenha toda a unidade de transcrição, mais as regiões membrana (para que o DNA grude),colocar uma solução desnaturante na membrana (DNA simples fita),flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expressão desse gene. hibridizar com uma sonda (radioativa ou fluorescente), e revelar.Tamanho - O tamanho necessário de uma biblioteca genômica, para que um dado fragmento de interesse estejaentre os fragmentos clonados, é determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Sequenciamento do DNApassos necessários Método de Sanger - manual Isolamento e digestão do DNA – fragmentar a sequencia com enzimas de restrição ou O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a mecanicamente (fragmentos aleatorios) molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e Utilização de vetores apropriados – grandes fragmentos (YAC’s, BAC’s, cosmideos e fagos) desvantagens. Ligação dos fragmentos no vetor – os diferentes fragmentos são clonados na mesma clonagem Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de (colocar uma boa quantidade do vetor e inserto). Calcula-se a probablilidade de cada fragmento “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia diferente ser ligado. Ex.: 10.000pb quebra-se em 10 partes, 5xn° de fragmentos -> 5x10= 50 clones consiste em identificar,continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita Inserção na célula hospedeira – transformação ou transdução detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa” (fig 1).Construção de biblioteca de cDNA
  10. 10. Biomol Diagnostica II 19 Biomol Diagnostica II 20FIG 1 possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel. O resultado e as etapas do processo descrito acima, frequentemente mostrado em fotografias nos livros especializados, podem ser observados no esquema da Fig. 3. Método automatizado O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs” que lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência fig 4a. ComoA reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destesde uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e realizada em um único canal do gel de sequenciamento fig 4b. O sinal fluorescente diferencial emitido por cadadTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou ; um dos mais utilizado é o dATP ³²P (fig 2a). Como fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento dea enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador fig 4c. Variáveisde um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusãodo DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNApartida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá serutilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que FIG 4ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade deum (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs)(fig 2b).FIG 2Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem Organismos geneticamente modificados X transgênicos3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos osnucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA- - Organismo geneticamente modificado - Todo o organismo cujo material genético foi manipulado de modo apolimerase insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto favorecer alguma característica desejada, Isolamento (melhoramento genético clássico) de características desejáveisem que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos de espécies afins e também de espécies distintas. assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o - Organismo transgênico - Qualquer organismo que, por meio de engenharia genética, recebe e expressa genes análogo foi adicionado, são separados por tamanho provenientes de outros organismos. Fig. 3 em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de análise para cada reação. O gel é “transferido” para um suporte de nitrocelulose (filtro). Organismo geneticamente modificado: Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na - Há registros, de 4 mil anos, da produção organismos geneticamente modificados, principalmente na cultura do cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada milho . e obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada: que serviu de “molde”. - Insulina – 1982 - Produzida por uma bactéria geneticamente modificada Levando estas observações em consideração, é
