Les Impuretés dans les Principes Actifs d'Origine Biotechnologique

20ème conférence plénière organisée par Quality Assistance s.a.
« Les Impuretés dans les Principes Actifs
d'Origine Biotechnologique »
Jean-François BOE - Head of Analytical Section - Institut de Recherche Pierre Fabre
Laurent DUHAU - Global Biotherapeutics / Head of Analytics & Formulation - Sanofi Aventis
Olivier LALOUX - Technology Platform Analytical R&D, Director - GlaxoSmithKline Vaccines
Nicolas MOUZ - CEO - Promise Advanced Proteomics
Géry VAN VYNCHT - R&D Director - Quality Assistance
1
Géry Van Vyncht, R&D Director, S&I Dpt, Quality Assistance
09.12.2014

Exposé des travaux de la Commission SFSTP (Société Française des Sciences et
Techniques Pharmaceutiques) de 2011 à 2013
Présentation à Paris le 24 mai 2013
Différentes catégories d’impuretés potentiellement présentes dans une substance
active d’origine biotechnologique.
Evaluation globale de la criticité en termes de sécurité et d’efficacité
Une ou plusieurs solutions analytiques et une stratégie de contrôle adaptée
2
09.12.2014

PROGRAMME DE LA CONFERENCE
16:30 - 16:35 Accueil / présentation de la conférence - G.VanVyncht
16:35 - 16:43 Introduction, contexte et objectifs - J-F.Boé
16:43 - 16:50 Importance thérapeutique et économique des produits biologiques - N.Mouz
16:50 - 17:00 Structure / Fonction des mAbs - J-F.Boé
17:00 - 17:10 Principe de production des mAbs - N.Mouz
17:10 - 17:20 Notion d’hétérogénéité des produits biologiques - O.Laloux
17:20 - 17:35 Stratégie de contrôle et contexte réglementaire - L.Duhau
17:35 - 17:45 Break
17:45 - 18:05 L’analyse des impuretés liées au procédé de fabrication - O.Laloux
18:05 - 18:25 L’analyse des impuretés liées au produit - Variants de masse - L.Duhau
et J-F.Boé
18:25 - 18:50 L’analyse des impuretés liées au produit - Variants de charge, de glycosylation
et variants conformationnels - G.VanVyncht
18:50 - 19:00 Conclusion et Q&A
3Présentationsuivante

Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1
Copyright SFSTP 2011
PRESENTATION DES TRAVAUX DE LA COMMISSION SFSTP
Les impuretés dans les principes actifs biologiques et
biotechnologiques

INTRODUCTION

Le contexte
Les produits biologiques ont une importance
médicale et économique croissante.
Les technologies progressent rapidement
Procédés de fabrication
Techniques analytiques
Les produits sont de mieux en mieux caractérisés.
L’analyse reste complexe et le niveau de
connaissance est à adapter au stade de
développement.
Émergence des biosimilaires
Contexte réglementaire en évolution constante

Le contexte
De nombreuses questions se posent.
Quel niveau de caractérisation et à quel stade de la vie du
produit ?
Quelles méthodes choisir ?
Définir une stratégie de contrôles
C’est pour apporter des éléments de réponse que la
commission a été mise en place

Les membres de la commission
Alain Beck Pierre-Fabre
Jean-François Boé Pierre-Fabre Président
Aude Carrié Ceva
Katia Chohbane Eusapharma
Laurent Duhau Sanofi Aventis
Olivier Laloux GSK BIO (Belgique)
Nicolas Mouz Px-Therapeutics
Elise Richard Avogadro
Luc-Alain Savoy SGS (Suisse) Vice-président
Gery Van Vyncht Quality Assistance
(Belgique)
Yannick Vuillamy Eurofins Vice président
Maria Zanta-Boussif Novartis (Suisse)

Objectif de la commission
Établir un consensus sur la recherche des impuretés
dans les produits biologiques.
Proposer des recommandations qui aideront à
établir une stratégie de contrôle analytique, adaptée
au stade de développement du produit.

La méthodologie retenue
Prise en compte de la particularité des produits
biologiques.
Anticorps monoclonaux utilisés comme modèle
Revue des différents types d’impuretés
Évaluation de leur potentielle criticité
Proposition de stratégies de contrôle adaptées:
Revue des méthodes analytiques utilisables
Choix des méthodes à mettre œuvre en
caractérisation/libération/stabilité
Limites d’acceptation

Les Produits biologiques
Un médicament d’origine biologique est :
Un produit dont la substance active a été produite ou extraite à partir
d’une source biologique et dont la caractérisation et la détermination
de la qualité nécessitent un ensemble d’essais physico-chimiques et
biologiques, ainsi que la connaissance de son procédé de fabrication et
de son contrôle (cf directive Européenne 2001/83).
Une des particularités des produits biologiques réside dans
leur complexité structurale et leur hétérogénéité:
Hétérogénéité structurale liée à la nature de la molécule et au système
de production.
Le fabricant doit définir le profil d’hétérogénéité du produit et en
démontrer la reproductibilité.

Pureté des produits biologiques
La notion de pureté appliquée à un produit biologique est
relative:
1. le produit n’existant pas sous forme d’un seule espèce
moléculaire
2. la pureté mesurée est également fonction des méthodes
analytiques utilisées.
En conséquence la pureté doit être évaluée par une
combinaison de méthodes basées sur des principes différents
méthodes orthogonales
Présentationsuivante

www.sfstp.org 1Copyright SFSTP 2011
Importance thérapeutique et économique des
produits biologiques

Importance thérapeutique et économique des produits
biologiques
Biothérapeutiques
246 produits biologiques approuvés sur les
marchés US et EU
54 nouveaux biologiques 2010-2014 dont 17
anticorps thérapeutiques
Chiffres d’affaires
Anticorps thérapeutiques
Indications
Raisons du succès
Variétés de structures
Anticorps et dérivés approuvés
Biosimilaires, biobetters et nouvelles générations

Protéines & anticorps thérapeutiques recombinants:
chiffres d’affaires 2012/2013
La Merie 2013

4
6 mAbs sur les 10 biologiques les plus vendus
Biopharmaceutical benchmarks 2014, G. Walsh. Nat. Biotechnol 32, 992 (2014)

Importance thérapeutique et économique des produits
biologiques
Biothérapeutiques
Chiffres d’affaires
Indications
Raisons du succès
Variétés de structures
Anticorps et dérivés approuvés
Biosimilaires, biobetters et nouvelles générations

Anticorps monoclonaux (AcM) et dérivés
Immunoglobulines de type G (IgGs)
Environ 50 AcM & dérivés approuvés (EMA/FDA)
Indications thérapeutiques multiples
Maladies inflammatoires et auto-immunes, cancers
Transplantation, maladies infectieuses, cardiovasculaires, sanguines,
allergies et ophtalmiques
Plus de 400 en pré-clinique et en clinique
Premiers biosimilaires anticorps approuvés
Inflectra (Hospira) Remicade/infliximab
Remsima (Celltrion) Remicade/infliximab

AcM: raisons du succès
Thérapies ciblées avec une très forte sélectivité
h7C10/ dalotuzumab = antagoniste de IGF-1R et non du récepteur à l’
Insuline (70 % homologie de séquence)
Goetsch L, Beck A et al, Int J Cancer Res 2005
IgGs = PK favorable (jusqu’à 3 semaines)
Faible toxicité (10 g/L IgG endogènes dans le plasma)
Procédé de production mature et transférable (2 à 20,000 L)
De nombreuses méthodes analytiques « génériques »
Taux de succès plus important de la Phase I à l’AMM:
AcM (25-29 %) vs petites molécules (11 %)
Reichert JM, mAbs 2013

IgG approuvées: « nues » & conjuguées
Beck A et al, Médecine Sciences 2009
IgG:
Murine
Chimerique
Humanisée
Humaine
Isotype:
1, 2 ou 4
IgG-
conjuguées:
Cytotoxique
Radio-
isotope
Hybr
CHO
NS0SP2/0

Fab et
Protéines/Peptides de fusion Fc
Fab
Monovalent
½ vie courte
Fab Pegylé
Monovalent
½ vie
longue
TNFR-Fc
Récepteur
soluble
Peptide-Fc
Long ½ life
Beck A et al, Médecine Sciences 2009
E. coli CHO E. coli

