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Inversão de fases

  1. 1. Inversão de fases,determinação por HPLCdo tamoxifeno noCÃOplasma e de seusFARMACOCINÉTICAApós a administração deuma única dose oralResumo:O método analíticodesenvolvido para avaliaro tamoxifenem amostras de plasmadecãoerapreciso, exacto, robusto e linear no intervalode5-200ng /mL.Os limites dedetecçãoe quantificação foram0,981ng /mLe 2,97ng /mL,respectivamente.Além disso,ointra-diavariaçõesde precisãoe acurácia foram8,78 e10,16%, respectivamente. Asconcentraçõesde tamoxifenoforam analisadas porcombinadoinvertidocromatografiaemfase líquidae detecçãoUV (λ = 280nm).O estudo foi conduzidoutilizandoumabertorandomizadocruzado2 períodosdesign equilibradocom umperíodo de intervalo deuma semanaentreasdoses.Estemétodo simples, rápidoe selectivoé adequadoparabiodisponibilidade,farmacocinética eestudos de bioequivalência.INTRODUÇÃOTamoxifené umagentenão esteróideque tem demonstradopotenteantiestrogénicopropriedadesemsistemas de testesanimais.Ocitrato detamoxifenoestá disponívelnaforma de comprimidosorais, sendo amplamente utilizado comoterapia endócrinapara ocâncer demama. A biodisponibilidadedos comprimidosde citrato detamoxifenotemsidoextensivamente estudadaem vários paísesao redor do mundo. O tamoxifenoéextensivamente metabolizadoapós administração oraladministraçãoeN-desmetiltamoxifenoé o principal metabolitoencontrada no plasma humano. O uso generalizado detamoxifenotem estimuladoesforços para desenvolver osensaiosde rotina paraa droga eos seus metabolitosno plasma humano.Procedimentos baseados emcromatografia gasosa comespectrometria de massasão altamente específicose envolvemequipamento nãogeralmente disponíveis.O métodode Lee etal.representauma evolução doFriede Wainer, com três diferenças importantes: a incorporação deum padrão internopara oensaio,a utilização de umaextracção líquido-líquido e um procedimentopara purificaradicionalmentee permitir quea concentraçãoda amostra,ea quantificação de4-hidroxi-N-desmetiltamoxifeno, umametabolitoquepodem teratividade anti câncer.Infelizmente,tempo de execuçãototal alcançadofoi de cerca de60 min.As preparações farmacêuticasde citrato de tamoxifenodisponíveisno Brasilbaseiam-se emdiferentes excipientese algunsfilmesde revestimento,o que pode nãorefletir abiodisponibilidadedescrito paraestescomprimidos.Voluntários humanossão normalmente utilizadosem testesdebiodisponibilidadepara a determinação dasconcentrações plasmáticasda medicaçãoestudada. Neste estudo,foram utilizados carrochos saudáveis comomodelo animalemsubstituiçãoaos seres humanos, devido ao baixo custo e aosatisfatórioresultado emcomparação comvoluntários humanos. Verificou-se tambémque os métodostradicionais para adeterminação daconcentração plasmáticadotamoxifenosão geralmentecaros.Assim, umametodologia analíticafoi adaptada apartir da literaturapara a determinaçãodo tamoxifeno noplasmade cachorrosde alta
  2. 2. performanceatravésde cromatografia líquida(HPLC)acoplada aultravioleta,detecçãocomsensibilidadee selectividadeadequadaspara realizaro estudo de bioequivalênciaentre as duastamoxifeno(10mg)por via oralformulações.EXPERIMENTALDrogas e produtos químicosOs orgânicos solventes grau HPLC utilizados para a extração e móveis fase de preparaçãoforam adquiridos da Merck (Rio de Janeiro,RJ, Brasil). Todos os outros reagentes foram de grauanalítico.A cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) Hewlett Packard sistema foi utilizado a fim deotimizar a separação de tamoxifenoe do padrão interno de clomifeno. Este sistema foicomposto por um sistema controlado, injetado por mão com alça de 50 mL e DetectorUVVisível operado a 280 nm. A fim de otimizar a Método de análise do tamoxifeno no plasma,uma HPLC SPC-10. O desempenho do método foi avaliado usando as soluções padrão dos compostos.Após a análise subsequente dos resultados do método foi otimizado utilizando amostras deplasma, paraestudos in vivo.Soluções padrãoA solução-mãe padrão