  11. 11. Biomol Diagnostica II 21 Biomol Diagnostica II 22Aplicação dos transgênicosPESQUISA BÁSICA: estudo e regulação e função de sequências genéticas específicas· PESQUISAS BIOMÉDICAS: criação de modelos “animais com doenças humanas”· PESQUISAS DE DOENÇAS GENÉTICAS: animais com mutações· INDÚSTRIAS BIOTECNOLÓGICAS: produção de proteínas, enzimas, hormônios e fatores de crescimentos poranimais domésticos ANEXO1 Padrão de integração e eficiência do processo: VETORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICA A integração do DNA ao genoma da célula parece Atualmente, os vetores mais utilizados na construção de bibliotecas genômicas são fagos λ e cosmídeos. Em ambos ser aleatória os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por fragmentação aleatória, ligam-se ao DNA do vetor para poderem Apenas 10 a 30% dos ovos sobrevivem e, destes, ser empacotados em partículas de fago λ. 40% apresentam o DNA exógeno integrado As bibliotecas construídas com vetores λ são armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. Estes vetores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais. O fragmento ou braço esquerdo, codifica as proteínas da cápsula, e o braço (fragmento) direito, tem a origem de replicação do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braços estão os sítios de restrição usados na clonagem, orientados inversamente – SalI, BamHI, EcoRI –. A extremidade de cada braço apresenta um segmento de cadeiaPadrões de expressão dos transgenes: Geralmente corresponde ao padrão do gene endógeno Pode ser direcionada endógeno, simples (cos). Estes segmentos são complementares entre si, permitindo assim a recircularização da molécula ea tecidos específicos. consequente replicação do fago dentro da célula hospedeira.Riscos X Benefícios ▲ Figura D6: Estrutura do vector λ EMBL3. S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI. • Provocar mutações genéticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo. • Elevar o valor nutricional dos alimentos • Plantas resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produção de 15 a 30% • Vegetal capaz de produzir uma proteína animal até mesmo humana (hormônio, insulina, vacinas, enzimas) para fins farmacêuticos Este tipo de vetor é chamado vetor de substituição porque, no processo de clonagem, a parte central do DNA do fago é substituída pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando deste modo a molécula recombinante. Os fragmentos clonados são ligados aos braços do fago, previamente preparados com BamHI, sendo esta mistura empacotada in vitro em partículas víricas. Para se selecionar apenas os fagos recombinantes, estes são infectados numa bactéria lisogênica. A suspensão de fagos resultante pode ser armazenada durante vários anos num frigorífico, com algumas gotas de clorofórmio para prevenir o crescimento bacteriano, embora a concentração do número de partículas infecciosas vá baixando gradualmente. A biblioteca também pode ser armazenada por congelamento da mistura de ligação (fragmento de DNA/vetor). Na clonagem em cosmídeos, as partículas virais servem apenas como veículos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactéria e uma vez dentro dela o cosmídeo comporta-se como um plasmídeo grande. Os cosmídeos podem aceitar inserções de cerca de 45 kb, quase 2 vezes o tamanho das inserções clonáveis num fago λ. Assim, quando um cosmídeo é utilizado como vector, apenas são necessários 350.000 recombinantes
  12. 12. Biomol Diagnostica II 23 Biomol Diagnostica II 24para se atingir 99% de probabilidade de uma sequência de cópia única estar presente numa biblioteca genómica de 5- A T4 ligase permite a ligação das moléculas de cDNA ao vetor;mamífero. 6- O produto da ligação junta-se com as proteínas que formam o capsídeo do fago;No entanto, as bibliotecas de cosmídeos são mais difíceis de construir e de manter que as bibliotecas de fagos.Assim, os cosmídeos são utilizados quando o gene de interesse é muito grande ou quando se deseja uma região 7- Os fagos assim produzidos vão infectar bactérias de uma linhagem que favoreça o crescimento dosextensa de DNA; o uso de vectores λ é mais recomendado no isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em recombinantes;circunstâncias em que a biblioteca vai ser utilizada muitas vezes. 8- A biblioteca é obtida após infecção da bactéria com os cDNA recombinantes, devendo conter cópias de todas asO método utilizado para isolamento de clones genômicos específicos tem sido frequentemente o de rastreio sequências de mRNA da população original.por hibridização com uma sonda, normalmente uma sonda de cDNA. A amplificação direta de fragmentos de DNApor PCR é agora igualmente comum. 