2014 ramucirumab (VEGFR2) siltuximab(IL6) vedolizumab (a4b7) + Secukimab, dinutuximab, nivolumab,
pembrolizumab
2013 itolizumab(CD6)[Ind] ado trastuzumab emtansine(HER2)
2012 mogamulizumab[low Fuc]
(CCR4)[Jpn] pertuzumab(HER2) ziv-aflibercept[PrFc]
(VEGF) raxibacumab(antrax)
2011 brentuximab vedotin[IgG1-vcMMAE]
(CD30) belatacept[PrFc]
(CD80/86) aflibercept[PrFc]
(VEGF)
belimumab(BLysS) ipilimumab(CTLA-4)
2010 denosumab[IgG2]
(RANK-L)
2009 golimumab(TNFa) catumaxomab(EpCAM/CD3) ustekinumab(IL12/23) canakinumab(IL1) ofatumumab(CD20)
2008 rinolacept[PrFc]
(IL1) certolizumab[Fab-PEG]
(TNFa) romiplostim[FcPe]
(TPO)[Clotinab/”abciximab”, So-Ko]
2007 eculizumab[IgG2/4]
(C5) [Reditux/”rituximab” Ind]
2006 ranibizumab[Fab]
(VEGFA) panitumumab[IgG2]
(EGFR)
2005 nimotuzumab[Chi](EGFR) abatacept[PrFc]
(CD80/86) tocilizumab(IL6R)[Jpn]
2004 cetuximab(EGFR) bevacizumab(VEGFA) natalizumab[IgG4]
(a4 integr)
2003 131I-tositumomab[mIgG2a]
(CD20) omalizumab(IgE-Fc) efalizumab(CD11a)[withdrawn, 2009] alefacept[PrFc]
(CD2)
2002 111In/90Y-ibritumomab tiuxetan[mIgG1]
(CD20) adalimumab(TNFa)
2001 alemtuzumab(CD52)
2000 gemtuzumab ozogamicin[IgG4-calicheamycin]
(CD33) )[withdrawn, 2010]
1998 basiliximab(CD25) palivizumab(RSV-F) infliximab(TNFa) trastuzumab(HER2) etanercept[PrFc]
(TNFa)
Technologies 1997 rituximab(CD20) daclizumab(CD25)
Transgenic mice (10y) 1996
1995 edrecolomab[mIgG2a]
(EpCAM) [Ger, withdrawn]
1994 abciximab[Fab]
(GPIIb)
Phage display (9Y) 1993
Humanization (11Y) 1986 muromomab[mIgG2a]
(CD3)
Chimerization (10 Y) 1984 [1984: Nobel Prize for mAbs]
Therapeutic
Antibodies
& related-
products
landmarks
(INN=
International
Non-proprietary
Names, WHO)
* FDA, EMEA, SFDA and /or DCGI
(SFDA = China FDA;
DCGI = Drugs Controller General of India)
> 50 mAbs, Fabs, Fc-fusions, ADCs, RadioICs,
Bispecs

Biosimilaire
Copie d’un anticorps approuvé avec la même séquence en acides aminés
Produit par un clone et un procédé de fabrication différents
Différence de glycosylation et de micro-variants
Biobetters (ou Biosuperiors)
Anticorps avec une séquence en acide aminé identique ou proche et:
Un profil de glycosylation optimisé (ex. Faible teneur en fucose => ADCC forte)
Ou avec 2 ou 3 acides aminés mutés dans la partie Fc (augmenter la demi-vie)
Nouvelle générations et dérivés
Séquence en acides aminés, épitope, mécanisme d’action différents
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Structure / Fonction

Structure des anticorps
Anticorps = Immunoglobuline (Ig)
Glycoprotéines
soluble dans le plasma et dans de nombreuses
sécrétions
membranaire comme élément du récepteur de
l’Antigène à la surface des lymphocyte B.
Les anticorps sont sécrétés par des
cellules dérivées des lymphocytes B : les
plasmocytes.

Profil électrophorétique de protéines sériques
Support de l’immunité humorale
Concentration circulante = environ 15g/L
Immunoglobulines appartiennent à la fraction g des protéines sériques
Profil très hétérogènes
traduisant la diversité
structurale
des immunoglobulines

Synthèse des immunoglobulines
Cellule souche Progenit. B Cell. B matures
Réarrangement
gènes
Cell. B mémoire
Plasmocyte
Ag
Cell. B naïve
Activation et différentiation Ag dépendante
Maturation indépendante de l’Ag

Anticorps polyclonaux vs monoclonaux
Sélection
Hybridisation
Clones
Ab1
Ab2
Ab3
Ab4
Sérum polyclonal renferme un
mélange d’anticorps spécifique
d’un des quatre épitopes.
2
Ag
1
3
4
Epitopes
1
+
Lignée
myélome
1
3
4
2
Cellules isolées
de rate
Lymphocyte B
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4
Un anticorps monoclonal
dérivé d’une cellule
plasmatique unique est
spécifique d’un seul épitope

Décrite en 1959 par Porter et Edelman (prix Nobel 1972)
4 chaînes polypeptidiques
2 chaînes légères (LC  25 kDa)
2 chaînes lourdes (HC  50 KDa)
Chaînes oligosaccharides
Masse moléculaire
théorique 150 000 Da
LC LC
HC HC
Structure des anticorps monoclonaux

Structure des anticorps monoclonaux
IgG1
16 ponts S-S (4 inter et 12 intra-chaines)
Régions constantes et régions variables
Chaîne lourde = 1 domaine variable (VH) et 3 constants (CH)
Chaîne légère = 1 domaine variable (VL) et 1 constant (CL)
CH2CH3
3 régions hypervariables = CDR’S
(complementary determining regions)
CDR1
CDR3
CDR2Fab :
Fragment
antigen
binding
Fc :
Fragment
cristallisable

Structure-Fonction des anticorps monoclonaux
Fonctions
effectrices
Ag
Fixation aux récepteurs du Fc
Fc g RIIIA, fixation des cellules NK
Antibody Dependent cell cytotoxicity (ADCC)
Cellule NK
FcRn  demi-vie longue
Activation du complément (CDC)
Activités anti-inflammatoires
Fixation de l’antigène
Agoniste
Antagoniste

Structure-Fonction des anticorps monoclonaux
Les modes d’actions des anticorps monoclonaux thérapeutiques
Complexes
Contributions de mécanismes multiples
Kress GB, modified from Hasmann M. 2009

Production des anticorps monoclonaux

La production d’anticorps monoclonaux
Succès thérapeutiques et commerciaux des anticorps
monoclonaux ont induit des besoins en :
Développement rapide de procédés de production
Production en grande quantité d’anticorps thérapeutiques (doses
élevées)
Production à des coûts modérés
La similarité des propriétés biochimiques et
chromatographiques de la classe des anticorps ont permis
aux industries biotechnologiques et pharmaceutiques
d’organiser des:
Plateformes de production (culture cellulaire): plateformes USP
(Upstream processing)
Plateformes de purification: plateformes DSP (Downstream
processing)

Procédés de culture cellulaire pour
la production d’anticorps
La forte demande en anticorps monoclonaux a accéléré les
développements en bioproduction notamment en culture de
cellules mammifères.
20 ans de R&D intensive ont conduit aux développements de:
Lignées cellulaires hautement productives (20 à 100 pg/cell/jour)
Lignées cellulaires robustes en culture en bioréacteur (haute
densité)
Milieux chimiquement définis et optimisés
Stratégies de feed optimisées
Bioréacteurs plus performants (échanges gazeux, on-line
monitoring…)
Bioréacteurs de 20 000 L avec des rendements de 5 à 10 g/L
d’anticorps

Développement de lignée cellulaire
1
•Transfection avec un vecteur d’expression contenant les gènes des chaînes
lourdes et légères + un gène codant pour un marqueur de sélection
2
•Application d’une pression de sélection
3
•Clonage cellulaire par dilution limite, en présence d’une pression de
sélection
4
•Criblage des clones producteurs
5
•Mise à l’échelle en erlen
6
• Amplification du gène
7
•Répétition des cycles d’amplification des gènes et sélection des clones
hautement producteurs
8
• Sélection des meilleurs clones en terme de productivité et de qualité du
produit
9
• Etablissement d’une banque cellulaire
10
• Evaluation de la stabilité de la lignée cellulaire
0
Lignées cellulaires utilisées : CHO, PER.C6, HEK, NS0, SP2/0

Développement d’Anticorps monoclonaux:
Optimisation de l’USP
Criblage de formulations de milieux
(i.e. CHO Media Library)
Analyse de milieux:
Sucres, Acides Aminés, Métabolites
 optimisation des milieux en bioréacteurs de 50 mL
Optimisation des conditions de culture pour optimiser la
productivité
(i.e. Température, Impeller Speed, pH & DO)

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USP Platform
Centrifugation
WCB
Production
Bioreactor
Ex 15000L
Spinner
Flask
Seed culture
expansion in
bags
DSP platform
Depth filtration
Removal of suspended cells and cell
debris
Clarified bulk 0.2 µm filtration
Seed culture
expansion in
bioreactor
Seed culture
expansion in
bioreactor
Ex 3000L
Harvest
6

DSP platform : Example A-Mab
Protein A affinity
chromatography
Remove HCP, DNA,
small molecules
Low pH viral
Inactivation
Filter
0.2 µm
tank
Cation exchange
Chromatography
Reduce aggregates
and HCP
Tank Tank
Tank
Tank
Formulation:
Ultrafiltration and
Diafiltration
UF/DF
Bulk
Drug substance
Small virus retentive
filtration
Anion exchange
Chromatography
Remove HCP, DNA,
Protein A and
endotoxins
Final filtration
Clarified
bulk
Fill and freeze
Filter
0.2 µm
Filter
0.2 µm
Filter
0.2 µm
25 kDa _
50 kDa _
150 kDa _

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pI
HCP
Virus
Endotoxins
DNA
Flow through
Capture
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11pH pI
HCP
Virus
Endotoxins
Capture Flow through
Cation Exchange  Anion Exchange
DSP platform
mAbs mAbs
DNA
pH

Conclusion
 Organisation du développement des anticorps
thérapeutiques en mode plateformes USP et DSP
– Lignées cellulaires hautement productives
– Culture haute densité en bioréacteurs
– Plateforme DSP robuste
– Développement rapide de procédés de production
– Capitalisation des connaissances

Hétérogénéité des produits biologiques

Particularité des produits biologiques
Une des particularités des produits biologiques réside
dans leur complexité structurale et leur hétérogénéité:
Hétérogénéité structurale liée à la nature de la molécule et au
système de production.