de citrato de tamoxifeno foi preparada por dissolução de 0,0050 g dopadrão decitrato de tamoxifeno em um 50 mL de metanol. Diluições posteriores foramrealizadas a fim de se obter as concentrações finais de 4, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1 ug / mL. O estoquesolução do padrão interno foi também preparado dissolvendo 0,0050 g de clomifeno, em 50mL de metanol. Do mesmo modo, as diluições foram realizados para se obter umaconcentração final de 2ug / mL. Estoque e soluções de trabalho padrão foram protegidos daluz e armazenados à temperatura de -20 ° C até ser usado.A preparação das amostrasPara proceder à determinação do tamoxifeno no plasma do cachorro, as amostras de sangueforam colhidas e colocadas em tubos contendo EDTA. Os tubos foram centrifugadas (2000 gdurante 20 min) a 27 ° C, a fim de remover os elementos do sangue. O plasma foi entãotransferido para frascos de limpar e armazenadas a -70 ° C para posterior análise.Validação do MétodoPara realizar o ensaio de validação do método de plasma no cachorro os seguintes parâmetrosforam investigados: seletividade, linearidade, precisão e exatidão, robustez, limite dequantificação, limite de detecção e recuperação.Protocolo clínicoEste estudo foi realizado de acordo com um processo aberto, randomizado, dois períodosdesenho cruzado. A formulação teste de tamoxifenocitrato por Libra-Zita ® e a formulação dereferência do tamoxifenopor Wyeth-Whitehall foram utilizados na forma de comprimidos (10mg). Neste estudo, foram utilizados 14 cães (Caniumvulgaris) com a raça não definido (RND)divididos em três grupos de animais [grupo I (n = 5),o grupo II (n = 5) e o grupo de controlo (n =
  3. 3. 4)]. O grupo I foi o grupo de referência e do II grupo foi o teste. Os cães tinham cerca de 3,4anos (idade mínima de 2,5 anos e máxima idade de 5,5 anos), peso médio de 18,6 kg (pesomínimo de 13 e peso máximo de 26 kg). Os critérios de inclusão adotados foram:parâmetrosclínicos e laboratoriais, como exames hematológicos e sorológicos, nem história prévia dedoença renal e doenças hepáticas nem hipersensibilidade ao tamoxifeno. O critérios deexclusão adotados foram: qualquer doença aguda ou crônica que modificar a absorção, ometabolismo ou a excreção da tamoxifeno; animais que tinham tomado qualquer droga porduas semanas antes do início do estudo; presença de algumas infecções ectoparasitáriasseminfluência nos testes clínicos e laboratoriais. Durante o período de repouso, foi permitido aadministração de medicamentos comunspara vermes (Ancylex ® ou Oxprux®), e nos casos deinfecções de sarna, durante o ensaio, o tratamento deverá ser realizada com Ivomec ®. Parater os possíveis efeitos colaterais relacionados, os cães foram avaliados diariamente pelospesquisadores e do médico veterinário. Os fármacos foram administrados de acordo com um período de doisdesenho cruzado.No primeiro período, os animais foram divididos em dois grupos de estudo. Durante cadaperíodo, os cães foram submetidos a uma dieta com ração balanceada padrão às 17h00 antesdo dia de o estudo, quando começou a jejuar, buscando o início do estudo. RESULTADOS E DISCUSSÃOAs soluções de tamoxifeno e clomifeno testado com colunaWaters Nova-Pak CN 60 Å, 4 mm (6x 75 mm) apresentou bom tempo de retenção em todas as fases móveis avaliadas, comexceção da fase móvel constituída por ácido acético: acetato de amónio a 0,01% em metanol(99:1), devido à separação dos isómeros de clomifeno. As fases móveis compostas pormetanol: ácido acético (99:1) + acetato de amónio (0,025; 0,018; 0,014 e 0,01%) foramutilizadas para avaliar o comportamento cromatográfico do tamoxifenoe clomifeno no plasma.Dentro das fases móveis testadas, a composição de 0,014% de acetato de amónio em metanole ácido acético apresentou o melhor tempo de retenção, bem como uma boa separação dasproteínas plasmáticas. Os tempos de retenção do tamoxifeno e os seus padrão interno foramde 12,3 e 10,3 min.

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