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Prova 1 resumo

  1. 1. Separação de purificação de produtos biotecnológicos 1. Introdução As biomoléculas de interesse podem ser ácidos orgânicos, antibióticos, polissacarídeos, hormônios, aminoácidos, peptídeos e proteínas. Etapas: 1) Clarificação: separação das células e seus fragmentos do meio de cultivo. A remoção de sólidos suspensos, constituídos de células integras e seus fragmentos, reduz a turbines do meio. Pode ser feita: Centrifugação, Filtração, Filtração tangencial, Floculação. 2) Rompimento celular: quando o produto está dentro da célula. A molécula alvo é liberada com todas as moléculas intracelulares. Homogeinização, Ultra- som, Moinho de bolas, rompimento químico ou enzimático 3) Purificação de baixa resolução: separação da molécula alvo de moléculas com características muito diferentes (água, íon, ácidos nucléicos, lipídeos). Purificação de alta resolução compreende a separação de classes de moléculas com características físico- químicas semelhantes (como outras proteínas). 4) Tratamentos finais: Há produtos cuja aplicação não requer elevado grau de pureza, de modo que operações cromatográficas não são necessárias, e a simples concentração do meio é suficiente. O aumento no numero de etapas do processo de purificação, assim como o rendimento de cada etapa, influencia no rendimento do produto final 2. Rompimento celular Com os avanços das técnicas de recombinação de DNA, varias moléculas intracelulares tem sido sintetizada a partir de procariotos e eucariotos. Considerações: tamanho da célula, tolerância a tensões de cisalhamento, necessidade de controle de temperatura, custo e rendimento do processo. Células envolvidas só por membranas celulares, como células de animais, são frágeis e rompidas facilmente sob baixas tensões. Além de poderem ser rompidas por variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra som. Por outro lado, há células com parede celular robusta, caso das microbianas e o rompimento é mais difícil. As bactérias gram positivas possuem parede mais rígida que as gram negativas. Leveduras possuem paredes celulares ainda mais rígidas. Os métodos de rompimento podem ser mecânicos (Homogeinizador de alta pressão, moinho de bolas, prensa francesa e ultra- som) , não mecânimos (choque osmótico, congelamento e descongelamento, aquecimento, secagem) , químicos ( álcalis, solventes, detergentes, ácidos) e enzimáticos (lise enzimática, inibição da
  2. 2. síntese da parede celular). A parede celular pode ser completamente rompida ou o suficiente para liberar a molécula alvo. Após o rompimento os compostos indesejados (biomoléculas e fragmentos celulares) devem ser removidos por processos de filtração, centrifugação, precipitação ou extração liquido- liquido. 2.1 Rompimento mecânico (Prensa Francesa) 2.1.1 Homogenizador a alta pressão (Prensa Francesa) Homogeinizador a alta pressão: constituído de pistões projetados para aplicações a altas pressões, forçando a passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida da colisão com uma superfície rígida e imóvel em uma câmera a alta pressão. A redução instantânea da pressão e o impacto provocam o rompimento celular sem danificar células. Esses equipamentos são indicados para romper bactérias e leveduras, e não para fungos filamentosos (bloqueiam a válvula de descarga). Porém esse tipo de rompimento causa o aumento da temperatura do meio e por isso, o equipamento deve ter um sistema de refrigeração, principalmente quando a molécula é termosensível. A quantidade de células rompidas é proporcional a pressão de alimentação (5000 a 20000 psi). Para aumentar a eficiência pode- se recircular o material (aumenta o custo, gera fragmentos bem menores, pode- se degradar a molécula). As condições de crescimento influenciam a eficiência. Células E. Coli cultivadas em meio sintético são rompidas em condições mais brandas do que as cultivadas em meio complexo (pode oferecer nutrientes essenciais para a síntese da parede celular). Crescimento rápido (µ alto) gera células com paredes celulares menos robustas. 2.1.2 Moinho de bolas É constituído por uma câmera cilíndrica fechada, horizontal ou vertical, um sistema de refrigeração e um eixo que gira em alta rotação. Nessa câmera são adicionados esferas de vidro e células em suspensão. Ocorre atrito entre esferas e as células o que causa o rompimento celular. As condições de rompimento são facilmente controláveis e a eficiência depende: i) da geometria da câmera: câmeras horizontais proporcionam maior eficiência; ii) da velocidade: quanto maior a velocidade mais rápido é o rompimento; iii) do tipo de agitador: o que transfere mais energia é o mais eficiente; iv) do tamanho das esferas: bactérias requerem 0,1mm e leveduras 0,5mm. Quanto menor o diâmetro melhor a eficiência; v) da carga das esferas: as esferas devem ocupar de 80 a 85% do volume da câmera horizontal e 50 a 60% do volume da câmera vertical. Carga muito
