Electroforesis, nb, sb y wb.

Amanda Sánchez López
23/04/2014
amanda_sl15@hotmail.com
TÉCNICAS INTRUMENTALES
BÁSICAS

ESQUEMA
1- TECNICAS ELECTROFORÉTICAS
• Fundamento físico-químico
• Ventajas
• Factores que afectan a la electroforesis
• Tipos de electroforesis
2- WESTERN BLOT
3- SHOUTHERN BLOT
4- NORTHEN BLOT

FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO
DEFINICIÓN:
Técnica utilizada para la SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN E
IDENTIFICACIÓN de partículas.
Basada en la migración de las misma por la acción de un
campo eléctrico.
CÁTODO ÁNODO

q
E
L
FEFf
CÁTODO ÁNODO
μ
r
f Ff

Las biomoléculas se separan en función de:
- Carga electrica
- Tamaño y forma
• A mayor carga, mayor movilidad
• A mayor tamaño, menor movilidad
• A mayor viscosidad del medio, menor movilidad
U  Movilidad electroforérica.
Velocidad de la particular por
unidad de campo

VENTAJAS DE LA TÉCNICA
• Sensibilidad
• Elevado poder de resolución
• Versatilidad
• Posibilidad de separar mezclas complejas
• Aporta potente criterio de pureza
• Posibilidad de determinar otros parámetros: Pm, pI, nºde
cadenas polipeptídicas

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
CAMPO ELECTRICO / FUENTE DE ALIMENTACIÓN
•Diferencia de potencial entre los electrodos (Voltios)
•Intensidad de corriente (Amperios)  [Ley de Ohm(V = i x R)]
•Resistencia (Ohmios)
•Temperatura (efecto Joule)
MUESTRA
• Carga, forma y tamaño de la molécula
TAMPÓN
• Fuerza iónica, pH

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
SOPORTE
• NO RESTRICTIVO
Permite el paso de la muestra. No supone un impedimento para la misma.
Proteinas.
La muestra se separa en función de la densidad de carga (relación masa y carga)
• RESTRICTIVO
Por su composición ofrecen un impedimento al paso de las muestras.
En condiciones generals, la separación dependerá de la forma, tamaño y carga

TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

Separar, identificar y purificar moléculas o
fragmentos de DNA o RNA
MIGRACIÓN
• ÁNODO (+)
• Relación carga-masa igual
• Tamaño y forma
Soportes restrictivos  Agarosa disuelta en un buffer
Agarosa Tamaño
poros
Mejor separación
fragmentos grandes

Separar, identificar y purificar moléculas o
fragmentos de DNA o RNA
MIGRACIÓN
• ÁNODO (+)
• Relación carga-masa igual
• Tamaño y forma
Soportes restrictivos
DETECCIÓN
Bromuro de etidio.
Agente intercalante fluorescente

EtBr
Tª

EtBr
Tª
Glucosa/glicerol y colorante

MARCADOR DE PESO MOLECULAR
(PM)
ESTIMACIÓN DE PM

2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
• La acrilamida polimeriza por la
acción del TEMED y el PSA
(persulfatoamónico)
• La metilen-bis-acrilamida forma
enlaces cruzados entre los
polímeros de acrilamida
• En conjunto se forma una especie
de malla cuyo diámetro de poro
viene determinado por la
concentración de acrila-mida/bis-
acrilamida (%)

Uniformidad del
gel
Conformación de la
proteína
Gel
uniforme
Gel
discontinuo
NO
Desnaturalizante
Desnaturalizante

Uniformidad del
gel
Conformación de la
proteína
Gel uniforme Gel discontinuo
NO
Desnaturalizante
Desnaturalizante
NO
Desnaturalizante
Desnaturalizante

GEL DISCONTINUO
GEL “STACKING”(EMPAQUETADOR)
•Menor concentración de
acrilamida
•Tamaño de poro
Función: Acumular las proteínas a la
entrada del gel separador para que
salgan al mismo tiempo
GEL “RUNNING”(SEPARADOR)
•Mayor concentración de acrilamida
•Tamaño de poro menor
Función: separar las proteínas
STACKING
RUNNING

Las proteinas se pueden separar por: Tamaño, forma y carga eléctrica
La mayoría de las proteínas
estarán cargadas negativamente

