Relatório - Extração de DNA e Eletroforese

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Relatório referente às práticas de extração de DNA e eletroforese realizadas nos dias 18 e 25/8/2009, para o primeiro semestre do curso de Medicina na Universidade Católica de Brasília.
Professora: Rosângela Vieira de Andrade

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Relatório - Extração de DNA e Eletroforese

  1. 1. UNIVERSIDADE CATÓLICA DE BRASÍLIA CURSO DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR RELATÓRIO EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE MARIANA SANDOVAL, MARINA SOUSA DA SILVA, RAQUEL MATIAS DO NASCIMENTO, REBECA ALEVATO DONADON BRASÍLIA 2009
  2. 2. 1 MARIANA SANDOVAL, MARINA SOUSA DA SILVA, RAQUEL MATIAS DO NASCIMENTO, REBECA ALEVATO DONADON RELATÓRIO EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE Relatório referente às práticas de extração de DNA e eletroforese realizadas nos dias 18 e 25/8/2009, para o primeiro semestre do curso de Medicina na Universidade Católica de Brasília. Professora: Rosângela Vieira de Andrade Brasília 2009
  3. 3. 2 Sumário 1. Introdução............................................................................................................................ 3 2. Material e Métodos .............................................................................................................. 6 2.1. Material ....................................................................................................................... 6 2.2. Métodos ...................................................................................................................... 7 3. Resultado e Discussão........................................................................................................9 4. Referências Bibliográficas................................................................................................. 10
  4. 4. 3 1. Introdução A eletroforese foi inicialmente proposta por Arne Teselius (1937) como técnica empregada para visualização de proteínas de acordo com as diferenças de comprimento dos fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas.1 A simplicidade e rapidez da técnica impulsionaram seu aprimoramento e uso, atualmente, para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA. A visualização do DNA por eletroforese baseia-se na carga negativa que os fosfatos conferem ao DNA. Um gel é preparado com pequenos poços – utiliza-se um pente antes de o gel secar – para a deposição do material. O gel é então submetido a uma diferença de potencial elétrico. A presença da carga negativa deve ser combinada com a adição de solução salina para maior eficiência na condução elétrica. Posteriormente, há um deslocamento dos ácidos desoxirribonucléicos de acordo com o tamanho das moléculas, as de menor massa apresentam maior velocidade de migração enquanto que as de maior massa são mais lentas.1,2 Figura 1: Carga negativa apresentada pelo DNA devido ao grupo fosfato.3 Os géis utilizados podem ser de agarose ou poliacrilamida. O gel de agarose, utilizado nesta prática, apresenta maior extensão de separação quando comparado ao de poliacrilamida, dessa forma é possível visualizar longos fragmentos de DNA.4
  5. 5. 4 A eletrofore se mostra mais eficiente para determinar fragmentos de DNA do que outros processos como a centrifugação através de gradiente de concentração,4 e é utilizada em testes de paternidade, identificação de criminosos e ainda, quando combinada a outras técnicas como por exemplo enzimas de restrição possibilita à indústria farmacêutica produção de vacinas, remédios e à agropecuária produção de transgênicos.5 Esta prática combinou a extração do DNA de amostras sanguíneas de crianças com leucemia linfóide aguda com a técnica da eletroforese a fim de visualizar o DNA em luz ultravioleta. As leucemias são doenças crônicas ou agudas em que as células-tronco dos tecidos sanguíneos são incapazes de maturar-se normalmente e apresentam replicação desregulada. As células do sangue acabam sendo substituídas por células tumorais e a doença configura-se.6 A leucemia linfóide aguda é também conhecida como leucemia linfóide aguda da infância, leucemia linfolítica e LLA. Caracteriza-se pelo crescimento incontrolável e exagerado, além do acúmulo, de linfoblastos – os quais já não funcionam como células normais – e pelo bloqueio da produção normal de células da medula, o que gera uma deficiência de glóbulos vermelhos (anemia), plaquetas (trobocitopenia) e glóbulos brancos (neutropenia). 7