  3. 3. pequena não proporciona colisão e carga muito grande faz que esferas colidam com esferas; vi) da concentração celular: 30 a 50% do volume da câmera; vii) da velocidade de alimentação: a fração de células rompidas diminui com o fluxo de alimentação, pois diminui o tempo de residência no rompedor; viii) da temperatura: recomenda- se o rompimento entre 5 e 15 graus, para os moinhos de bolas devem possuir mantas de resfriamento 2.1.3 Ultra- som O rompimento por ultra- som ocorre quando ondas sonoras são convertidas em vibrações em um meio liquido, gerando bolhas pequenas, as quais entram em colapso com o passar do tempo, gerando impacto e rompimento celular. Método muito utilizado em escala de laboratório e inviável em grande escala. A energia ultra- sônica é gerada por um aparelho chamado sonicador e transmitida por uma sonda. O aumento da temperatura deve ser controlado. 2.2 Rompimento não mecânico Choque osmótico, congelamento/ descongelamento, termólise 2.2.1 Choque osmótico Para o rompimento celular em meio com alta pressão osmótica, as células devem ser mantidas por 30 min em meio cuja concentração de sacarose seja de 20%, separadas por centrifugação e ressuspendidas em água destilada a 4 graus. O choque não rompe a célula integralmente mas propicia uma permeabilidade seletiva, onde algumas proteínas podem ser liberadas para fora da célula. Essa técnica reduz a quantidade de contaminantes para ser retirado em técnicas posteriores. Muito indicado para gram- negativas (parede celular mais sensível). 2.2.2 Congelamento/ descongelamento A célula passa por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, com isso, há formação de grandes cristais de gelo que perfuram a célula e liberam a molécula alvo. Indicado para rompimento de patógenos. Não indicado para a obtenção de biomoléculas sensíveis. Estoca- se células a -27 graus por 7 dias (demorado). 2.2.3 Termólise A suspensão celular pode ser aquecida em banho termostatizado, com injeção de vapor direto. Processo amplamente utilizado em larga escala, para o rompimento de algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias. 2.3 Rompimento químico
  4. 4. 2.3.1 Álcalis Rompimento celular com adição de álcalis (Amonia e hidróxido de sódio) é recomendado quando a biomolécula alvo é estável a pH básico. Geram poluentes. Ajusta- se o pH básico e depois de um tempo reduz o pH para ácido e centrifuga o homogeinizado. 2.3.2 Detergentes Os detergentes dissociam proteínas e lipoproteínas das paredes celulares, provocando poros ( ou rompendo toda a camada) por onde a molécula alvo é liberada. Ex: SDS. Desvantagem: podem formar espumas que desnaturam proteínas. 2.3.3 Solventes Solventes podem ser utilizados como desidratantes químicos das células. Podem ser etanol, metanol, acetona. A proteína sai junto com a água de dentro da célula? 2.3.4 Lise enzimática As enzimas são capazes de hidrolisar as paredes de células microbianas (substrato das enzimas). Esse método de rompimento é utilizado quando a molécula alvo é sensível a temperatura, tensão de cisalhamento, pressão gerada pelos métodos mecânicos. Fatores que devem ser considerados: se há presença de inibidores, se há possibilidade de fazer reciclo da enzima e a resistência da enzima ao tratamento macanico (caso em que a lise enzimática se associada com rompimento mecânico). Variáveis como pH, temp, concentração celular etc devem ser observados. Grande vantagem: alta especificidade para degradação da parede celular e associação com métodos mecânicos. Enzimas específicas podem ser usadas para liberar moléculas de interesse. Uma desvantagem pode ser o custo da enzima, além da variação do estado fisiológico do microrganismo que interfere na eficiência do rompimento. 2.4 Preservação da biomolécula alvo A molécula alvo deve ficar ativa, portanto deve- se adicionar inibidores de proteases para impedir a degradação da molécula alvo. Além disso, a liberação de ácido nucléicos e proteínas estruturais aumentam a viscosidade do meio, por isso, adição de nucleases e proteases e alteração no pH podem melhorar as características do meio, desde que não destruam a molécula de interesse. 3. Filtração e Centrifugação A clarificação, processo de separação das células e seus fragmentos do meio de cultivo, pode ser realizada por filtração convencional, a centrifugação e separação por membranas.
