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Citometría de Flujo
Citometría de Flujo ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Parámetros ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Ventajas ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
FLUOROCROMOS ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
FLUOROCROMO DESCRIPCION FITC Isotiocianato de Fluoresceína PE Ficoeritrina PerCP Proteína Clorofila Peridinina TRITC Isotiocianato de tetrametil rodamina 540---570 PEC Ficoeritrina cianina RT Rojo Texas 596----615nm PC Ficocianina 620---650nm APC Aloficocianina  650-----660nm TRICOLOR TRICOLOR 540--------570nm ALEXA-FLUOR FLUOROCROMO : Molecular Probes
CITOMETRO
SISTEMAS OPTICOS
Como se preparan las muestras?? ,[object Object],[object Object],[object Object]
CITOGRAMAS ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
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FUNDAMENTOS DE LA  CITOMETRÍA DE FLUJO
¿Qué es la citometría de flujo? FSC 90º 2- 4º Columna  de muestra Meeting point Láser Detectores de luz Amplificación digitalización Representación y Analisis  Flujo
¿Cómo funciona un citómetro? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
1.1. SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA MUESTRA AIRE FLUJO MUESTRA
1.2. Cámara  de flujo FSC 90º Fluido envolvente Columna  de muestra Luz dispersada lateralmente  y luz fluorescente,   = 90 º Luz incidente Luz dispersada hacia delante,   = 2- 4º
Luz dispersada a 90 grados  (Side SCattered light ) Detector FSC Detector de 90º SSC Laser
DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje  proporcional al tamaño de la célula/particula FSC SSC
DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad) FSC SSC
Granulocitos CD15+ Monocitos CD14+ Linfocitos CD3+ T2ab T1gd CD4+ CD8+ CD56+ CD19+ CD5+ CD5- Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular
Laser Detectores de fluorescencia Fluorescencia Detector Detector de fluorescencia (PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescencia FSC FL-1 FL-2
Fluorescencia ,[object Object],[object Object],t (  s) E  1 <  2    1    2
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Espectros ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Intensidad de  fluorescencia   nm    excitación medida
DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA TC PerCP QR Cy5 APC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 Detectores Fluorocromos
Escalas FSC Ej: Lineal FL-1 Ej: Logarítmica
Compensación de señales ,[object Object],[object Object],[object Object],excitación medida Intensidad de fluorescencia FL-1 FL-2 l
Representación monoparamétrica de datos.   Histogramas.  Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.
Histogramas SSC FSC FL-1 FL-2 FL-3
Representación biparamétrica en 2D Diagrama de puntos / dot plot + + - - + + - - FL-1 FL-2
Representación 3D  Countour plot  /  Diagramas de contornos X, Y más una tercera dimensión.  La altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros. Densidad=altura Diagrama de dot plot density Usa colores para representar densidad
Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos  Sitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés. Selección de la información Gates (Puertas) / ventanas (windows)
Estadisticas  biparamétricas ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],+ - - + + - + - U L U R LL L R

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  • 6. FLUOROCROMO DESCRIPCION FITC Isotiocianato de Fluoresceína PE Ficoeritrina PerCP Proteína Clorofila Peridinina TRITC Isotiocianato de tetrametil rodamina 540---570 PEC Ficoeritrina cianina RT Rojo Texas 596----615nm PC Ficocianina 620---650nm APC Aloficocianina 650-----660nm TRICOLOR TRICOLOR 540--------570nm ALEXA-FLUOR FLUOROCROMO : Molecular Probes
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  • 12. FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
  • 13. ¿Qué es la citometría de flujo? FSC 90º 2- 4º Columna de muestra Meeting point Láser Detectores de luz Amplificación digitalización Representación y Analisis Flujo
  • 14.
  • 15. 1.1. SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA MUESTRA AIRE FLUJO MUESTRA
  • 16. 1.2. Cámara de flujo FSC 90º Fluido envolvente Columna de muestra Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente,  = 90 º Luz incidente Luz dispersada hacia delante,  = 2- 4º
  • 17. Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light ) Detector FSC Detector de 90º SSC Laser
  • 18. DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula FSC SSC
  • 19. DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad) FSC SSC
  • 20. Granulocitos CD15+ Monocitos CD14+ Linfocitos CD3+ T2ab T1gd CD4+ CD8+ CD56+ CD19+ CD5+ CD5- Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular
  • 21. Laser Detectores de fluorescencia Fluorescencia Detector Detector de fluorescencia (PMT3, PMT4 etc.)
  • 23.
  • 24.
  • 25.
  • 26. DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA TC PerCP QR Cy5 APC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 Detectores Fluorocromos
  • 27. Escalas FSC Ej: Lineal FL-1 Ej: Logarítmica
  • 28.
  • 29. Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.
  • 30. Histogramas SSC FSC FL-1 FL-2 FL-3
  • 31. Representación biparamétrica en 2D Diagrama de puntos / dot plot + + - - + + - - FL-1 FL-2
  • 32. Representación 3D Countour plot / Diagramas de contornos X, Y más una tercera dimensión. La altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros. Densidad=altura Diagrama de dot plot density Usa colores para representar densidad
  • 33. Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos Sitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés. Selección de la información Gates (Puertas) / ventanas (windows)
  • 34.