Puentes disulfuro

2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES

A igual tamaño
migra más la de
mayor carga
A igual carga
migra más la de
menor tamaño

80KDa 40KDa

80KDa
40KDa
80KDa 40KDa

VENTAJAS
• Separa proteínas en estado nativo
• Las proteínas siguen siendo funcionales
• Permite separar complejos proteicos o proteínas multiméricas como una
unidad
• Excelente herramienta para detectar cualquier proceso que altere la carga o la
conformación de una proteína
INCONVENIENTES
• Muchas proteínas no migran por no tener carga neta o por poseer carga neta
positiva
• El proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta
de las proteínas
• El proceso de separación no sólo estáafectado por el tamaño sino también por
la forma de la proteína

CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
Las proteínas pierden su conformación nativa
1. Se emplean AGENTES DESNATURALIZANTES (urea, detergentes), el SDS
(sodiumdodecylsulfate) es el de mayor uso
2. Se emplea un AGENTE REDUCTOR de puentes –s–s– generalmente β-
mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?

La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal
forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser
aprox. la misma
¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?
El β-mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter-como
intramoleculares mediante una reacción redox. (El β-mercaptoetanol reduce
los puentes disulfuro)
DTT

80KDa 40KDa

60KDa
40KDa
20KDa
80KDa 40KDa

NO
DESNATURALIZANTE
DESNATURALIZANTE
SDS-PAGE

VENTAJAS
•Separación rápida de las proteínas
•La separación no depende de la forma de la proteína nativa
•Se puede estimar el peso molecular de las proteínas
•Aunque desnaturalizadas, las proteínas pueden usarse para la fabricación de
anticuerpos (en la mayoría de los casos)
INCONVENIENTES
•Las proteínas separadas están desnaturalizadas por tanto no son funcionales
PARA LA DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR:
1. Necesitamos un marker
2. Necesitamos normalizar

ELECTROFORESIS GEL POLIACRILAMIDA
Azul de
coomassie
DETECCION DE PROTEINAS
- Azul de Coomassie
- Todas las proteinas

2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. ISOLELECTROENFOQUE
Las proteínas se separan por:
PUNTO ISOELÉCTRICO
Las proteínas se moverán de acorde
con su carga neta hacia el ánodo o el
cátodo hasta que alcancen un valor
de pH = pI donde su carga neta es
neutra (y ya no se mueven)

2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
• Técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas
altamente complejas
•La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la
bidimensionalidad, es decir, en que las proteínas son separadas secuencialmente
por dos criterios físicos
•Debido a su elevada resolución, ha sido una técnica ampliamente utilizada en la
confección de mapas de referencia, es decir, en la disección de la composición
proteica de un determinado orgánulo o tipo celular (metabolómica)

En realidad son dos
proteinas con identico
peso molecular o punto
isoeléctrico!
SOLUCION:
Electroforesis Bidimensional

Peso molecular
Punto
isoeléctrico

WESTERN BLOT
Gel de proteínas Membrana tras WB

WESTERN BLOT
● ELECTROTRANSFERENCIA
● Mejor y más tiempo
● TECNICAS DE INMUNODETECCIÓN

WESTERN BLOT
La MEMBRANA de NITROCELULOSA
se puede teñir a su vez con un
colorante (ROJO PONCEAU) que
pone de manifiesto el total de
proteínas que se han transferido
desde el gel

WESTERN BLOT
DETECCIÓN
•Autorradiografía
•Precipitación de un
cromógeno insoluble por la
acción de una actividad
enzimática
•Fluorescencia
•Quimioluminiscencia

GEL UNIFORME
Concentración de poliacrilamida
uniforme
Función: separar las proteínas:
Tamaño y densidad de carga
Ventajas:
• Rápido
• Sencillo
• Puede estudiarse la funcionalidad
de las proteínas separadas
Desventajas:
•Menor resolución

Electroforesis, nb, sb y wb.

Recomendados

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Mais procurados

Mais procurados (20)

Semelhante a Electroforesis, nb, sb y wb.

Semelhante a Electroforesis, nb, sb y wb. (20)

Mais de tamaraalonsoperez

Mais de tamaraalonsoperez (15)

Último

Último (20)

Electroforesis, nb, sb y wb.