  6. 6. 5 Figura 2: Comparação visual entre as medulas ósseas de paciente normal e paciente com LLA.7 A LLA ocorre em todas as idades, sabe-se que há maior frequência na primeira década da vida e em indivíduos mais idosos.7 Em crianças há o melhor prognóstico.8 O tratamento é prolongado, entre 2 e 3 anos, e sempre associado à quimioterapia. A alta quantidade de estudos acerca da causa da LLA sugere que fatores complexos estão envolvidos, a origem, entretanto, na maioria dos casos, não é evidente.7 A. Aparência da medula óssea normal com seu amplo conjunto de formas de células, que representamo desenvolvimento normal das células B. A medula substituída por linfoblastos em um paciente com leucemia linfóide aguda. As células normais não são evidentes
  7. 7. 6 2. Materiale Métodos 2.1. Material DNA: extração de DNA de célula dos elementos figurados do sangue de pacientes com leucemia linfóide aguda. Agarose: é um polissacarídeo que forma uma rede para segurar as moléculas durante a migração e é utilizado na forma de gel para a eletroforese. Solução tampão: foi utilizado o tampão preparado a partir de tris-acetato EDTA. Sendo o pH desses tampões básico, o grupo fosfato é desprotonado, resultando em uma carga líquida negativa induzindo a migração na cuba para o cátodo.Esse tipo de tampão é utilizado quando queremos recuperar o DNA e quando a eletroforese é de DNA grande tamanho(>12Kb). Para a extração do DNA utilizamos a pipeta p200, para termos uma solução de sangue e água destilada que colocamos em um tubo de eppendorf; esse tudo vai para o Vórtex da marca Phoenix, que consiste em um instrumento para misturar substancias em tubos ou frascos pequenos por meio de movimento circular com operação contínua e possibilidade de mudar a freqüência da vibração. Após o Vórtex, levamos o eppendorf para a centrifuga da marca Mini spin, que cria força centrífuga girando os materiais rapidamente em torno de um pólo central, para isso deve-se ter cuidado com o balanceamento de cargas , ou seja , a centrifuga deve estar equilibrada, pois a agitação causada pelo desequilíbrio pode quebrar os tubos. Após a adição de todos os reagentes (que serão descritos no tópico Métodos), levamos a solução para o Banho –Maria da marca Nova técnica .
  8. 8. 7 Na eletroforese utilizou-se uma cuba eletrolítica da marca Hoefer, uma peça no formato de um pente para delimitar os poços. Ainda utilizamos um béquer para descarte de materiais e das ponteiras utilizadas nas pipetas. 2.2. Métodos Primeiramente o DNA foi preparado, pipetando 300µLde sangue com 1000µL de água destilada, essa solução foi colocada no Vórtex por 15 segundos para que aconteça a quebra mecânica; logo após colocamos na centrifuga para que haja a separação do plasma dos elementos figurados(pellet). Adicionamos mais 1000µL de água destilada e levamos novamente para centrifugação, adicionamos Buffer A(700µL) , Buffer B(500µL) ,SDS 10%(50µL) e Proteinase K(10mg/ml) nesta ordem para haja a quebra da membrana e nuclear colocando assim o DNA em suspensão, a proteinase K faz a quebra das histonas deixando a molécula descondensada. Após a adição de todos esses reagentes levamos a solução com apenas os elementos figurados para o Banho-Maria(65C) por 10 minutos; depois desse processo adicionamos200µL NaCl(6M) que faz o ataque à molécula deixando-a mais leve e suspendendo-a; os restos da célula decantam. Adicionou-se etanol, o qual reagiu com o NaCl, liberando o DNA, que precipitou. O gel de agarose foi preparado com 0,5 g de agarose com a solução tampão EDTA; essa solução foi levada para o aquecimento(microondas) fazendo com que os polímeros fossem aquecidos para a formação da gelatina. Após a fusão colocou-se brometo de etídio com o objetivo de fazer o material genético brilhar
  9. 9. 8 quando exposto à luz UV, pois ele intercala na molécula do DNA mas não a altera. Com isso pudemos acompanhar a corrida do DNA pelo gel. O endurecimento do gel já foi feito na própria cuba onde a corrida ocorreria. Colocamos um pente no gel para criar poços, nos quais foram colocadas as amostras. Ligou-se a cuba eletrolítica a dois pólos, criando uma diferença de potencial; o DNA tem carga líquida negativa e por isso a molécula corre para o ânodo (pólo positivo). Para os devidos resultados comparamos os rastros das amostras extraídas, com uma amostra padrão, neste caso, de vírus bacteriófago.