Complexité structurale
6 nm 16 nm1 nm
Aspirine
C9H8O4
= 180 Da
Interferon b 1a
(165 amino acids)
C908H1406N246O252S7
= 20 025 Da (Variant principal)
Trastuzumab (IgG1)
(1326 amino acids)
C6560H10132O2090N1728S44
= 148 057 Da (Variant principal)

Hétérogénéité des IgG’s
N-term : PyroGlu
C-term clivage (-lys)
C-term amidation
Variants de N-glycosylation
O-glycosylation
Oxydation (Met, Trp)
Deamidation (Asn  Asp)
Isomerisation (Asp  IsoAsp)
Succinimide (Asn/Asp  Suc)
Glycation (Lys-Glc)
Proteolyse (clivage Asp/Pro)
Dimères et Agrégats
Fragments d’IgG (H2L, H2, HL, H, L)
Mésappariement
Thiol libre
Thioether
Cystéinylation
Remaniement ponts S-S

Hétérogénéité des IgGs
Each half antibody has: 2 x 8 x 4 x 4 x 5 x 5 x 2 = 12800 possible states
Assuming both halves of antibody are independent : (12800)² =~108 possible combinations
D’après Kozlowski & Swann, Advanced Drug Delivery Review, 2006 (58) 707-722
Pyro-E 2
Deamidation 23
Methionine oxidation 2 x 2
Glycation 2 x 2
High mannose, G0, G1, G2 5
Sialylation 5
Clipping of C-term lysine 2
pE
E
M
D
O
iD
E
OO
O
D
D
DD
D
GG
K
K
G
Structural variations #variation/IgG

Hétérogénéité versus Pureté du produit
La notion de pureté appliquée à un produit
biologique est dès lors relative:
le produit n’existant pas sous forme d’un seule espèce
moléculaire (présence de variants apparaissant lors de la
production et/ou conservation du produit).
la pureté mesurée est également fonction des méthodes
analytiques utilisées.
En conséquence la pureté doit être évaluée par une
combinaison de méthodes basées sur des principes
différents

Les contraintes pour le fabricant
Le fabricant doit définir le profil d’hétérogénéité du
produit et en démontrer la reproductibilité vis-à-vis
des lots utilisés lors des études cliniques.
En fonction de leurs propriétés (comparables ou non au
produit recherché), les variants pourront être considérés
comme faisant partie du produit ou bien comme impuretés.
Si le profil d’hétérogénéité du produit est caractérisé et
reproductible, une évaluation de l’activité, efficacité,
sécurité (incluant l’immunogénicité) des formes
individuelles (variants) peut ne pas être nécessaire.

Les guidances ne définissent pas certains aspects:
Étendue de la caractérisation?
Niveaux acceptables?
Interprétation au cas par cas.
Ce manque de « clarté » permet de prendre en compte:
La capacité du process à éliminer certains variants.
La diversité des hétérogénéités, certaines n’étant pas encore
connues.
L’évolution constante des technologies.
Les contraintes légales

STRATEGIE DE CONTRÔLE ET
CONTEXTE REGLEMENTAIRE

Profil de Qualité Cible du Produit (ICH Q8)
Un descriptif des caractéristiques qualité que
doit présenter un produit pharmaceutique pour
obtenir la qualité cible, basée sur l’efficacité et
la sécurité du produit (Quality Target Product
Profile)

Attribut de Qualité Critique –AQC (ICH Q8)
Un AQC est une propriété ou une
caractéristique physique, chimique, biologique
ou microbiologique qui doit être dans un
intervalle ou limite donné pour assurer le profil
de qualité cible du produit
La liste des potentiels AQCs peut évoluer au
cours du développement

Identification des AQCs (ICH Q11)
Identification des AQCs est un challenge pour
les produits complexes
Large nombre d’AQCs pour les produits
biologiques rend impossible une évaluation
complète de chaque AQC sur l’efficacité et la
sécurité
Evaluation de risque peut être utilisée pour
prioriser les AQCs.

Evaluation de risque et AQCs (ICH Q11)
Connaissance préalable utilisable en début de
développement
Connaissance liée au mécanisme d’action et à
la caractérisation biologique (relation structure
activité) peut aider
Evaluation mise à jour au cours du
développement

Classification des AQCs proposée
Classification de la criticité de l’AQC inspirée
du « A-Mab : a case study in Bioprocess
development »,CMC Biotech Working group,
version 2.1, 30th october 2009).
Pour certains AQC (notamment les impuretés
résiduelles), le risque doit être pondéré par la
probabilité d’occurrence

Classification des AQCs proposée
Activité biologique
ou efficacité
PK/PD Immunogénicité Sécurité Action
CRITICITE
FORTE
Changement
important
Changement
important
Impact fort sur la
sécurité et/ou
l’efficacité
Effets
indésirables
Test de libération avec
critères d’acceptation
CRITICITE
MOYENNE
Changement modéré
Changement
modéré
Impact modéré sur
la sécurité et/ou
l’efficacité
Effets
indésirables
acceptables
Possibilité de ne pas
faire le test à libération,
si justification
Pas de test en libération.
Test uniquement réalisé
à des fins de
caractérisation
Pas d’effet
CRITICITE
FAIBLE
Pas de changement
ou changement
acceptable
Pas d’impact
Pas
d’immunogénicité

Stratégies de développement (ICH Q11)
Doit comprendre au minimum:
Identification des AQCs potentiels liés au principe actif
afin qu’ils soient étudiés et contrôlés
Définition d’un procédé de fabrication approprié
Définition d’une stratégie de contrôle
Peut comprendre en plus
Compréhension approfondie du procédé (lien
paramètres procédé - AQCs)
Stratégie de contrôle adaptée (Gestion Risque qualité
/Design space)

Stratégie de contrôle (ICH Q10-ICH Q11)
Une stratégie de contrôle est un ensemble de
contrôles qui assure la performance du
procédé et la qualité du produit
Basée sur la compréhension actuelle du produit et
du procédé
Stratégie de contrôle peut être développée par
une approche combinée, traditionnelle pour
certains AQCs/étapes et plus avancée pour
d’autres.

Stratégie de contrôle (ICH Q11)
Stratégie de contrôle peut comprendre:
Contrôles de différents matériaux (matières
premières, réactifs, conditionnement primaire,..)
Contrôles implicites liés au design du procédé de
fabrication
séquence des étapes de purification
Contrôles en cours de fabrication
contrôles et paramètres procédés
Contrôles du principe actif
tests à libération,..

Approche suivie
La stratégie de contrôle présentée a pris en compte les
différents textes réglementaires disponibles (cf article
SFSTP)
Une liste des différentes impuretés a été établie sous
forme de tableaux:
La criticité en termes de sécurité et d’efficacité du produit est
proposée.
Les méthodes analytiques les plus couramment utilisées
Les limites généralement acceptées
Une stratégie de contrôle est décrite
L= test à libération
S = test en suivi de stabilité
C =test de caractérisation

Impuretés (ICH 11-ICH Q6B)
Les impuretés représentent une classe
importante d’AQCs potentiels à cause de leur
impact éventuel sur la sécurité
Les impuretés peuvent être:
Liées au procédé de fabrication
Protéines de la Cellule Hôte (HCP), ADN, constituant milieux de
culture, protéine A résiduelle,…
Liées au produit:
variants moléculaires formés durant la fabrication ou le stockage
et n’ayant pas des propriétés comparables à celle du produit
recherché en terme d’activité, efficacité et sécurité

Approche suivie
Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/
Efficacité
Limites généralement acceptées
ou réglementées
Méthodes
Utilisation du
test
ELISA (kit
commercial)
L (Ph1-2)
ELISA (Kit
spécifique)
L (Ph3)
SDS-PAGE Investigation
Electrophorèse
2D
Investigation
Western blot Investigation
HCP Fort Sécurité Mab <100 ng/mg[i]

Evolution au cours du développement du
produit
L’établissement des spécifications est un processus
évolutif:
Qui prend en compte l’amélioration de la connaissance de la
substance active, du procédé et la relation liant les attributs
qualité à la sécurité et l’efficacité du produit.
Pour la phase 1, les spécifications sont:
établies dans l’objectif essentiel de la sécurité du patient à
partir d’une connaissance limitée.
Pour les phases de développement ultérieures
les spécifications permettront d’assurer la reproductibilité
des lots en rapport avec l’efficacité clinique validée

Evolution au cours du développement du
produit
Changements du procédé de fabrication sont
inévitables
Echelle de production, amélioration du rendement,
de la qualité,…
Les études de comparabilité sont alors
requises (ICH Q5E) pour vérifier l’impact de la
modification sur la qualité du produit (attributs
qualité).
Comparaison analytique du produit avant et après
changement avec les tests de libération/stabilité
complétés par des tests de caractérisation
www.sfstp.org
15

Stratégie de contrôle prise en compte lors
études de comparabilité analytique
Spécifications
Substance active
(tests à libération
+/_stabilité)
Tests de
caractérisation
Substance active
Contrôle du
procédé
(contrôles en cours
fabrication,..)
Reproductibilité
Comparabilité

VARIANTS DE MASSE

2
VARIANTS DE
MASSE
Catégorie
Attribut
qualité
Impact Limites acceptables
Méthodes
d’analyse
Utilisat°
du test
Aggrégats
solubles
(oligomères ou
assemblages
hétérogènes)
Fort Sécurité 5% d’aire
(pratique courante)
SEC UV L / S
SEC MALS
A4F MALS
Ultra-
centrifugation
analytique
DLS
C
Variants de masse
Remarques : Le SDS-PAGE sera plutôt utilisée pour l’évaluation de l’intégrité de la molécule.
Les critères sur les particules visibles et sub visibles sont principalement fixés au niveau du produit fini