  5. 5. 3.1 Filtração A filtração convencional aplica-se a grandes volumes de suspensões diluídas de células. Bolores são separados normalmente por filtração, pois possuem baixa densidade o que impede a “descida” na centrifugação. O processo de filtração é descrito pela Lei de Darcy: V= kΔP/ µl, onde v é velocidade superficial, k é permeabilidade do leito, ΔP diferença de pressão, µ é viscosidade do liquido e l é espessura do leito. Auxiliares de filtração atuam reduzindo a compressibilidade e a compactação da torta de filtro, aumentando a permeabilidade do leito. Normalmente usa- se perlita ou terra diatomácea (plantas aquáticas sedimentadas), que podem ser adicionadas à suspensão inicial ou depositada como uma fina camada no meio filtrante. Esses auxiliares reduzem o entupimento do filtro devido a penetração de células e de fragmentos de células nos poros. Os poros tem diâmetro de 10 a 1000µm, e o diâmetro de bactérias e fungos é de menos de 10µm, ou seja, não é necessário adição de auxiliares de filtração para esses organismos. Não podem ser adicionados quando se deseja obter um produto intracelular. Pq? Desvantagens: a molécula alvo pode se ligar irreversivelmente ao auxiliar, o tempo de filtração aumenta (pois a viscosidade aumenta). Ex: Filtro rotativo a vácuo 3.2 Centrifugação No processo de centrifugação células em suspensão em um meio líquido sedimentam por ação da gravidade. Muito utilizada para bactérias e leveduras (na filtração podem causar entupimento). Para se fazer ampliação de escala deve- se manter o produto Fc*t (força * tempo). Auxiliares de centrifugação podem ajudar na agregação das células microbianas com base nas características iônicas da superfície, aumentando a densidade dos sólidos suspensos, o que resulta em uma maior velocidade de centrifugação. Esse processo pode ser obtido por ajuste de pH (reduz a carga superficial das células resultando em partículas maiores e mais densas) ou adição de eletrólitos (reduz a repulsão eletrostática entre as células favorecendo a reunião delas) à suspensão. 4. Separação por membranas Os produtos obtidos e desejáveis dos mostos fermentados muitas vezes se encontram em baixas concentrações. Além disso, os mostos apresentam diversas
  6. 6. moléculas como sólidos suspensos ou coloidais, fragmentos de microrganismos e de células, solutos extracelulares (proteínas, Ac. nucléicos, etc) e produtos do metabolismo da célula (ácidos orgânicos, antibiotiocos) além dos diferentes nutrientes presentes no meio (sais, açucares). As dimensões dessas substancias variam de nanômetros para milímetros. Portanto, processos de separação por membranas tende separar os produtos biotecnológicos. A aplicação mais imediata de membranas em processos biotecnológicos é o processo do mosto fermentado, tanto para recuperar células quanto para obtenção de mosto clarificado. Assim, quando o produto de interesse é a célula ou um produto intracelular, como uma proteína, a separação das células do meio de fermentação pode corresponder à primeira etapa de recuperação do produto, seguida de uma lavagem e purificação da proteína. Os processos de microfiltração, ultrafiltração , nanofiltração e a osmose reversa são soluções para esse tipo de separação, uma vez que são processos de baixo consumo energético e eliminam custos de armazenamento e do tratamento do auxiliar de filtração (serio problema enfrentado por industrias que ainda usam filtros rotativos). A grande vantagem dos processos de separação por membranas vem sido adotadas com o objetivo de melhorar a eficiência dos processos bioquímicos, seja pela esterilização continua do meio de cultura e do ar na alimentação, seja pela remoção continua dos produtos, nos chamados biorreatores à membrana , ou seja, a reação e a separação ocorrem simultaneamente. Outras vantagens são: economia de energia, especificidade, separação de termolábeis (sempre a T ambiente), facilidade de operação e de amplificação de escala. Existem membrana sintéticas e inorgânicas, podendo ser densas ou porosas. Os parâmetros das membranas porosas são distribuição de tamanho dos poros, porosidade superficial e espessura. Os parâmetros para as membranas densas são as características físico-químicas do polímero usado e a espessura do filme polimérico. Ambas levam em consideração a permeabilidade a gases e líquido e a capacidade seletiva. A força que move as moléculas através da membrana são: µ = diferença de potencial químico, diferença de concentração (c) e diferença de pressão(p, pi) E = diferença de potencial elétrico Nos processos que envolvem membranas porosas a capacidade seletiva está relacionada ao tamanho do poro e das especies presentes. Ex: microfiltração, ultrafiltração, nanofiltração e diálise. Nos processos que envolvem membranas densas a capacidade seletiva depende da afinidade das diferentes espécies com o material da membrana e da difusão destas pelo filme polimérico. EX: osmose inversa, pervaporação, permeação de gases.
  7. 7. 4.1 Filtração tangencial Na filtração tangencial , a solução de alimentação escoa em paralelo à superfície da membrana, enquanto o permeado é transportado transversalmente a esta. A polarização é menor do que na filtração convencional, e o seu efeito é ainda dimunuido com o aumento da velocidade de escoalmente da alimentação. O coeficiente de rejeição R mede a capacidade seletiva da membrana: R=1-Cp/Co onde Cp é a concentração da espécie no permeado e Co é a concentração da espécie na alimentação. Se R = 0, Cp= Co, a membrana não apresenta nenhuma capacidade seletiva para a espécie, toda a espécie está passando. Se R=1, Cp=0, a espécie não está presente no permeado, a membrana é seletiva para a espécie. 4.2 Microfiltração i) Poros 0,05 e 5µm; ii) Filtra partículas em suspensão ar/ aquoso; iii) Permeável aos compostos solúvel; iv) Filtração estéril de ar e líquidos. 4.3 Ultrafiltração i) Poros 1 a 500nm; ii) Retém macromoléculas em solução; iii) Caracterizada por massa molar limite (o limite de retenção de uma membrana de filtração é definido como o valor da massa molar de uma macromolécula rejeitada pela membrana); 4.4 Nanofiltração i) 300 e 2000 Da ii) Obtenção de água potável iii) Concentração de antibióticos a partir de mostos fermentados 4.5 Osmose inversa i) Membrana é permeável apenas ao solvente ( anisotrópica densa) ii) Dessalinização de águas marinhas e salobras iii) Concentração de suco de frutas e antibióticos
