1. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 1 © VITO
LE PHENOTYPE MUTATEUR DES
RALSTONIA/ALCALIGENES METALLOTOLERANTES
Said TALBI(2,1), Yves MARKOWICZ (3), Safieh TAGHAVI (1), Hassan BRIM (2,1), Dirk
SPRINGAEL(1), Daniel van der LELIE (1),
Ariane TOUSSAINT (3,2), Max MERGEAY(1,2)
(1)Milieutechnologie, VITO (Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek) Mol, Belgique
(2)Laboratoire de Génétique des Procaryotes,ULB, Rhode-St-Genèse, Belgique
(3) Laboratoire de Génétique Microbienne, Université Joseph Fourier, Grenoble, France

2. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 2 © VITO
Dans divers sols ou sédiments de biotopes industriels ou miniers (Congo, Belgique, Allemagne) fortement
contaminés par les métaux lourds, l’on peut trouver des bactéries porteuses des gènes czc, cnr ou ncc (résistances
multiples aux métaux lourds) localisés sur de grands plasmides (180 à 300kb): une trentaine de ces souches ont
été récemment assignées au moyen de techniques moléculaires au genre Ralstonia où elles forment un
groupement susceptible de devenir sous peu une espèce distincte (Fig1). En attendant, elles portent la
dénomination provisoire de “Ralstonia eutropha-oïde”.15 de ces souches sur 25 testées (Table1) à cet effet
présentent un phénotype mutateur qui a surtout été étudié sur la souche CH34 et se révèle en particulier
lorsque la souche est cultivée à 37°C (soit un degré avant d’observer une létalité complète). A cette température,
seules 10-4
à 10-5.
bactéries survivent. De 20 à 80% de ces survivants portent des mutations reconnaissables: les
loci concernés (cartographiés pour la plupart) comprennent les gènes responsables de la synthèse de certains
acides aminés (principalement la lysine : ce phénotype s’accompagne d’ailleurs d’une thermorésistance accrue et
assez stable), de l’autotrophie, de l’utilisation de diverses sources de carbone et d’azote. Les mutants multiples
ne sont pas rares. Une classe importante des mutations observées s’exprime par de profonds réarrangements
des plasmides de résistance aux métaux lourds et fait intervenir des éléments transposables.
Au vu de l’effet de la température et dans le but de préciser la base génétique et moléculaire du phénomène,
nous avons cherché à savoir
1°) si DnaK/Hsp70,l’effecteur majeur de la réponse au choc thermique, joue un rôle.
2°) si le phénotype mutateur ne correspond qu’à un phénomène inductible à 37°C (notamment dans des
cultures en milieu liquide) ou s’il a une portée plus générale.
INTRODUCTION

3. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 3 © VITO
∀β-protéobactéries ; quelques nouvelles espèces à classifier.
• Phytopathogènes : R. solanacearum (ex-Pseudomonas, ex-Burkholderia) IVc.
• Chimiolithotrophes facultatif : H2+CO2 : R. eutropha (ex-Alcaligenes eutrophus) I et
II, HCOO-
R. eutropha (ex-P. oxalaticus) I et II.
• Souches des biotopes pollués par les métaux lourds (naturellement ou par acivité
anthrpogénique), I et IVa.
• Souches résistantes aux métaux lourds de la Nouvelle Calédonie (biotopes riches en
nickel), III.
• Souches cataboliques qui dégradent le PCB, 2,4-D (ex-A. eutrophus) II et III.
• Isolats cliniques : R. pikettii, IVb.
Le genre Ralstonia

4. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 4 © VITO
• Métabolisme chimiolithotrophe.
• Présence de deux mégaplasmides pMOL28 et pMOL30 qui conférent les
résistances aux métaux lourds.
• Capacité d’accepter et d’exprimer les gènes hétérologues.
• Phénomène décrit comme TSP : Thermospontagenèse
Ralstonia eutropha CH34

5. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 5 © VITO
•Mutagenèse et Mortalité Induite à la Température : TIMM
• Mortalité élevée à 37°C, 10-5
à 10-4
de survivants.
• Tsp est observé à 37 °C sur milieu riche seulement ou sur milieu
minimum additioné de méthionine.
• 10 à 80% des survivants sont des mutants :
• Auxotrophies, source d’energie, gènes cataboliques...
• Réarrangements plasmidiens : délétions, pertes, génération
de pMOL50-like accompagné de la sensibilité aux métaux
lourds.
• Les élements IS sont impliqués dans la Tsp(IS1086).
• Tsp est régulé par un locus chromosomique.
• D’autres stress comme la congélation et la coexistence des réplicons
incompatibles induisent des mutations de type Tsp.
Phénotype Tsp

6. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 6 © VITO
Distribution du phénotype Tsp parmi les souches
Ralstonia métallorésistantes
Souche Génotypes de résistance aux métaux lourds Origine Phénotypes des mutants obtenus
CH34 czc, cnr usine de zinc; Liège; Belgique. Ace-
, Amm-
, Aut-
, Czc-
, Dca-
,Gld-
, Lct-
, Lys-
,
Met-
, Nar-
, Pro-
, Ser-
, Thr-
,Tyu-
AB2 czc tailing d'une usine métallurgique;
Kipushi; Congo.
Czc-
, Ilva-
, Lac-
, Nar-
, Pro-
, Val-
AS39 czc, cnr " Likasi-sud; Congo. Aut-
, Czc-
, Nar-
, Pro-
, Thr-
, Tyu-
AS167 czc, cnr " " Arg-
, Aut-
, Czc-
, Lac-
AS168 czc, cnr " " Lct-
, Lys-
, Met-
Sh2-1 czc " " Aut-
, Czc-
, Lys-
KT01 czc, cnr station d'épuration; Göttingen; Allemagne. Aut-
, Czc-
, Lys-
KT02 ncc " Czc-
, Lys-
KT21 czc " Aut-
, Pro-
, Tyu-
31A ncc bassin de galvanisation; Holzminden;
Allemagne.
Lys-
, Pro-
,Thr-
SV661 czc, cnr usine de métallurgie; Beerse; Belgique. Aut-
, Czc-
, Lys-
, Nar-
ER122 czc usine de métallurgie; Overpelt; Belgique. Czc-
, Ilva-

7. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 7 © VITO
Arbre phylogénétique ARDRA

8. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 8 © VITO
I. Le gène dnaK de la souche CH34 («R.eutropha»/Alcaligenes ») et le
phénotype mutateur
Le gène dnaK a été cloné et séquencé ce qui nous a permis d’isoler un mutant qui
n’exprime plus ce gène. A 33°C, la croissance de ce mutant dnaK est ralentie mais
son compte viable n’est pas affecté ; le mutant ne pousse absolument plus à 35°C
(Table 2). A 34°C, on observe la même mortalité qu’à 37°C pour le sauvage et avec
un haut pourcentage de mutants parmi les survivants. Les phénotypes observés sont
cependant différents : on n’observe pas de lys mais des auxotrophes pour le
phosphate ou la sérine, types de mutants qui n’avaient jamais été observés jusqu’à
présent. Mais aussi bien à 34°C chez le dnaK qu’à 37°C chez le sauvage on observe
une fenêtre d’un degré avant la létalité complète, qui permet la sélection de mutants.
Il semble aussi que la mutation dnaK n’affecte pas vraiment l’efficacité du phénotype
mutateur ni même son fonctionnement.
Mutagenèse du gène dnaK

9. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 9 © VITO
Chinese hamster
C. elegans
D.melanogaster
Pavlova lutherii
Cryptomonas phi
Ondotella sinensis
Thermus aquaticus
Halobacterium cutirubrum
Halobacterium marismortui
Agrobacterium tumefaciens
Rhizobium meliloti
Caulobacter crescentus
Burkholderia cepacia
E. coli
Salmonella typhimurium
Hemophilus ducreyi
Hemophilus influenzae
Francisella tularensis
Chlamydia trachomatis
Borrelia burgdorferi
Bacillus megaterium
Bacillus subtilis
Lactococcus lactis
Staphylococcus aureus
Clostridium perfringens
Methanosarcina mazei
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium leprae
Streptomyces coelicolor
Clostridim acetobutylicum
Hydra magnipapillata
A. eutrophus CH34
Eucaryotes,
animaux et
végétaux
Protéobactéries
Bactéries à Gram+
Ratus norvegicus
Phylogénié basée sur la séquence de DnaK/HSP70

10. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 10 © VITO
U : amorce sens de pPw78
R : amorce antisens de pPw78
plac
Tet
oriColE1
oriT
oriF
pPw78:: dnak
TGA
2016
dnak23
dnak23
pPw78dnak
pPw78
R
reverse
reverse
1200 bp
ATG
1
Gène dnaK chromosomique
dnak22
Plasmide suicide pPW78 contenant un
fragment du gène dnaK de 1227 bp.
Recombinaison homologue et
intégration dans le chromosome
R U
~
=
Tet
ATG
dnak18
promoteur
Chromosome Chromosome
U
universel
2016
Stratégie de mutagenèse

11. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 11 © VITO
souche génotype 25°C 30°C 33°C 34°C 35°C 37°C 38°C
CH34 sauvage 1 1 1 1 1 10 à 10
-4 -5
0
AE2525 dnaK10
(a)
1 1 1 5 x 10
-5
0
(d)
0 0
(c)(b)
a) le mutant dnaK10 a été obtenu par recombinaison homologue avec un plasmide TetR
contenant un
fragment du gène dnaK de R. eutropha-like CH34. Les comptes viables d'AE2525 se font en
présence de
tétracycline. La fréquence de survie 1 correspond à un compte viable de 5 x 108
; 0 = une
fréquence
inférieure ou égale à 2 x 10-11
)
(b) Croissance ralentie
(c) Parmi 150 survivants à 34°C testés pour la présence de mutations : les phénotypes suivants
ont été
retrouvés : 7 Aut-
, 9 Pho-
(auxotrophes pour le phosphate), 1 Aut-
Pho-
, 1 Ser‑
et 1 Pro-
(d) Après 5 jours d'incubation, quelques colonies apparaissent (suppresseurs ?).
Réponse à la température du mutant dnaK-

12. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 12 © VITO
Les résultats rapportés (comptes viables et production de mutants dans 80 cultures (40 cultivées à
29° et 40 cultivées à 37°C) suggère que maintes mutations préexistent à 29°C et que le phénotype
mutateur existe aussi à cette température. Mais apparemment seule l’exposition prolongée à 37°C
permet de sélectionner certains phénotypes thermorésistants comme celui qui accompagne
l’auxotrophie pour la lysine mais l’événement, qui cause cette mutation, semble pouvoir être
généré aux deux températures.
Par ailleurs, ces mutants lys-
dont le compte viable sur boîtes est à peine affecté à 37°C affecté à
continuent de muter à 37°C : ceci est observé aussi bien milieu liquide que sur boîtes :on peut
donc apparemment séparer l’effet de mortalité de la mutagenèse et donc maintenir celle-ci à un
niveau extrêmement élevé par rapport au compte viable. Cette observation pourrait trouver une
application dans la mutagenèse dirigée (extension du spectre de dégradation de certaines familles
de substrats récalcitrants).
Approches du phénotype mutateur en cultures liquides

13. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 13 © VITO
T° Temps de
culture
avant
étalement
T° incubation
des comptes
viables
Pourcentage de
mutants dans les
répliques
Phénotypes
29° 22h
(a)
37° 34 %
(17 / 50)
8 Aut
-
, 3 Lys
-
, 4 Thr
-
, 1 Cnr
-
,
1 Aut
-
Czc
-
37° 22h
(b)
37° 60 %
(30/ 50)
21 Aut
-
, 6 Lys
-
, 2 Thr
-
,
1 Lys
-
Czc
-
Cnr
-
29° 22 h
(a)
29° 5%
(10 / 200)
2 Czc
-
, 8 Aut
-
29° 260 h
(c)
29° 5,6 %
(9 /160)
1 Czc
-
, 8 Aut
-
37° 22 h
(b)
29° 3 %
(12 / 400)
2 Czc
-
, 5 Aut
-
, 3 Lys
-
, 1 Thr
-
, 1 Cnr
--
37° 260 h
(d)
29° 71 %
(280/394)
155 Czc
-
, 43 Aut
-
, 25 Lys
-
, 7 Thr
-
,
1 Aut
-
Cnr
-
, 31 Aut
-
Czc
-
,
9 Aut
-
Czc
-
Cnr
-
,
9 Lys
-
Czc
-
Cnr
-

14. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 14 © VITO
Une préculture en milieu minimal en fin de phase log. a été inoculée dans à 400mL de
milieu LB (5.105
cell/mL) divisés en 80fractions de 5 mL incubées dans des tubes à essai: 40
à 29°C et 40 à 37°C. A la fin des temps indiqués, les cultures sont titrées aux deux
températures et les comptes viables sont testés par répliques pour la présence de mutants.
Les résultats des répliques présentés ici concernent une seule culture caractéristique ou
significative.
a)&c) Les cultures à 29°C ont un titre moyen de 2.109
ufc/mL; leurs comptes viables ont une
survie moyenne de 4.3.10-4
(a) et 3,4.10-5
(c).
b)les cultures à 37°C sont quasi limpides ; titre moyen à 29°:1,1.103
, à 37°: 13 ufc/mL.
c) sur les 40 cultures à 29°C, seules 9 fournissent quelques mutants pour l’effectif testé (100
colonies): l’exemple montré indique la limite supérieure
d)sur les 40 cultures à 37°C, 5 ne contenaient que des prototrophes (en fait des mutants
thermorésistants), 1 que des Lys-
, 1 que des Aut-
, 11 étaient entierement mutantes avec une
fraction de mutants doubles et multiples, 22 contenaient un mélange de mutants et de
prototrophes.
Cultures en milieu liquide et production de mutants

15. DIENST INFORMATIESYSTEMEN FILE 15 © VITO
Ces observations induisent de nombreuses questions parmi lesquelles :
- la température n’a-t-elle qu’un effet de sélection de certains phénotypes ou doit-on
considérer qu’elle puisse aussi induire certains événements (remarquons à cet égard, que
d’autres stress (comme la coexistence forcée entre deux réplicons incompatibles)
génèrent dans la souche CH34 de hautes fréquences de mutants producteurs de mélanine
(tyu-
) ) ?
- le phénotype mutateur (qui apparaît ici comme un caractère taxinomique) est-il
vraiment lié à la survie dans des biotopes hostiles ? ; et dans ce cas, est-il une illustration
d’un système vivant où une réparation de type SOS serait «surexprimée » pour garantir
l’adaptation évolutive dans un environnement hostile à défaut d’une survie adéquate ?
- les mutations qui sont générées par ce phénotype mutateur offrent-elles un avantage
quelconque à la bactérie ? Peut-on utiliser ce phénotype pour une sélection de
type «positif» ?
- comment sont générées les mutations multiples comme celles que l’on observe dans les
remaniements plasmidiens ?
CONCLUSION