Méthodes à utiliser dépendent de la taille des
aggrégats
Particle counter
nm
Size Exclusion Chromatography
mm
µm
Soluble Insoluble
10-mer
Release methods
Irreversible / reversible / covalent aggregates
IgG
~5 nm
Dimer
Sub-visible
particles
Visible particles
Particle counter
nm
Size Exclusion Chromatography
mm
µm
Soluble Insoluble
10-mer
Release methods
Irreversible / reversible / covalent aggregates
IgG
~5 nm
Dimer
Sub-visible
particles
Visible particles
DLS (Dynamic Light Scattering)
FCM (Flow Cell Microscopy)
A4F (Asymmetrical flow field flow fractionation)
SV-AUC Velocity sedimentation
Méthodes
orthogonales
pour
caractérisation

4
Separation basée sur la taille des molécules
Temps d’élution (min)
Detection (UV 280nm)
Principe de la chromatographie d’exclusion

5
-1,0
52,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
24,0
28,0
32,0
36,0
40,0
44,0
48,0
UltraVioletResponse(mV)
0,000
8,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
LogMolecularWeight
5,10 12,30
Retention Volume (mL)
5,4 5,7 6,0 6,3 6,6 6,9 7,2 7,5 7,8 8,1 8,4 8,7 9,0 9,3 9,6 9,9 10,2 10,5 10,8 11,1 11,4 11,7
Data File: _33_T0_6mois_010_01.vdt Method: cali BSA UV 18.09-0001.vcm
Aggrégats
Monomère
Produits de
fragmentation
UV 280nm
Méthode de routine pour la quantification des variants de masse
Chromatographie d’exclusion avec détection
UV

6
1) Mesure de la Masse Moléculaire
2) L’intensité de la lumière diffusée est liée à
taille de la molecule : détection de trace
d’aggrégats
Mesure de la concentration
UV/RI
Laser
Détecteur 1
Détecteur 2 Détecteur 3
I(θ)diffusée∝ MW C (dn/dc)2
Couplage chromatographie d’exclusion avec des
détecteurs UV et à diffusion de lumière

7
-1,0
40,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
18,0
21,0
24,0
27,0
30,0
33,0
36,0
RightAngleLightScatteringResponse(mV)
0,000
8,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
LogMolecularWeight
5,10 12,30
Retention Volume (mL)
5,4 5,7 6,0 6,3 6,6 6,9 7,2 7,5 7,8 8,1 8,4 8,7 9,0 9,3 9,6 9,9 10,2 10,5 10,8 11,1 11,4 11,7
Data File: _33_T0_6mois_010_01.vdt Method: cali BSA UV 18.09-0001.vcm
150kDa
300kDa900kDa
Dimère
Monomère
Aggrégats de
Masse élevée
― UV (280nm)
― LS
Couplage chromatographie d’exclusion avec des
détecteurs UV et à diffusion de lumière

8
Sortie
Solvant
Port
d’injection
Entrée
Solvant
Fritté
Membrane cellulosique avec cuttof 10KDa
A4F: Séparation dans un canal sans
phase stationnaire
Elution selon la taille, mais dans
l’ordre inverse à la SEC
Asymetric Flow Field Flow Fractionation:
principe

9
Etape 1: Injection
Entrée
Sortie
Injection
principe

10
Etape 2: Relaxation
Membrane UF
Injection
Entrée
Sortie
principe

11
Membrane UF
Etape 3: Elution
Injection
Entrée Sortie
principe

exemple
Dimer
Monomère
~ 400kDa
200kD
― UV
--- LS
A4F avec détection UV et diffusion de lumière

13
Coefficient de sédimentation
C(s) via logiciel SEDFIT
ABS acquisition in function of radius
C(s) distribution
Monomer
Oligomers
Fragment
produts
Vitesse de
sédimentation est
fonction de la masse
et de la forme des
molécules
Cellule
Sv-AUC: principe de l’ultracentrigugation
analytique

Analyse du même lot d’anticorps par 3 techniques:
1. SEC-LS
L’aggrégat majoritaire est un dimère (300kDa)
Dimère
Monomère
~Trimère
— UV
LS
— MW distribution

2. A4F-LS
Dimère
Monomère
Aggrégats> dimère
— UV
LS
— MW distribution

3. SV-AUC
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
C(s)
S
Dimère
Monomère
Aggrégats> dimère
X 30

96.5%
3.5% (3.2% dimère)
ND
A4F
95.9%
3.4% (3.2% dimère)
0.8%
SEC
Monomère
Aggrégats
LMW
96.5% (+/- 1.3%)
3.5% (3% +/- 0.7 dimère]
ND
SV-AUC
(moyenne de 4 mesures)
96.5%
3.5% (3.2% dimère)
ND
A4F
95.9%
3.4% (3.2% dimère)
0.8%
SEC
Monomère
Aggrégats
LMW
96.5% (+/- 1.3%)
3.5% (3% +/- 0.7 dimère]
ND
SV-AUC
(moyenne de 4 mesures)
Bonne corrélation entre les 3 techniques pour la détection et la
quantification des aggrégats
quantification

Diffusion dynamique de la lumière (DLS)
L'intensité diffusée par des grosses particules (moins mobiles) varie moins
vite au cours du temps que pour des petites particules (mouvements browniens)
La fonction d'autocorrélation permet de comparer le signal mesuré à lui-même,
mais avec un petit décalage temporel. Le coefficient de diffusion des particules
permet d’accéder au rayon hydrodynamique et à un indice de polydispersité

DLS: comparaison de l’état d’aggrégation de
différents lots

Comparaison des méthodes
Chromatographie
d’exclusion
A4F AUC (SV) DLS
Sensibilité de
détection des
aggrégats
Modéré modéré modéré Elevé
Résolution Modéré à fort Modéré à fort Modéré à fort Faible
Gamme de taille
d’aggrégats
Faible Modéré Modéré Elevé
Débit d’échantillons Elevé Faible à modéré Faible Elevé
Quantification Elevé Elevé Elevé Faible
Difficulté technique Facile Expertise
technique requise
Expertise
technique requise
(y compris
traiterment des
données)
Facile
Développement de
méthode nécessaire
Faible à modéré Modéré Faible Faible
Remarques Interférence possible
de la phase stationnaire
avec les aggrégats
Méthode sans
colonne
Méthode sans
colonne

VARIANTS DE MASSE

Les fragments
Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité /
Efficacité
Limites acceptables Méthodes
Utilisation
du test
Variants de masses [A1]
Fragments Moyen Efficacité
Ph1-2 : Profil des
fragments et des
valeurs quantitatives
sont générées. A ce
stade, vu le recul
limité (faible nombre
de lots) des critères
d’acceptation ne sont
généralement pas
requis pour les
fragments individuels.
Ph3 : Identification
des fragments.
Spécification pour les
fragments majeurs
(critères quantitatifs
d’acceptation)
Une ( ou plusieurs
méthodes) à
sélectionner parmi
les suivantes :
-SDS-PAGE
-CGE
-SEC UV
L et S
Spectrométrie de
masse
A4F
C

La fragmentation est une dégradation
omniprésente dans les protéines
Processus enzymatique ou spontané
Observé malgré la grande stabilité de la liaison peptidique.
Sites de clivages sont fonction de multiples facteurs
L’enchaînement des acides aminés
Les structures IIaire, IIIaire et IVaire modifiant la flexibilité
l’accessibilité au solvant ou rapprochant des chaînes latérales
d’acides aminés éloignées sur la séquence
Différents mécanismes décrits :
Hydrolyse enzymatique ou chimique, -élimination
Catalyse par des métaux ou des radicaux
Fonction du pH

La fragmentation des anticorps monoclonaux est
fréquemment observée
Clivages des anticorps monoclonaux localisés surtout :
Régions constantes
Région charnière
Région peu structurée et flexible  accessible aux solvants
Modifié d’après Cohen S. L. et al, JACS 2007
+
IgG1 Fc-Fab Fab

Différents mécanismes de fragmentation décrits
Fragmentation de la région charnière d’après Vlasak J. et al mAbs 2011)
Facteurs déterminants dans le mécanisme :
pH
Chaîne latérale des acides aminés
Métaux ou radicaux

Les méthodes de suivi de la fragmentation
SEC-UV : exemple

Asymetric Flow Field Flow Fractionation
Exemple IgG1
molar mass vs. time
B200849_021[B200831-SS-120605-001]
time (min)
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
molarmass(g/mol)
5
1.0x10
Fragment 2
Fragment 1
Agrégat

Les méthodes électrophorétiques : SDS-PAGE
Exemples IgG1
SDS-PAGE en condition réduite sur mAb stressé
Analyse par SDS-PAGE non réduite du pic SEC Fab
Vlasak J et al,mAbs 2011
Cohen S. et al JACS 2007

Electrophorèse capillaire en gel CE-SDS
Principe :
Le gel de séparation utilisé en électrophorèse
SDS-PAGE est remplacé par un capillaire rempli.
Les protéines sont séparées selon leur taille, analysées
intactes ou après réduction

Electrophorèse capillaire en gel CE-SDS
Exemple :
Clivage de la région charnière d’un IgG
D’après Rustandi R. et al, Electrophoresis 2011
37°C, 28J

Comparaison des techniques
Exemple IgG1
4 semaines à 40°C
SEC
CGE
En condition dénaturante la présence de
SDS détruit les interactions non
covalentes de fragments ne provenant
pas du clivage de la région charnière

Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1Copyright SFSTP 2011
Les impuretés liées au procédé de fabrication