  8. 8. 4.6 Diafiltração É um modo alternativo de operar sistemas de micro, ultra e nanofiltração e mesmo osmose inversa. Um processo de purificação a volume constante. A operação consiste em adicionar, continuamente, solvente puro ou solução tampão, em vazão equivalente a vazão do permeado que sai do sistema. Dessa forma se elimina componentes de menor tamanho ou de menor massa molar. 4.7 Fluxo do permeado, polarização de concentração e fouling O fluxo do permeado depende da permeabilidade da membrana, a medida que o tempo passa vai ocorrendo o fenômeno de polarização de concentração, em que a membrana se torna cada vez mais impermeável. A limpeza da membrana cessa esse fenômeno. O processo de fouling é quando ocorre possíveis alterações nas membranas provocadas pelas espécies químicas presentes na solução. Essas alterações podem ser parcialmente ou totalmente irreversíveis: adsorção, entupimento de poros por moléculas ou partículas em suspensão e depósito na superfície da membrana de espécies presentes (macromoléculas ou sais). O fluxo é dado por: J=∆P/ Rt Rt=Rm+Ra+Rb+ Rg+Rpc Onde: Rm=resistência da membrana, Ra = adsorção, Rb = bloqueio dos poros, Rg = camada de gel, Rpc=polarização da concentração. 5. Precipitação Precipitados de proteínas são agregados de proteínas insolúveis grandes o suficiente para serem observados a olho nu e sedimentam sob valor de força centrífuga relativamente baixa. Em alguns casos a precipitação pode atuar como etapa única de purificação dependendo do grau de pureza desejado. Precipitação é facilmente adaptada para larga escala, pode- se realizar o processo de maneira continua e a disposição de precipitantes é muito grande, sendo que muitos deles são de baixo custo. Uma das maneiras de se precipitar proteínas é reduzir a sua solubilidade da proteína por alterações no solvente, por exemplo, pela adição de sais como sulfato de amônio, solventes orgânicos (etanol, éter, acetona). Outra maneira é diminuir a solubilidade da proteína por alteração na própria proteína, como a mudança de carga por adição de ácidos, bases, precipitantes catiônicos ou aniônicos. 5.1 Principios de solubilidade A solubilidade de uma proteína é favorecida quando as interações entre as moléculas de soluto são repulsivas e as interações do soluto com as moléculas do solvente são atrativas. Com isso, uma molécula pode se tornar insolúvel por qualquer perturbação que resulte em diminuição das forças atrativas com o solvente, ou então,
  9. 9. em um aumento com as interações atrativas entre as moléculas de soluto. De modo geral o solvente é sempre aquoso e as propriedades do meio podem ser alteradas por mudanças na força iônica, no pH, na adição de solventes orgânicos combinados com variação na temperatura, que causam alteração na solubilidade da proteína. A solubilidade de proteínas é influenciada pela temperatura. Todas as formas de interações não covalentes, com exceção das hidrofóbicas são inversamente proporcionais a temperatura. As forças das interações hidrofóbicas aumentam com a temperatura. A desnaturação de uma proteína compreende a perda da estrutura terciária e a formação de cadeias polipeptídicas ao acaso. Em solução essas cadeias polipeptídicas se misturam e formam agregados reunidos físico ou ainda, quimicamente, por ligações dissulfeto. A solubilidade é reduzida em virtude da exposição de resíduos hidrofóbicos internos. A simples remoção do desnaturante não garante a reconformação adequada da molécula. Porém a aplicação da precipitação só é viável quando a conformação adequada da proteína é recuperada após o processo, uma vez que sua função deve ser mantida A precipitação de produtos microbianos é um dos métodos mais tradicionais de concentração e purificação. Porém, não proporciona elevada capacidade de purificação quando a operação é conduzida em apenas uma etapa. Dessa forma, a precipitação é normalmente empregada nas etapas iniciais do processo. Além disso, a solubilização de proteína precipitadas pode ser dimensionada de modo a reduzir o volume inicial, e portanto, aumentar a concentração. Portanto, a precipitação pode preceder processos de alta resolução como a cromatografia. Em solução aquosa a precipitação pode ocorrer com o aumento (salting out) ou diminuição (salting in) da concentração de sais, com adição de solventes orgânicos, polieletrólitos, polímeros não iônicos, calor e ajuste de pH. 5.2 Precipitação por sais A precipitação por sais ocorre por neutralização das cargas superficiais da proteína e redução da camada de hidratação, favorecendo a agregação de resíduos hidrofóbicos. A adição de concentrações de sal (salting out) resulta em aprisionamento da moléculas de água pela solvatação dos íons , dessa forma, as regiões hidrofóbicas da proteína ficam expostas e elas interagem e agregam entre si. Imagine uma solução aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certa quantidade de sal neutro. A água, que apresenta um grande poder de solvatação, passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes da dissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água, ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Como conseqüência, temos: maior interação proteína-proteína,
  10. 10. diminuição da solubilidade em meio aquoso e, conseqüentemente, precipitação da proteína. O aumento ta temperatura favorece a precipitação de proteínas por salting out, mas o processo é conduzido normalmente a 4 graus para evitar a desnaturação. Quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas. Conseqüentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade “salting in”. 