9- Pode depois ser congelada ou ser submetida a um processo de isolamento do clone de um determinado gene de interesse. Considerando que as moléculas de cDNA representam o mRNA total de um organismo ou tecido específico -VECTORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE cDNA expressão genética – estas bibliotecas são muito úteis para obter genes diferencialmente expressos. Para isso, procede-se ao isolamento de genes expressos apenas em determinados tecidos, ou de genes expressos em estádiosApós ter sido obtido o cDNA, é necessário prepará-lo para ser inserido num vetor de clonagem, processo que específicos de desenvolvimento ou em determinadas condições ambientais. Pode-se assim construir bibliotecasdepende do vetor escolhido: plasmídeo ou fago. através de hibridização subtrativa. Estas bibliotecas são enriquecidas em genes expressos diferentemente em • O fago é mais utilizado devido à sua elevada eficiência: comparativamente com os plasmídeos, requer cerca determinadas condições selecionadas: de 16 vezes menos cDNA por μg do vector para produzir um número equivalente de clones recombinantes; Obtêm-se preparações de duas populações de mRNA (ligeiramente)diferentes como por exemplo, células do • As bibliotecas de fagos são mais fáceis de manipular que as bibliotecas de plasmídeos; mesmo tipo mas cultivadas a temperaturas diferentes; • No entanto, os fagos não são favoráveis para procedimentos de sequenciamento de DNA e de mutagénese dirigida. A primeira cadeia de cDNA de uma das populações de mRNA é preparada e depois hibridada com umPara ultrapassar esta limitação idealizaram-se os fagemídeos que são plasmídeos contendo porções do genoma excesso da outra população de mRNA;do fago, reunindo assim as vantagens dos dois vetores.Para efetuar a ligação entre o vetor e o cDNA são necessários alguns procedimentos preparatórios, como por Ocorre a formação de híbridos entre o cDNA e mRNA complementares, respeitantes a genes das duasexemplo polir as extremidades das moléculas de cDNA de cadeia dupla com a enzima Klenow, de maneira a ficarem populações;blunt e ligadas a locais blunt de vetores de clonagem. A cromatografia em colunas de materiais que ligam especificamente moléculas de cadeia dupla, permitirá aNo entanto, este processo não se revela muito eficiente, existindo outros que transformam as extremidades do remoção dos híbridos;cDNA em extremidades coesivas, compatíveis com a ligação ao local de clonagem de um vetor. Estes processosconsistem na adição de adaptadores, sendo o seguinte método um exemplo destes: O cDNA específico da primeira população permanece em cadeia simples e não se liga à coluna;1- Metilação dos sítios de EcoRI com o tratamento do cDNA com EcoRI, na presença de S-adenosil metionina. Éessencial para proteger os sítios de EcoRI que possam existir no cDNA, contra a digestão da EcoRI, que se vai realizar Depois é utilizado para a preparação de uma biblioteca de cDNA enriquecida em determinados genesuns passos à frente; específicos ou marcado radioativamente para ser utilizado diretamente como sonda, para se proceder ao2- Adição de adaptadores, com o sítio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Estes adaptadores são pequenos rastreio de uma biblioteca de genes.oligo-nucleotídeos que têm uma extremidade em cadeia dupla, ligando-se às extremidades do cDNA, e têm outraextremidade coesiva, igual à produzida por uma enzima de restrição, permitindo a ligação a um vector preparadocom a mesma enzima de restrição. Esta adição de adaptadores resulta na obtenção de moléculas de cDNA com BIBLIOTECA GENÔMICAadaptadores múltiplos ligados nas duas pontas; Uma biblioteca genômica deve conter várias cópias/clones representativos de cada fragmento de DNA para3- Apenas é produzido um sítio de EcoRI em cada ponta do cDNA pela digestão com EcoRI, libertando o excesso de aumentar a probabilidade de se conseguir isolar genes de cópia única, ou seja, a maior parte dos genes codificantesadaptadores ligados na molécula. Não ocorre digestão interna do cDNA devido à metilação previamente efetuada; de proteínas. A utilização de uma biblioteca é o modo mais eficiente para se conseguir isolar uma determinada porção de DNA. A separação da porção do DNA genômico que contem toda a unidade de transcrição com as regiões4- Através da filtração em colunas de Sephadex, o cDNA é separado do excesso de adaptadores, antes de ser limitadoras onde estão localizados os elementos controladores da expressão desse gene, permite-nos obterinserido no vetor; informações acerca da estrutura molecular de um determinado gene de eucariotas. O ponto ao qual se dá mais relevo na construção de uma biblioteca genômica é a obtenção aleatória de um elevado número de clones contendo

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