Les protéines de l’hôte
Impuretés
Attribut
qualité
Sécurité/Efficacité
Limites généralement
acceptées ou
réglementées
Méthodes
Utilisation du
test
HCP Fort Sécurité Mab <100 ng/mg
ELISA (kit commercial) L (Ph1-2)
ELISA (Kit spécifique) L (Ph3)
Electrophorèse 2D Investigation
ADN de l’hôte
Moyen Sécurité
< 10 ng/dose (WHO
Taille < 200 paires de
bases
Q-PCR
L (1 des 2
méthodes )Threshold® ou
équivalent.
Picogreen® ou
équivalent
Investigation
Remarque : Picogreen , faible sensibilité (5ng/ml), plutôt en screening ou en contrôle procédé.
Endotoxine Fort Sécurité
5 UI/kg masse corporelle
pour la dose maximale
administrée en 1 heure .(P
h Eur.)
LAL Ph EUR. L, S
Contamination
microbienne
Fort Sécurité
Contamination
microbienne* ou
stérilité
L, S
Remarque : * dans le cas où la stérilité du lot de principe actif vrac n’est pas revendiquée
•:

Les protéines de l’hôte : HCP’s
HCP « Host cell protein » : Protéines codées et produites par
l’organisme hôte (cellule , bactérie,..) sans rapport avec le produit
recombinant voulu.
Composition est fortement dépendante du système d’expression
– E. coli 4300 gènes
– NS0 30000 gènes
Lors du procédé de purification du produit, les protéines de la
cellule hôte peuvent être co-purifiées.
En raison de leur potentielle immunogénicité, les HCP’s doivent
être analytiquement évaluées pour assurer :
Sécurité du patient
Constance du produit

HCP. Les méthodes d’évaluation
Immuno essais :
Utilisation de kit de détermination
Anticorps polyclonaux
– générés contre un lysat de la cellule hôte sans le gène nécessaire à l’expression du
produit recombinant voulu
– Purifiés par affinité contre le même lysat
Q6B
For host cell proteins, a sensitive assay e.g., immunoassay, capable of detecting a wide range of
protein impurities is generally utilised. In the case of an immunoassay, a polyclonal antibody used in
the test is generated by immunisation with a preparation of a production cell minus the product-
coding gene, fusion partners, or other appropriate cell lines.

ELISA
Fixation Ac Iaire polyclonaux
Fixation HCP (échantillon)
Fixation Ac Iaire conjugués
Principe de l’essai :
Réaction enzymatique
S P

Les Kits de détermination
Kits génériques commerciaux :
Mammifères : CHO, NS/0, PER.C6, HEK 293, MRC5
Bactériens et levures : E.coli, Pichia, S.cerevesiae
Différents fournisseurs : Cygnus, Lonza, Charles River
Kits spécifiques :
Spécifique d’un produit
Multi-produits
Plate-forme de production
Avantages/Inconvénient
Kit commerciaux
pas de développement
moins spécifiques
Kits spécifiques
Bonne spécificité
12 à 18 mois de développement
Wang X. Biotech. Bioeng. 2009

ADN RESIDUEL DE L’HOTE

Impuretés
Attribut
qualité
acceptées ou
réglementées
Méthodes
Utilisation du
test
ADN de l’hôte
Moyen Sécurité
< 10 ng/dose (WHO
bases
Q-PCR
L (1 des 2
équivalent.
Picogreen® ou
équivalent
Investigation
h Eur.)
LAL Ph EUR. L, S
Contamination
microbienne
Fort Sécurité
Contamination
microbienne* ou
stérilité
L, S
•Impuretés liées au procédé de fabrication :

DNA Threshold:
1) Réaction: Incubation de l’ADN dénaturé
(simple brin) avec les réactifs: mAb anti-ADN
/urease, Biotin-SSB (prot. E. coli), Streptavidine
2) Séparation: Transfert sur unités de filtration
(membrane biotinylée).
3) Détection: Insertion de la membrane dans le
système Threshold (contenant le substrat
“urée”). L’hydrolyse de l’urée entraine un
changement de pH qui est détecté par un sensor
potentiométrique (µV/sec).

DNA Threshold:
Quantification générique d’ADN simple brin.
Haute sensibilité (2 pg).
Validable.
Largement accepté par les autorités.

PCR quantitative
 Principe: Amplification spécifique d’ADN et détection en temps réel du produit
amplifié par suivi de l’émission de fluorescence. Permet de réaliser la
quantification et la mesure de la taille de l’ADN résiduel.
 La détection d’une séquence génomique répétée permet d’améliorer la
sensibilité jusqu’à 10fg / test.
 Ex: 4 tailles ciblées (allant de 100 à 450 pb):
Représentation schématique des amorces et de la localisation de la sonde:

Ex. Elimination de l’ADN en cours de purification
En cours de purification l’ADN de grande taille est éliminé le plus rapidement
que les acides nucléiques de petite taille (100bp).
Dans cet exemple la quantité d’ADN résiduel de 300pb est de 2,5 pg/ml et
les fragments ≥ 450 pb ne sont plus détectables.
µg

ANALYSE DES ENDOTOXINES
ENDOTOXINESTEST DE
STERILITE RESIDUEL DE
L’HOTE

Les endotoxines bactériennes
Impuretés
Attribut
qualité
acceptées ou
réglementées
Méthodes
Utilisation du
test
ADN de l’hôte
Moyen Sécurité
< 10 ng/dose (WHO
bases
Q-PCR
L* (1 des 2
équivalent.
Picogreen® ou
équivalent
Investigation
h Eur.)
LAL Ph EUR. L, S
Contamination
microbienne
Fort Sécurité
Contamination
microbienne* ou
stérilité
L, S

Les endotoxines sont des lipopolysaccharides faisant partie de la paroi
des bactéries Gram négatives.
L’être humain est sensible à des quantités très faibles d’endotoxines
(fièvre, inflammation, choc septique…).
Pendant plus de 40 ans, le test pyrogène sur lapin = principal test de
détection des endotoxines.
Les endotoxines

Le test Lapin et son successeur
En 1950, découverte de l’aptitude des cellules sanguines de la limule à
coaguler en présence d’endotoxines  test LAL.
Test LAL (« Limulus amebocyte lysate »):
Test in-vitro d’analyse quantitative des endotoxines.
Commercialement introduit en 1970.
Accepté par la FDA depuis 1983 comme test standard.
Avantages:
Diminution de l’utilisation des animaux.
Test plus fiable, plus facile et plus rapide.
Test plus sensible (sensibilité de 0,05 EU/ml à 0,06 EU/ml pour les tests
LAL contre une détection de 1 à 10 EU/ml pour le test lapin).
Le test LAL

 Méthode de Gel clot:
Les différents types de tests LAL
Cascade enzymatique en présence
d’endotoxine résulte en la formation d’un gel
 Méthode chromogénique/turbidimétrique
Cascade enzymatique en présence
d’endotoxine résulte en la formation d’un
composé coloré détecté par densité
optique/turbidité.

CONTAMINATION MICROBIENNE

Impuretés
Attribut
qualité
acceptées ou
réglementées
Méthodes
Utilisation du
test
ADN de l’hôte
Moyen Sécurité
< 10 ng/dose (WHO
bases
Q-PCR
L* (1 des 2
équivalent.
Picogreen® ou
équivalent
Investigation
h Eur.)
LAL Ph EUR. L, S
Contamination
microbienne
Fort Sécurité
Contamination
microbienne* ou
stérilité
L, S

Contamination microbienne
Essai de dénombrement microbien
Essai de dénombrement microbien selon Ph.Eur 2.6.12 et USP <61>
Dénombrement des germes viables totaux par filtration sur
membranes de 10mL d’échantillon et rinçage avec 3 fois 100mL de
tampon pH7
Dénombrement des Germes Aérobies viables Totaux (DGAT) sur
gélose aux peptones de caséine et de soja avec incubation à 30°C-
35°C pendant 3 à 5 jours
Dénombrement de Moisissures et Levures Totales (DMLT) sur gélose
Sabouraud avec incubation à 20°C-25°C pendant 5 à 7 jours
Spécifications :
– DGAT ≤ 1 UFC / 10 mL
– DMLT ≤ 1 UFC / 10 mL

Test de sterilité
Le principe de la méthode est de mettre en contact l’échantillon à tester avec
des milieux de culture, d’incuber (14 jours) et de vérifier ensuite l’absence de
croissance d’un germe contaminant.
Plusieurs techniques sont disponibles (inoculation directe dans le milieu de
culture liquide, filtration sur membrane….).
Milieux:
FTM (fluid thioglycollate medium) supporte la croissance de germes aérobes et
anaérobes.
SCDM (soybean casein digest medium) supporte la croissance d’une grande variété
de bactéries aérobes/champignons (incluant levures et moisissures).
L’environnement doit être particulièrement contrôlé (zone aseptique ou travail
sous isolateur).

 Comment réalise-t-on le test ?
L’échantillon est inoculé dans des milieux nutritifs
spécifiques aux microorganismes recherchés.
Les milieux sont incubés 14 jours aux températures
optimales pour la croissance de germes et observés
régulièrement en face d’un écran lumineux.
L’apparition d’un trouble dans le milieu révèle la
présence de microorganismes.
Test de stérilité

ANTIBIOTIQUE RESIDUEL

Antibiotique résiduel
Impuretés Attribut qualité Sécurité/Efficacité
acceptées ou
réglementées
Méthodes Utilisation du test
Antibiotique
Fort Sécurité
Limite de quantification de
l’ordre du ng/mg .
Prévoir une justification lors
d’un éventuel résultat >
LOQ .
Chromatographie liquide
C
avec pour objectif
de démontrer
l’élimination pendant
le procédé de
purificationELISA
Tendance à éliminer ce type de molécules dans les procédés. Antibiotique à base de b-lactame interdit.
Antimousse (PPG,
PEG, Silicone, ..)
Moyen à Faible Sécurité
Non régulé, le dosage
démontre la maitrise du
procédé. Prévoir une
justification lors d’éventuel
résultat > LOQ.
Chromatographie liquide
C
avec pour objectif
de démontrer
l’élimination pendant
le procédé de
purification
ICP (Silcone)

Ex. Dosage d’un antibiotique résiduel par U-HPLC /UV
Developpement d’une méthode de chromatographie
liquide pour l’analyse d’antibiotiques
aminoglycoside.
Une dérivatisation est effectuée avec le
phenylisocyanate.
Détection à 240 nm.
Equipement
 U-HPLC
 PDA detecteur
 Colonne C18
Chromatogram: Kanamycin standard 5µg/ml
Chromatogram: Residual kanamycin in tested lot
Kanamycin
Kanamycin

ANTIMOUSSE (ex. silicone)

Technologie & principe de l’ICP-AES
Détermination de la concentration en Silicium (marqueur d’antimousse à base de silicone).
Méthode ICP-AES/OES:
•Inductively Coupled Plasma - Atomic/Optical Emission Spectrometry"
•Méthode d'analyse par spectrométrie d'émission atomique dont la source est un plasma
généré par couplage inductif.