5.3 Precipitação por solventes orgânicos A solubilidade de proteínas em solventes orgânicos varia de acordo com as distribuições dos resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula. Esses grupamentos interagem com íons, outras proteínas e moléculas de solventes de forma a controlar a transferência da proteína alvo para a fase sólida (precipitado) ou para a fase liquida (sobrenadante). Alcoóis, acetona, ésteres são utilizados para precipitar proteínas desde 1907, porém desconhecia- se o efeito desnaturante desses solventes. Normalmente deve- se realizar o processo a baixas temperaturas para evitar esse efeito desnaturante. Umas das vantagens do uso de solventes é sua volatilidade que permite pronta recuperação e reciclagem ao processo, além de possuir propriedades bactericidas. Os solventes podem ser removidos facilmente do precipitado, por secagem a vácuo em baixa temperatura. O solvente usado deve ser totalmente solúvel em água, não reagir de modo direto com a proteína e ter um forte efeito precipitante. Quanto maior a cadeia alifática maior a desnaturação. A adição de solventes orgânicos causa geração de calor e por isso, deve ser lenta e sob resfriamento. A precipitação de proteínas de caráter ácido pode ser melhorada pela adição de íons metálicos bivalentes , como o cálcio e o magnésio que formam complexos com a proteína reduzindo a carga global e favorecendo a agregação. Cátios como Zn e Ca formam complexos com as proteínas, recurso usado para precipitar proteínas muito solúveis em solventes orgânicos. O pH em torno do PI pode favorecer a precipitação, reduzindo a concentração de solvente necessária. Em valores de pH maiores ou menores que o PI os parâmetros polares das proteínas ficam maiores e então essas biomoléculas tendem a ficar mais solúveis, mesmo que relativamente desidratadas, devido as forças de repulsão. 5.4 Precipitação por polímeros
  11. 11. 5.4.1 Polietileno glicol Polietireno glicol (PEG) é um polímero de alta massa molar, neutro e miscível com água, disponível em altos graus de polimerização. As precipitações são conduzidas em baixas concentrações de PEG, faixa na qual as soluções não são muito viscosas e muitas proteínas precipitam. A operação é realizada sem resfriamento. O mecanismo de precipitação é entendido como de exclusão da proteína do meio aquoso. A concentração de PEG necessária depende do tamanho da proteína e da massa molar do polímero e é inversamente proporcional a concentração de proteína. O PEG pode ser removido por métodos de ultrafiltração, adição de etanol. 5.4.2 Polieletrolitos Os polieletrólitos são polímeros iônicos solúveis em água que tem sido utilizado devido a seu baixo custo e a redução de resíduos, uma vez que a precipitação ocorre em baixas concentrações. Os mais usados são o PEI e PAA. O uso de polieletrólitos é restrito pois a proteína e o polímero devem ter cargas opostas. Por isso, deve- se operar longe do PI da proteína. 5.5 Precipitação pela temperatura A variação da temperatura causa precipitação da proteína de duas formas: 1) sua diminuição provoca redução na solubilidade de proteínas e sais; 2) seu aumento causa desnaturação de proteínas (perdendo sua estrutura terciaria e expondo os grupos hidrofóbicos para formar grupos insolúveis). 5.6 Precipitação isoelétrica A precipitação isoelétrica resulta na atração eletrostática das proteínas quando estas se encontram próximas do ponto isoelétrico, pois a repulsão eletrostática entre as moléculas é mínima. É um dos métodos mais simples executado simplesmente pelo ajuste do pH próximos ao PI. Quando os valores de pH do meio estão acima do PI da proteína, a superfície está com carga negativa, ocorrendo repulsão eletrostática; o mesmo ocorre quando o pH do meio está abaixo do PI da proteína, a superfície está com carga positiva, ocorrendo repulsão entre as moléculas. A precipitação isoelétrica é mais expressiva para proteínas com baixa constante de hidratação ou com alta superfície hidrofóbica, como globulina e caseína, que formam agregados grandes. Proteínas hidrofílicas têm solubilidade grande no seu ponto isoelétrico, e dificilmente precipitam pelo ajuste do pH. Para ajustar o pH são utilizados ácidos relativamente baratos, mas que podem desnaturar irreversivelmente proteínas. Isso pode ser evitado pelo uso de ácidos com íons estabilizantes, como acetato ou sulfato.
  12. 12. 5.7 Precipitação por afinidade Métodos de afinidades são definidos como procedimentos que fazem usos de uma interação especifica e seletiva com um ligante, geralmente um substrato ou um inibidor se a proteína é um enzima. A precipitação por afinidade por ocorrer de duas formas: na primeira pela ligação cruzada de proteínas com ligantes, geralmente corantes, com formação de um reticulo tridimensional; na segunda pela diminuição da solubilidade de um polímero que possui um ligante de afinidade, reversivelmente solúvel –insoluvel, por variação no pH, temperatura, concentração de sal ou adição de íons metálicos. 5.8 Precipitação por íons metálicos Alguns íons monovalentes podem ser suficientes para a precipitação de proteínas, e são divididos em três grupos: 1) Mn, Fe, Co, Cu, Zn, Cd (todos 2+), se ligam fortemente aos ácidos carboxílicos ou a compostos nitrogenador. 2) Ca, Ba, Mg, Pb (todos 2+), se ligam apenas a ácidos carboxílicos e 3) Ag e Hg que se ligam fortemente ao grupo suforil. 6. Extração líquido- líquido (SDFA) Esse método se baseia na extração de biomoléculas em sistemas de duas fases líquidas imiscíveis, constituídas de uma fase aquosa e um solvente orgânico. A extração em SDFA é aplicada a purificação de produtos obtidos em células animais, vegetais e microbianas, extração de vírus, organelas e ácidos nucléicos e enzimas. Para produtos que exigem alto grau de pureza a extração em SDFA não é suficiente e nesses casos deve ser sucedida por uma ou mais etapas cromatográficas. A separação entre a molécula a ser purificada e os contaminantes decorre das diferentes solubilidades apresentadas por esses solutos em cada uma das fases aquosas. Esses sistemas são formados pela reunião de determinados polímeros, polieletrólitos, ou ainda, polímeros em combinação com solutos de baixa massa molar, em uma mesma solução formando quatro grupos. Em um primeiro grupo podem ser considerados os sistemas formados por dois polímeros não iônicos (PEG/dextrana). Em um segundo grupo tem-se um polieletrólito e um polímero não iônico (sulfato dextrana de sódio/polipropileno glicol). O terceiro grupo constitui 2 polieletrólitos (sulfato dextrana de sódio/carboximetilextrana de sódio). O quarto grupo contitui um polímero não iônico e um composto de baixa massa molar (PPG/fosfato de sódio). Os sistemas mais usados são os que possuem dextrana em uma das fases a qual fica no fundo, enquanto o outro polímero se concentra no topo. Quando do emprego de sais estes se concentram no fundo enquanto o polímero se apresenta no topo. Ambas as fases, no entanto, apresentam os dois componentes, uma vez que se estabelece o equilíbrio entre elas.