  10. 10. 9 3. Resultado e Discussão A prática de eletroforese, discutida na introdução, consiste em criar uma DDP entre os dois pólos opostos do gel em que será colocado o DNA, que possui carga total negativa devido aos grupos fosfatos presentes em sua molécula. Sendo assim, este irá migrar para o ânodo (pólo positivo). No início, achamos que a nossa extração de DNA, grupo 10, não iria dar certo, pois havia pouco material (DNA pouco concentrado). Sabendo disso, modificamos a etapa 22 de diluição – ao invés de colocarmos 100uL de TE, colocamos 20uL. Assim, todos os experimentos realizados por nossa turma - do grupo 7 ao 12 foi extraído DNA dos elementos figurados do sangue de pacientes com leucemia linfóide aguda, já o grupo 12’ extraiu DNA do ovócito de uma passarinha, ou seja, de um óvulo não fecundado, tendo o mesmo resultado dos outros grupos, como pode ser observado na foto (Imagem 3) - tiveram bons resultados: o DNA migrou como esperado. A extração do DNA e a eletroforese deram certo, pois todos os materiais estavam devidamente limpos, a centrífuga calibrada e fomos bem cuidadosos em colocar o DNA extraído no gel de agarose, não o deixando extravasar muito. Imagem3: Foto do gel de agorose sob luz UV. É possível a vizualização de todas as amostras, ilustrando a eficiência da prática. A amostra 10, destacada, refere-se a este grupo.
  11. 11. 10 4. ReferênciasBibliográficas 1. MARTINEZ, E. R. M e PAIVA, L. R. S. Eletroforese de ácidos nucléicos: uma prática para o ensino da genética. < http://www.geneticanaescola.com.br/ano3vol 1/9.pdf> Acessado em 25 de setembro de 2009. 2. WIKIPEDIA. Eletroforese em gel. <http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_ em_gel> Acessado em 22 de setembro de 2009. 3. E-PORTEFOLEO.<http://e-porteflio.blogspot.com/2008/09/estrutura-do-dna.html> Acessado em 25 de setembro de 2009. 4. TEXEIRA, A. B. Manual da aula prática de eletroforese para DNA. < http://br.geocities.com/andbt/biofisica/Manual.PDF> Acessado em 25 de setembro de 2009. 5. LABORATORIO DE BIOLOGIA. Enzimas de restrição e eletroforese. São Paulo, 2003. Trabalho de graduação. Instituto de Física de São Carlos. Universidade de São Paulo. < http://educar.sc.usp.br/licenciatura/2003/siteprojeto/2003/6_enzima_ e_gel.pdf> Acessado em 25 de setembro de 2009. 6. THOMAS, C.L. Dicionário Médico Enciclopédico Taber. 17ª ed. São Paulo: Manole, 2000. 2279 p. 7. ABRALE. Leucemia Linfóide Aguda. 1 ª ed. São Paulo, 2004. < http://www.abrale.org.br/apoio_paciente/publicacoes/manuais/leucemia_linfoide_ aguda.pdf > Acessado em 22 de setembro de 2009. 8. MONTEIRA, I. M. U. Tratamento de leucemia linfóide aguda em meninas: repercussões sobre o desenvolvimento puberal e crescimento. Campinas, 1994. 94 p. Dissertação de mestrado. Universidade Estadual de Campinas.

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