Technologie & principe de l’ICP-AES
• Système d’introduction de l’échantillon constitué d’une pompe
péristaltique (1), d’un nébuliseur (2) et d’une chambre de
nébulisation (3)
• Système d’atomisation et d’excitation comprenant la torche (4), le
générateur de courant alternatif couplé à la bobine d’induction (5)
• Système optique (6) (système dispersif)
• Système de détection (7)
6
1
2
3
4
5
7
Permet un dosage rapide de la pluparts des éléments chimiques.
Energie  atomes → ions, ions excités, relaxation avec émission d’un photon dont l'énergie
(donc la longueur d'onde) est caractéristique de l'élément.
Ex: détermination de la concentration en Silicium (marqueur des antimousses à base de
silicone).
•Mesures réalisées à 4  d’émission différentes 251.611, 212.412, 288.158 & 252.851 nm.
•Range de la droite de calibration: 0.05 à 1µg/ml
•Prétraitement (minéralisation): fonction de la matrice de l’échantillon.
Schéma d'un spectromètre ICP-AES

Protéine A
Impuretés
Attribut
qualité
acceptées ou
réglementées
Méthodes Utilisation du test
Inducteurs (IPTG,…)
Agent de sélection
(Methotrexate)
ou tout autre
composé CMR utilisé
dans le procédé
Moyen Sécurité
résultat > LOQ.
Chromatographie
liquide
C
avec pour objectif
de démontrer
l’élimination
pendant le procédé
de purification
Constituant bioactif
des milieux de
cultures
(Insuline, facteur de
croissance,…)
Moyen Sécurité
résultat > LOQ.
Chromatographie
liquide
C
avec pour objectif
de démontrer
l’élimination
pendant le procédé
de purification
ELISA
Protéine A Moyen Sécurité
démontre la maîtrise du
procédé
(exemple de spécification :
< 20 ppm)
ELISA
L
Chromatographie
liquide (LC/MS par
exemple)

VARIANTS DE
CHARGE
Variants influençant la charge nette de la protéine, liés à des modifications
survenant lors de la production et/ou de la conservation
Origine
Attribut
qualité
Méthodes
d’analyse
Utilisat°
du test
Variants
Lys-term
Déamidations
Acides sialiques
Pyro-Glu
Variants de
séquence
primaire (formes
élonguées,
tronquées, mal
processées)
Fct
localisation
(fort si
CDRs)
Efficacité
Variants regroupés
par formes majeures
(formes acides / basiques
vs pic principal)
Identification :
vs subst.réf.
Pureté :
Ph1-2 : Valeurs
quantitatives générées.
Critères acceptation pas
obligatoires (recul limité)
Ph3 : Critères acceptation
quantitatifs (absolus
ou vs subst.réf.)
IEF / c-IEF /
i-CE
IEX
L / S
Spectrométrie
de masse
Peptide
mapping
(LC/UV/MS)
Dosage
acides
sialiques
C
Variants de charge

CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS
Interactions ioniques entre un support solide et les
molécules à analyser.
Echange de cations ou d’anions.
pH de la phase mobile entre le pI de la protéine
et le pKa des groupements
fonctionnels chargés de la
phase stationnaire.
Variants de charge

CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS
Séparation en fonction de la charge nette de
surface de la protéine.
Gradient salin (ex.:NaCl pour WCX) pour l’élution.
En chromatographie échangeuse de cations, les
protéines ayant la charge nette positive la plus
faible éluent en premier.
Variants de charge

Exemple pratique - WCX d’un mAb
Buts :
– Comparaison de lot à lot
– Etude de stabilité (dégradation du mAb par
déamidation : Asn → Asp ; Gln → Glu ).
Informations :
– Détermination de l’hétérogénéité de charges
– Détermination des proportions relatives des
isoformes (% aire)
Variants de charge

Acquired By: EDERE
21/03/2009 23:07:11
WCX_complément
23/03/2009 9:11:53
hétérogénéité de charges
3821
3822
2487Channel 1
Sample Name: A805564 répétabilité inj.
Sample Type: Unknown Date Acquired:
Vial: 7 Acq. Method Set:
Injection #: 1 Date Processed:
Processing Method:Injection Volume: 20.00 ul
Proc. Method Id :Run Time: 75.0 Minutes
Sample Set Name: A900626 validation XD_200309 Calibration Id :
Channel Name :HPLC 24System Name :
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00
acid1
acid2
acid3
acid4
isoformemaj.
basic1
basic2
basic3
basic4
-0.002
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
acid1
acid2
acid3
acid4
isoformemaj.
basic1
basic2
basic3
basic4
Result Id 3843
Isoformes acides Isoformes basiques
+ Lys
+ 2 Lys
Exemple pratique - WCX d’un mAb
Sensibilité : LOQ ~ 0.1 %
Variants de charge

IEF (IsoElectric Focusing) SUR GEL
Séparation dans un gel intégrant un gradient de
pH immobilisé
Les protéines migrent sous l’effet d’un champ
électrique jusqu’à atteindre le pH correspondant à
leur pI
Variants de charge

Exemple pratique - IEF d’un mAb
pI
3
10
Variants de charge

ELECTROPHORESE CAPILLAIRE - c-IEF
Séparation dans un capillaire / Gradient de pH
Les protéines migrent sous
l’effet d’un champ électrique
jusqu’à atteindre le pH
correspondant à leur pI
Mobilisation après
focalisation, puis
détection UV
Variants de charge

Exemple pratique : c-IEF d’un mAb
Minutes
27 28 29 30 31 32
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0.00
0.02
0.04
B1
B2
B3
B4
Majorpeak
A1
A2A3
A4
A5
A6
A7
c-IEF
IEF
Sensibilité : LOQ ~ 1 %
Variants de charge

Exemple pratique : c-IEF de 3 mAb
Variants de charge

www.sfstp.org
12
Comparaison WCX vs c-IEF
WCX
c-IEF
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
Minutes
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00Acid1-12.029
Acid2-13.972
Acid3-14.956Acid4-15.288
IsoformMaj-1
Basic1-17.516
Basic2-19.473
Basic3-24.456
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
Minutes
8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
Acid1-12.029
Acid2-13.972
Acid3-14.956
Acid4-15.288
IsoformMaj-16.582
Basic1-17.516
Basic2-19.473
Basic3-24.456
SampleWeight : 1.0000 Dilution : 1.0000
P E A K RE S UL TS
1
2
3
4
5
6
Name RT Area Height Int Type % Area
Acid 1
Acid2
Acid3
Acid4
IsoformMaj
Basic 1
12.029
13.972
14.956
15.288
16.582
17.516
317745
1926019
1768277
1336803
18095102
2336231
5511
28900
56532
54154
495304
69824
bv
vv
vv
vv
vv
vv
1.19
7.24
6.65
5.03
68.02
8.78
7
8
Name RT Area Height Int Type % Area
Basic 2
Basic 3
19.473
24.456
744789
76197
13971
879
vv
vb
2.80
0.29
WCX (2 mg/mL) cIEF (0.2 mg/mL)
Nom du pic % aire Nom du pic % aire
Acid1 1.1
20
B1 1.7
10
Acid2 7.2 B2 6.0
Acid3 6.8 B3 1.5
Acid4 5.0 B4 1.0
Pic majoritaire 68.1 68 Pic majoritaire 54.7
65
Basic1 8.8
12
A1 10.0
Basic2 2.8 A2 2.8
25
Basic3 0.3 A3 1.8
A4 14.5
A5 4.9
A6 0.6
A7 0.6
Minutes
27 28 29 30 31 32
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0.00
0.02
0.04
B1
B2
B3
B4
Majorpeak
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
Variants de charge

www.sfstp.org
13
Comparaison IEF vs c-IEF
IEF
c-IEF
Minutes
27 28 29 30 31 32
AU
0.00
0.02
0.04
AU
0.00
0.02
0.04
B1
B2
B3
B4
Majorpeak
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
IEF classique (5 µg/puits) cIEF (0,2 mg/mL)
Nom du pic % aire Nom du pic % aire
1 1.2
8
B1 1.7
10
2 6.4 B2 6.0
Pic majoritaire 64.2 64 B3 1.5
4 22.9
28
B4 1.0
5 5.2 Pic majoritaire 54.7
65
A1 10.0
A2 2.8
25
A3 1.8
A4 14.5
A5 4.9
A6 0.6
A7 0.6
Variants de charge

« Imaging » c-IEF
Même principe de base que la c-IEF
Pas de mobilisation car suivi de la
focalisation sur le capillaire entier
(caméra UV)
Variants de charge

Exemple pratique : ic-IEF d’un mAb
pI 5.12
pI 7.90
ic-IEF
IEF
Sensibilité : LOQ ~ 1 %
Variants de charge