  13. 13. 6.1 Curva de equilíbrio O eixo y representa a composição em massa da molécula que apresenta maior concentração na fase de topo e o eixo x representa a composição da molécula de maior concentração na fase de fundo. Composições representadas por pontos acima da curva levam a formação de duas fases e, abaixo da curva, de uma fase só. A formação do SDFA depende, portanto, da concentração dos componentes do sistema. Os principais fatores que influenciam a posição do equilíbrio em um SDFA são a massa molar, o tipo de sal e a concentração dos componentes. O coeficiente de partição K é uma grandeza adimensional que representa a relação entre as concentrações da molécula de interesse na fase de topo e na fase de fundo, no equilíbrio: K= Cti/Cfi onde Cti é a concentração do soluto i na fase e topo e Cfi é a concentração do soluto i na fase de fundo. 6.2 Montagem do sistema Coeficientes de partição significativamente distintos para a molécula de interesse e para as demais moléculas indicam ocorrência de purificação. Quanto maior a solubilidade dos solutos nas fases maior a concentração nessas fases. Dessa forma, características físico- químicas das proteínas (hidrofobicidade, carga superficial e massa molar) e da solulção (pH e força iônica) serão determinantes para o valor de K. De modo geral, o valor de K diminui com o aumento da massa molar da proteína. As características hidrofóbicas acentuarão o grau de separação e o aumento da pureza. A diversidade de variáveis que influem no coeficiente de partição das biomoléculas e rendimento da extração sugere a adequação do emprego das técnicas de planejamento estatístico do experimento. Assim, por um moderado numero de experimentos podem ser testados diferentes sistemas quanto ao tipo de componentes formadores de fases, a massa molar do polímero, e o pH. Os experimentos são preparados a partir de soluções estoque, normalmente 50% (em massa) para a solução de PEG, 40% para os sais e 20 a 30% para a dextrana. Essas soluções são pesadas na quantidade necessária para se obter a concentração desejada no sistema. A ordem de adição dos componentes devido as suas densidades é: solução de Dx ou solução de PEG, solução de sal e água. Como a temperatura afeta a formação do sistema de fases é necessário que as soluções estoque já estejam na temperatura de trabalho antes do preparo do sistema. Depois de preparado o sistema, ele deve ser agitado e em seguida deixado em repouso para atingir o equilíbrio. A separação das fases pode ser acelerada por centrifugação (3 a 5 min). 6.3 Extração repetida e clarificação
  14. 14. A aplicação repetida é importante para a purificação da proteína. Na primeira aplicação, caso a proteína migre para a fase de topo e alguns contaminantes para a fase de fundo, adiciona- se uma solução à fase da molécula alvo tal que se forma uma nova fase inferior, que resulte em aumento da pureza adicional em relação a primeira etapa. Essa estratégia é muito utilizada para purificação de meios complexos. 6.4 Reciclagem de polimeros e sais A reciclagem é necessária para a redução do custo do processo e dos danos causados do descarte dos sais empregados. Quando a fase de topo contem a molécula alvo é possível recuperar o polímero pela indução de formação de uma nova fase de fundo, na qual a molécula apresente maior solubilidade. Haverá, todavia, perda da molécula de interesse, dado que existe uma distribuição entre as fases. Pode – se também separar o polímero em relação aos demais solutos, por meio de cromatografia de exclusão molecular ou ultrafiltração, ou ainda, pela precipitação da molécula alvo ou com condições salinas desde que o polímero não precipite. A reciclagem do sal também possível por precipitação; pode- se resfriar a fase salina até que o sal precipite. 6.5 Extração baseada em afinidade Para se aumentar o valor de K pode- se utilizar interações por afinidade. O ligante é acoplado por ligação covalente ao polímero. O aumento da partição pela introdução de um ligante acoplado ao polímero é descrito pelo parâmetro Kf: Kf= K(peg ligante)/K (peg sem ligante) em que Kf= (KL)n , onde KL é o coeficiente de partição do ligante livre e N é o número de sítios de ligação disponíveis no ligante O rendimento teórico de uma molécula alvo extraída na fase superior (Vs) ou na fase inferior (Vl) e em uma única etapa pode ser calculado por: R (%)= 100/(1+ Vl(VVs* K)) O ligante pode ser uma substancia natutal (caros e desnaturam rapidamente) ou uma substancia sintetizada. Ex: ligantes hidrofóbicos, tiofilicos, metais, corantes, ácidos graxos, inibidores, anticorpos monoclonais,entre outros. A escolha do ligante deve levar em consideração: i) A constante de dissociação produto-ligante deve ser menor que 10-3M; ii) Ligante deve ser estável e especifico para a molécula alvo; iii) Ligante não pode ser tóxico, deve ser barato e disponível em grandes quantidades. Para a recuperação do polímero depois da extração é necessário inicialmente desfazer a interação entre o ligante e a molécula. Em geral são utilizados moléculas