PEPTIDE MAPPING ET
SPECTROMETRIE DE MASSE
UPLC/UV, UPLC-UV-MS/MS,
MALDI-TOF, …
Protease
N-term
C-term
C-term
N-term
Dénaturation, réduction,
alkylation
Variants de charge

Exemple pratique - Cartographie peptidique
d’un mAb vs substance de référence
UPLC/UV ou MS
Variants de charge

du Trastuzumab - Séquences N et C-term.
Variants de charge

du Trastuzumab - Séquence C-terminale
Séquençage du peptide C-terminal de HC :
forme minoritaire (~ 5 %) avec Lys
Variants de charge

du Trastuzumab - Séquence N-terminale
Séquençage du peptide N-terminal de HC :
forme majoritaire (> 95 %) sous forme Glu
Variants de charge

DOSAGE D’ACIDES SIALIQUES
Peuvent induire de fortes variations de la charge
nette de la protéine (formes « acides » en IEX
ou (c)-IEF).
Analyse souvent réalisée en complément /
confirmation de la caractérisation de la
glycosylation.
Variants de charge

Exemple pratique - Dosage d’acides sialiques
Hydrolyse acide douce, puis dérivatisation DMB
et analyse UPLC/Fluo
Standards Trastuzumab
Variants de charge

VARIANTS DE CHARGE - DISCUSSION
Résultats analytiques « comparables » et
complémentaires pour IEX, IEF et (i)c-IEF.
Au moins une de ces techniques doit être utilisée
en routine pour l’étude des variants de charge.
Puissance analytique et polyvalence de la
spectrométrie de masse et de la cartographie
peptidique pour tests de caractérisation (variants
Lys-term, Pyro-Glu, déamidations, variants de
séquence primaire mais aussi glycosylation,
oxydation …)
Variants de charge

Variants conformationnels et autres variants

Autres variants
Origine
Attribut
qualité
Méthodes
d’analyse
Utilisat°
du test
Thiols libres.
Mésappariement
des ponts
disulfures.
Asp/isoAsp.
Oxydation.
Fort
si impact
potentiel sur
l’activité,
comme par
exemple sur
les CDRs
Efficacité
Ph1-2 : Quantification de la
teneur en thiols libres.
Vérification des
appariements corrects des
ponts disulfure.
Mise en évidence des sites
d’oxydation
Ph3 : En cas d’évolution
observée l’impact doit être
documenté
Spectrofluo-
rescence ou
Ellman (Thiols
libres / totaux)
Cartographie
peptidique
C

Autres variants
Mésappariement des ponts disulfures

Autres variants
Mésappariement des ponts disulfures
Changement de structure détectable par:
– Test d’activité,
– Test de structure secondaire ou tertiaire p.ex. CD,
FTIR, RMN…,
Identification du mésappariement par:
– Peptide mapping et séquençage MS/MS.

Autres variants
Thiols libres
Détermination par UV-visible après réaction au
DTNB (méthode Ellman).
– Problème de sensibilité de détection avec les
Anticorps
Détermination par fluorescence après réaction
au NPM.
– 0.05 mol de thiols libres / mol d’Anticorps à 10mg/mL
– 0.01 mol de thiols libres / mol d’Anticorps à 10mg/mL
(en conditions non dénaturantes)

Autres variants
Asp / isoAsp
Changement de l’efficacité de la liaison de
l’anticorps détectable par:
– Test d’affinité
Mise en évidence de la modification par:
– HIC, IEX, test enzymatique
Localisation de l’isoAsp par:
– Peptide mapping et fragmentation MS/MS

Autres variants
Oxydation
Oxydation principalement sur les Méthionines
et les Tryptophanes.
Ajout majoritairement de 16uma, parfois de
32uma en cas de double oxydation. Sur le
Tryptophane, possibilité d’un réarrangement
après oxydation résultant en un ajout de 4uma.
Mise en évidence de la modification par:
– Peptide mapping et séquençage MS/MS

Autres variants
ms
770 772 774 776 778 780 782 784 786
m/z0
100
%
ACRA30 25 (0.874) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (17:25) TOF MS ES+
652781.4
780.9
773.4
772.9
770.4
774.4 780.4775.4
777.4
779.4
781.9
782.4
783.8 784.5
784.9
786.4
ms
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z0
100
%
ACRA30 25 (0.874) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (17:25) TOF MS ES+
5.17e3288.5
429.2
359.2
445.3
503.2
542.4
734.4542.9 781.4
1106.5991.5
Exemple d’oxydation de la Méthionine détectée par MS
Spectre de masse Electrospray d’un peptide tryptique oxydé
Zoom

Autres variants
Exemple d’oxydation de la Méthionine détectée par MS
Spectre MS/MS
msms781
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z0
100
%
ACRA30R 1 (0.034) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (1:13) TOF MSMS 781.00ES+
39586.9
242.3
226.3
389.3
323.3
390.3
538.4
1173.5
1172.5587.4
850.4
587.9
786.4
660.4
1109.5
851.4
1011.5
1174.5
1175.5
1256.5 1320.5
msms781
790 800 810 820 830 840 850 860
m/z0
100
%
ACRA30R 1 (0.034) Sm (Mn, 2x2.00); Cm (1:13) TOF MSMS 781.00ES+
28850.4
786.4
787.4
832.4788.4
824.4817.2808.3
805.3
801.3 842.4837.3
845.4
851.4
852.4
853.4859.4
---Pro-Val-Thr-Thr-Met ---
---Pro-Val-Thr-Thr-Met[O]---
Fragmentation attendue
Fragmentation observée
834 436
850 452
- 64 mass units
786
- 64 mass units
Zoom

Autres variants
HC
H2C
H
S
O
CH3
Mécanisme proposé pour la perte de
64uma depuis la Méthionine oxydée

Variants
conformères
La probabilité d’observer un variant conformationnel pour un anticorps est très rare
Origine
Attribut
qualité
Impact
Limites
acceptables
Méthodes
d’analyse
Utilisat°
du test
N/A N/A N/A
Comparaison
par rapport à
un profil de
référence
Dichroisme
circulaire
FTIR
Spectrométrie
de masse avec
mobilité
ionique.
Fluorescence
intrinsèque ou
extrinséque.
C
Il n’existe pas de méthode
permettant de séparer et
quantifier précisément les variants
conformationnels d’un produit.
Une ou plusieurs des méthodes
proposées seront mises en œuvre
à titre de caractérisation globale
du produit

Autres variants
12
Exemple de spectres DC obtenus pour
5 échantillons différents
-10
-5
0
5
10
15
20
190 200 210 220 230 240 250 260
Wavelength (nm)
dEmol-1dm3cm-1
Sample A
Sample B
Sample C
Sample D
Sample E
Sample
% α-
Helix
% other
helix
% β-
sheet
%
Turns
%
‘Other’
A 70 13 0 6 12
B 70 11 0 9 14
C 68 12 0 8 13
D 67 12 0 8 13
E 68 12 0 8 13

Autres variants
13
Exemple de spectres FT-IR obtenus
pour 5 échantillons différents
1560 1600 1640 1680 1720
Wavenumber (cm
-1
)
Formulation A
Formulation A
Formulation B
Formulation B
Formulation C
Formulation C
Elements of Structural
Components
Sample α-Helix -Sheet
A 6.6 59.8
B 6.5 59.6
C 7.0 59.3
D 6.7 59.8
E 6.5 59.4
Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org

Variants conformationnels
et autres variants
CONCLUSION
Etude principalement faite en
caractérisation ou en investigation si OOS
ou OOT observé sur un autre test (activité,
binding, IEX, HIC …), mais pas en
libération.
Méthode de référence : cartographie
peptidique et spectrométrie de masse (MS
et MS/MS) - Polyvalence et performance
pour confirmation d’hypothèses.

Copyright SFSTP 2011 www.sfstp.org 1Copyright SFSTP 2011
VARIANTS DE GLYCOSYLATION

Glycosylation des IgGs
Introduction
Structures
Fonctions
Impact sur la PK et la sécurité
Exemple de méthodes d’analyses
Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
IgG, sucres libérés, cartes peptidiques/ glycopeptidiques
Chromatographie liquide en phase normale
Sucres libérés et dérivés, exo-glycosidases + spectrométrie de masse
Electrophorèse Capillaire
Conclusions
Glycoformes principales, potentiellement immunogéniques, glyco-ingénierie

Glycosylation des IgGs thérapeutiques
Les glycanes
Ne représentent que 2-3% de la masse
d’un anticorps
40% pour l’EPO
Jouent un rôle essentiel dans les
fonctions effectrices
Cytotoxicité liée à l’anticorps (ADCC)
Cytotoxicité liée au complément (CDC)
Localisés sur l’Asn297 des chaînes
lourdes (IgG humaines et murines)
Au niveau d’un site de N-glycosylation
consensus -Asn-X-Thr- (X different Pro)
Environ 15-20% des IgG plasmatiques
possèdent un second site de N-
Glycosylation dans le domaine variable
Cetuximab/ Erbitux (-Asn88-Asp-Thr-).