  15. 15. que competem com o produto pelo ligante ou com o ligante pelo produto. Muitas interações especificas podem ser rompidas por alteração de pH, porém deve- se estar atento à eventuais mudanças no produto biológico. A seguir deve- se reciclar o polímero para posterior utilização. Há várias técnicas. O PEG pode ser reciclado por extração com solventes orgânicos (etanol, clorofórmio), terminar! 7. Introdução à Cromatografia As operações cromatográficas tem como objetivo isolar e purificar o metabólito de interesse em relação aos demais, levando- o a pureza adequada a seu uso. A redução do volume do meio original é relevante para a economia do processo, pois os métodos cromatográficos, são na maioria, baseados em fenômenos adsortivos e assim, lentos e dependentes de investimentos em materiais adsorventes. A cromatrografia pode ser liquida ou gasosa. Na cromatografia liquida, ao solutos são retidos em um leito de material poroso, por meio de fenômenos de adsorção (química ou física), partição ou exclusão molecular. A fase estacionaria pode ser constituída por sílica porosa, polímeros orgânicos sintéticos, polímeros de carboidratos. Esses últimos se apresentam em partículas esféricas pequenas embebidas no solvente, o qual constitui maior parte da fase estacionaria, denominada gel. A posterior remoção gradual dos diferentes solutos se da por ação de uma fase liquida eluente, a qual resulta na separação dos diferentes componentes do meio. A ordem de grandeza da pressão aplicada interfere na resolução da separação dos solutos. Assim, a pressão baixa, média e alta associa- se a denominação baixa eficiência, media eficiência e alta eficiência (HPLC). Um sistema cromatográfico deve conter também um detector o qual registra a presença de solutos no fluxo de saída. Esse detector deve ser sensível a molécula alvo. Assim, proteínas, aminoácidos, policetideos, lipídeos e outros são detectados por medidas da absorbância (UV) em comprimento de onda definidos (ligações peptidicas são detectadas em 215nm enquanto aminoácidos em 280nm). Um aumento na eficiência de detecção pode ser alcançado pelo uso de detectores na absorção baseados na absorção por fluorescência. Existem diferentes tipos de cromatografias, dentre eles cromatografia de exclusão molecular, baseada na separação de moléculas em função da massa molar e/ou do volume efetivo da solução; cromatografias de troca iônica, interação hidrofóbica, afinidade e imunoafinidade, nas quais ocorrem adsorção de diferentes moléculas sobre a matriz e em seguida, desorção para a separação das moléculas. Um cromatograma é um gráfico que indica a presença dos diferentes solutos presentes no eluente que sai da coluna (eixo y), em função do tempo e do volume de eluente que passou pela coluna (eixo x). A presença de solutos é detectada por medidas de absorbância ou por indica de refração. O volume que passa pela coluna até
  16. 16. o instante de saída de uma certa molécula é o volume de retenção especifico daquela molécula (Vr). Alternativamente, emprega- se o tempo de retenção, tr. O ponto mais alto das curvas correponde ao instante de máxima concentração da molécula no eluente, o qual caracteriza o tr e o Vr. A eficiência da purificação pode ser avaliada de acordo com o grau de separação das moléculas, denominado Rs. Na separação de duas moléculas A e B, Rs é determinado por: Rs= (trb- tra)/ (1/2) * (WbA + WbB), onde WbB é a distancia do pico b. Para Rs<1 as moléculas são incompletamente separadas, para Rs=1 as curvas se tocam nas bases e para Rs>1 as moléculas se encontram separadas. Todavia, pode haver sobreposição de duas moléculas em um mesmo pico, nesse caso embora Rs seja elevado , a molécula alvo não terá sido purificada. 8. Cromatografia de Exclusão molecular Uma das características das proteínas é seu tamanho elevado, o que proporciona um método eficaz para a separação de proteínas de acordo com sua massa molar, por cromatografia de exclusão molecular, também conhecida como cromatografia em gel. Assim, uma mistura de proteínas dissolvidas em solução tamponante flui por gravidade ou com auxilio de bombas, por uma coluna preenchida por esferas microscópicas de material polimérico poroso , previamente equilibrado e lavado apenas com tampão. Assim em uma coluna cromatográfica, as moléculas menores são as ultimas a saírem da coluna. De maneira geral, quanto maior a coluna melhor a resolução, entretanto isso implica em longo tempo de separação e grande diluição da amostra. A fase estacionaria utilizada normalmente consiste de géis hidrofílicos reticulados embebidos para amostras solúveis em solução aquosa, e de matrizes a base de poliestireno para amostras não aquosas. Diversos fatores devem ser considerados para a seleção da matriz de gel mais adequado, destacando- se as características da matriz, como tamanho do poro, diâmetro médio e distribuição de tamanho de partículas, densidade de empacotamento do gel na coluna, volume da amostra, vazão do eluente, viscosidade da amostra e do tampão. Matrizes uniformes, com baixa distribuição de tamanho de partículas, facilitam eluição de moléculas em picos estreitos. Deve- se também levar em conta , na seleção da fase estacionaria, a estabilidade da matriz no solvente requerido como fase móvel e as condições de pH, temperatura e salinidade empregada durante a separação, que devem ser compatíveis com as propriedades da proteína de interesse. Os materiais empregados nas cromatografias em gel devem ser inertes em relação a molécula de interesse. Na cromatografia em gel um outro fator além do tamanho intefere na eluição. Proteínas delgadas e longas são eluidas antes de proteínas globulares de mesma massa molar.
  17. 17. A alta resolução na cromatografia em gel depende da aplicação de um pequeno volume de amostra, pois quanto maior esse volume, maior o volume no qual esta será eluida. Tipicamente, o volume da amostra deve ser de 0,5 a 5 % do volume total do leito. Volumes menores que 0.5% não se obtem um espalhamento apreciável para o processo e volumes acima de 5% as moléculas devem ter grande diferença no tamanho para serem separadas. A amostra a ser injetada na coluna deve ser previamente clarificada por centrifugação ou filtração para evitar o deposito de partículas na coluna. 8.1 Curvas de cromatografia em gel Vt = volume total da coluna (eluição de moléculas menores que os poros) V0= volume intersticial no meio poroso (eluição de grandes moléculas) Vs= volume de solvente que cabe dentro fase estacionaria do gel (elui moleculas intermediarias) Vs= Vt – V0 8.2 Aplicações de cromatografias de exclusão molecular - Dessalinização - Fracionamento de proteinas: Requer uso de gel com propriedades otimas, isto é, alto volume de poros, poros com estreita distribuição de tamanhos e diâmetros adequados. Amostras com poucos componentes ou que tenham sido parcialmente purificadas afim de eliminar componentes do mesmo tamanho apresentam melhores resultados. A fração eluida no volume vazio apresentara menor fator de diluição do que as frações finais, que apresentam maior tempo de retenção na coluna. Deve- se portanto, buscar o menor fator de diluição e o menor tempo possível. -Determinaçao de massas molares -Determinação de tamanho de poros - Separação empregando princípios mistos 9. Cromatografia de troca-iônica Trata- se de um método simples, fácil ampliação de escala, alta resolução, alta capacidade de adsorção e versátil. Na troca iônica há uma etapa de adsorção reversível de moléculas de solutos eletricamente carregados a grupos com cargas opostas, imobilizados em matriz sólida. Os solutos adsorvidos são subsequentemente eluidos após serem trocados por outros íons, com o mesmo tipo de carga, porém com uma maior afinidade pela fase estacionaria. Portanto, são os diferentes tipos de grau de
  18. 18. afinidade eletrostática entre a fase estacionaria e os íons na fase móvel que regem esse tipo de cromatografia. Matrizes de troca iônica que conte grupos positivamente carregados são aniônicas, matrizes catiônicas são negativamente carregadas. Os contra-íons são íons de baixa massa molar que se ligam a fase estacionaria ou as proteínas solúveis na fase móvel. Para que a proteína se ligue a fase estacionaria, os contra íons devem ser eletrolicamente dissociados. Cátions H+ e Na+ são comumento encontrados em trocados catiônicos e anios Cl- e OH- são os mais utilizados em trocadores aniônicos. 9.1 Escolha da matriz Alguns critérios importantes devem ser considerados para a escolha da matriz: i) Alta estabilidade mecânica ii) Boa estabilidade química: resistente a esterilização e à sanitização iii) Alta capacidade de adsorção iv) Tamanho do poro: deve permiti o acesso da biomolécula alvo ao sitio de adsorção v) Supericie da matriz: deve minimizar adsorções não especificas que podem entupir a matriz vi) Tamanho da partícula 9.1.1 Celulose Matriz muito hidrofílica, porém instável na presença de ácidos minerais, álcalis e agentes oxidantes . Operam em faixa de pH e 3 a 10. Sua capacidade de se ligar a proteínas é alta, porém não é propicia a interações hidrofóbicas ou não- iônicas. 9.1.2 Agarose É um polissacarídeo natural, complexo, obtido da purificação do Agar. A matriz é altamente porosa e com mínima adsorção não especifica. Terminar Ex de matrizes: celulose, agarose, dextrana e policrilamida. Os grupos funcionais usados em trocadores podem ser fortes ou fracos, dependendo dos valores de pKa dos grupos carregados. Os grupos fortes operam em uma faixa maior de pH do que os grupos fracos. Portanto, na escolha do grupo funcional o pH é uma variável importante. A fase móvel pode ser constituída por soluções acidas, básicas ou tampões e adicionadas de sais neutros ou solventes orgânicos com a finalidade de aumentar a seletividade.

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