Glycosylation: structure de base
et formes majoritaires
Les N-glycoformes des domaines Fc sont composées d’un
heptasaccharide commun constitué de
2 N-acetylglucosamines (GlcNAc)
3 mannoses (Man) formant 2 bras et liés à
2 N-acetylglucosamines
Heptasaccharide généralement complété par un
1 Fucose-1,6 (Fuc) au niveau du premier GlcNac
0, 1 ou 2 unités de galactose (Gal)
formant 3 glycoformes (G0F, G1F et G2F)
3 glycoformes majoritaires (> 80%) sur les Fc
IgG produites en systèmes mammifères (CHO, NS0, SP2/0, HEK-293 ou PER.C6)

Glycosylation: formes xenobiotiques
(liées aux systèmes de production)
Les AcM produits en systèmes murins (NS0, SP2/0) possèdent des glycoformes
supplémentaires en faible quantité (< 5 %)
Gal-α-1,3-Gal
Acide N-Glycolyl NeurAminique (NGNA)
Peuvent êtres immunogéniques
Les AcM produits dans des systèmes autres que de mammifères (levures, plantes,
algues) auront des glycoformes non humaines
Immunogéniques
Limite leur usage thérapeutique

Optimisation de la glycosylation
(par selection ou ingénierie)
Formes a-fucosylées
Augmentation de l’affinité pour les FcgammaRIII
40 à 100 x plus d’ADCC
Nombreuses technologies (brevetées)
Formes hyper-galactosylées
Augmentation de la CDC
Formes hyper-sialylées
Augmentation des propriétés anti-inflammatoires

1) IgG intacte ou réduite
LC-ESI-TOF
150 kDa LC: 25 kDa HC: 50 kDa
&
2) N-Glycanes (digestion)
ESI-MS/MS
G0F, G1F & G2F : 1.5 to 1.8 kDa
3) Glycopeptides enrichis
EEQYN297STYR EEQYN297STYR EEQYN297STYR
HT23-G0F, HT23-G1F & HT23-G2F :
2.6 to 3.0 kDa
« TOP-DOWN »
« BOTTOM-UP»
Glycoformes: Analyses par
spectrométrie de masse

LC-ES-TOF: IgG intacte +/- PNGase F
(A) mAb-1 (NS0) (B) mAb-1 + PNGase F (- N-glycans)
mass
148500 149000 149500 150000
%
8
4.18e3149065.0
148905.0
148745.0
148580.0
149230.0
149390.0
149545.0
149695.0
149850.0

« Maxent »
de-glycosylated Ab
« Maxent »
Masse polypeptidique calculée IgG = 145 685 Da
(16 S-S, N-t. PyroGlu, - C-t. Lys)
Pic princip. Exp. Mass = 149 065 Da (+ 3 380 Da)
9 pics équidistants (162 Da => hexose)
Janin-Bussat MC, Beck A et al, 2010
Exp. Mass : 145 695 Da (+ 10 Da)
(1 pic principal/ Digestion PNGase F)
=> La N-glycosylation représente la
principale source d’hétérogénéité des
IgGs

LC-ESI-TOF bottom-up: interpretation
(A) Chaîne Lourde (B) IgG (NS0)
IgG
Glycoforms
Calc. Mass
(Da)
Exp. Mass
(Da)
Difference
(Da)
G0F/G0F 148576.4 148580.0 +3.6
G0F/G1F 148738.5 148745.0 +6.5
G0F/G2F, G1F/G1F 148900.7 148905.0 +5.7
G1F/G2F 149062.8 149065.0 +2.2
G2F/G2F 149224.9 149230.0 +3.1
Heavy
Chain
Calc. Mass
(Da)
Exp. Mass
(Da)
Difference
(Da)
G0F 50241.4 50240 -1.4
G1F 50403.5 50402 -1.5
G2F 50565.6 50563 -2.6
G2FaGal 50727.7 50726 -1.7
« Maxent »
G0F
G1F G2F
+ aGal
+ aGal
G0F/G0F
G0F/G1F
G1F/G2F
G2F/G2F
G1F/G1F
Or
G0F/G2F
+ 2 aGal
+ 3 aGal
+ 4 aGal

« Maxent »

NanoLC-MS/MS fragmentation
12 glycoformes détectées et fragmentées par MS/MS
E. Wagner-Rousset, A. Beck et al, J Chrom B, 2008
1204.02 1297.59
1318.09
1399.14
1480.17
1561.17
+MS, 15.9-19.0min #(557-663)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
7x10
Intens.
1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 m/z
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
1642.121379.08
EEQYN297STYR
or
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
or EEQYN297STYR
and
1204.02 1297.59
1318.09
1399.14
1480.17
1561.17
+MS, 15.9-19.0min #(557-663)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
7x10
Intens.
1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 m/z
EEQYN297STYR
EEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYREEQYN297STYR
1642.121379.08
or
or EEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYREEQYN297STYR
and
Hz IgG1
(NS0)

NanoLC-MS/MS fragmentation
MS/MS information sur la séquence en acide-aminé et empreinte
caractéristique d’oligosaccharides
Wagner-Rousset E., Beck A. et al, J Chrom B, 2008
Hz IgG1
(NS0)
366.16
528.26
690.36
961.04
1042.08
1189.73
1392.93
1538.86
1741.85 1919.89
2082.92
+MS2(1318.06), 16.6-17.8min #562-#605
0
2
4
6
5
x10
Intens.
500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 m/z
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
or
or
or
or
or
EEQYN297STYR
or
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
MH+
HT23-G0F
(A)
366.16
528.26
690.36
961.04
1042.08
1189.73
1392.93
1538.86
1741.85 1919.89
2082.92
+MS2(1318.06), 16.6-17.8min #562-#605
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Intens.
500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 m/z
EEQYN297STYR
EEQYN297STYR
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EEQYN297STYR
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or
or
or
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or
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MH+
HT23-G0F
366.16
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366.16
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690.36
961.04
1042.08
1189.73
1392.93
1538.86
1741.85 1919.89
2082.92
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0
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Intens.
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or
or
or
or
or
EEQYN297STYR
or
MH+
HT23-G0F
(A)
E-E-Q-Y-N-S-T-Y-R
y1y2y3y4y5y6y7y8
b8b7b6b5b4b3b2b1
Y1
Y3
C4B3
Y4 Z4
B1 C1
Y4a Z4a
B1a C1a
B4C3
Y2 Y1Z2 Z1
Z3
B2
C2
Y3a
Z3a
B2a
C2a
(C)
E-E-Q-Y-N-S-T-Y-R
y1y2y3y4y5y6y7y8
b8b7b6b5b4b3b2b1
Y1
Y3
C4B3
Y4 Z4
B1 C1
Y4a Z4a
B1a C1a
B4C3
Y2 Y1Z2 Z1
Z3
B2
C2
Y3a
Z3a
B2a
C2a
Y1
Y3
C4B3
Y4 Z4
B1 C1
Y4a Z4a
B1a C1a
B4C3
Y2 Y1Z2 Z1
Z3
B2
C2
Y3a
Z3a
B2a
C2a
(C)
HT23 peptide fragmentation
Biemann K, Annu Reb Biochem 1992
G0F glycan fragmentation
Domon B. et al., Glycoconjugate J, 1988

Chromatographie en phase normale
Digestion séquentielle
(exoglycosidases)
a) Neuraminidase
b) a-galactosidase
c) -galactosidase
d) -hexoaminidase
e) a-fucosidase
f) a-mannosidase
g) -mannosidase
Bussat M, Beck A
et al, Antibody
Engineering,
Springer 2010
Digestion: PNGase F (-Asn-/ -GlcNAc) ou IgGZERO
Dérivation: oligosaccharide fluorescents (2-amino benzamide)
(1) Phase Normale HPLC ou HILIC + détection fluorescence
(2) Isolation de pics + MALDI-TOF (off-line) ou (2D)-LC-MS (en ligne)
(3) Analyse biochimique : digestion sequentielle par exoglycosidases

2-AB oligosaccharides (NP-HPLC + MALDI-TOF)
Peak isolation and
MALDI-TOF analysis
Calculated Mass (Da)
Experimental Mass
GlcNac = 203.19 Da
Man, Gal = 162.14 Da
Fuc = 146.14 Da
NGNA = 291.09 Da
NANA = 275.00 Da
2AB = 136.15 Da
G0F
G1F
G1’F
G2F
Mono
a1,3-
GalGal
Di
a1,3-
GalGal
G1-GlcNac
1906.69
1906.71
1582.58
1582.63
1744.64
1744.51
2068.74
2068.94
2230.79
2230.90
1541.56
1541.62
G0-GlcNac
1379.50
1379.59
NGNA NGNA

CE-SDS: taux d’IgG non glycosylée
(A)
Information rapide, sensible et quantitative :
IgG H2L2 integral structure (150 kDa) and non-glycosylated H2L2 (- 3 kDa)
H2L (125), H2 (100), HL (75), H (50), L2 (50), L (25)
(B)

Trastuzumab + PNGase F: CE-LIF
Trastuzumab (Herceptin) glyco-profile (production en CHO)
4 N-glycoformes principales - Proche des IgGs humaines
G0F
G1F/G1’F
G2F

Trastuzumab + PNGase F: CE-LIF
Trastuzumab (Herceptin) glyco-profile (production en CHO)
G0: glycoforme importante pour augmenter l’ADCC
Man5: le plus faible possible (clearance plus rapide)
Man5 (CHO, NS0)G0

IgGs glycosylation: résumé
 Beck A & Reichert JM, mAbs 2012

CONCLUSION
Différentes catégories d’impuretés des P.A. d’origine biotechnologique :
Notion d’hétérogénéité des produits biologiques.
Impuretés liées au procédé de fabrication.
Impuretés liées au produit : Variants de masse.
Variants de charge.
Variants conformationnels.
Variants de glycosylation.
Evaluation globale de la criticité en termes de sécurité et d’efficacité.
Une ou plusieurs solutions analytiques et une stratégie de contrôle adaptée.
Publication : « Impuretés dans les substances actives d’origine biologique »
STP Pharma Pratiques, mai-juin 2014, 24(3), 203-220
1
09.12.2014

Contact us:
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2
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