1. Desenvolvimento de um Biossensor Enzimático para
Monitorização de Fármacos metabolizados por citocromos P450
Patrícia R. S. Rodrigues a), Sofia A. Pereira b), M. Gabriela Almeidaa,c) ,
Mathieu Etienned), Michel Kranendonke)
*e-mail: pr.rodrigues@campus.fct.unl.pt
a) REQUIMTE – Dept. Química, CQFB, Fac. de Ciências e Tecnologia, UNL, 2829-516 Monte de Caparica, Portugal.
b) NOVA/CEDOC - Fac. de Ciências Médicas, UNL, Campo dos Mártires da Pátria 130, 1150 Lisboa, Portugal.
c) Escola Superior de Saúde Egas Moniz, Campus Universitario, Quinta da Granja, 2829-511 Monte Caparica, Portugal.
d) CNRS and Université de Lorraine, LCPME, UMR7564, 405 rue de Vandoeuvre, F-54600 Villers-lès-Nancy, France.
f) Departmento de Genetica, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, R. de Junqueira 96, P-1349-008 Lisboa, Portugal.
Figura 1 -
No presente trabalho, propomos o desenvolvimento de um método de
imobilização simples de CYPs membranares, o qual poderá ser mais tarde
aplicado no desenvolvimento de biossensores para auto-monitorização
terapêutica de fármacos antirretrovirais em indivíduos infetados pelo HIV.
Em concreto, preparou-se um sol-gel hibrido contendo polietileno glicol,
para encapsulamento do CYP microssomal CYP1A2. Para aferir a eficiência
do método de imobilização e consequente transdução de sinal, usou-se a
voltametria cíclica. Verificou-se assim, que o CYP1A2 foi aprisionado com
sucesso, tendo-se obtido evidências de que este se encontra estável. A
introdução de polietileno glicol no sol, na presença do CYP1A2, possibilitou
a elaboração do filme híbrido, que não impede a transferência electrónica
direta entre a proteína e o elétrodo e que exibe uma maior estabilidade da
corrente catalítica na presença do co-substrato oxigénio. O sistema
proposto apresenta pois, características bastante promissoras para a
construção de biossensores amperométricos de fármacos antirretrovirais.
Agradecemos à Fundação para a Ciência e Tecnologia pela ajuda financeira no âmbito do projecto PEst-C/EQB/LA0006/2011
Referências: [1] S. Pereira, PhD Dissertation. Lisboa, 2009; [2] UK, Laemmli. Nature. 1970, 227, pp. 214-218; [3] Hara, Masayuki. Aplication of P450s for biosensing: combination of
biotechnology and electrochemistry. Materials science & engineering C. 2000, 12.
NADPH → FAD → FMN → Heme → O2
2H+
H2O
Electrode
Fe3+ RH Fe2+ RH
RH
H2O
H2O
ROH
O2
Fe2+ RH
O2
RHFe2+
O2
_.
Fe3+
H2O
Fe4+
RH
O
+.
1
5
4
3
2
6
NADPH
FM
N
Hem
e
ROHRH
FADO2
P450 P450 reductase
Hybrid Sol-Gel
Optimal formulation: sodium Silicate + PEG400
The use of sodium silicate prevents the introduction of alcohol in the starting
sol while PEG improves the stabilization of the membrane protein.
Pyrolytic graphite
electrode
CYP1A2
+
Sol-gel
Célula electroquímica
Sistema de 3 eléctrodos
Ag/AgCl Pt PGE (MB)
Extracto microssomal/
/electrólito suporte
Voltametria Cíclica (VC)
Condições experimentais:
- 20 mV/s
- Electrólito suporte 0,1 M KCl 50
mM Tris pH 7,6
-0.25
-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
-0.8 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2
Current(µA)
E versus Ag/AgCl
-0.25
-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
-0.8 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2
Current(µA)
E versus Ag/AgCl
-0.25
-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
-0.9 -0.8 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2
Current(µA)
E versus Ag/AgCl
Electrochemical responses of CYP1A2 (A) simply adsorbed on PGE surface, (B) immobilized in PEG400, (C) in sodium silicate and (D) in
an hybrid sol-gel matrix made of sodium silicate and PEG400. All measurements have been done in 50 mM phosphate buffer at pH7 after
degassing the solution for 20 min with Argon. The experiments have been performed at 50mV/s.
-0.25
-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
-0.8 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2
Current(µA)
E versus Ag/AgCl
-2.50
-2.00
-1.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
-0.9 -0.8 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2
Current(µA)
E vs Ag/AgCl / V
Influence of O2 addition on the electrochemical response of CYP1A2 immobilized
in sodium silicate – PEG400 hybrid sol-gel matrix. All measurements have been
done in 50 mM phosphate buffer at pH 7 after degassing the solution for 20 min
with Argon. Potential scan rate was 50 mV s-1.
Purged electrolyte

Successive additions of
oxygen reveal a
considerate increase in
the peak intensity
Successive scans in the
presence of oxygen
(saturated solution)
show a decrease in the
peak intensity
A possible explanation
is that the formation
of peroxides
originates a non
electroactive species
P450-
Fe+3
e-
e-
P450-
Fe+2
O
2
P450-Fe+2-O2
2e-,2H+
(at electrode)
H2O2+P450-Fe+2
(P450-
Fe+4=O)
H2O
2
2e-
,2H+
-9.0
-8.0
-7.0
-6.0
-5.0
-4.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
-0.9 -0.7 -0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3
Current(µA)
Potential ( V vs Ag/AgCl)
Detrimental influence of higher concentration of O2 on the direct electron transfer reaction. All
measurements have been done in 50 mM phosphate buffer at pH 7 after degassing the solution for
20 min with Argon. Potential scan rate was 50 mV s-1.
Os citocromos P450 (CYP) são proteínas hémicas que catalisam diversas reações oxidativas do metabolismo, principalmente a
monoxigenação de compostos lipofílicos. Os CYP são extremamente importantes no metabolismo de drogas em tecidos animais
porque convertem os fármacos em compostos mais hidrofílicos e, portanto mais facilmente excretados pela urina. Dependendo
da sua distribuição, podem ser classificados em três categorias: P450 do tipo microssomal, P450 do tipo mitocondrial, e P450s
bacterianos. Note-se, porém, que nem todas as espécies de P450 pertencem exclusivamente a um só grupo. Os P450
pertencentes às duas primeiras categorias são proteínas membranares, enquanto que os últimos dizem respeito a proteínas
solúveis em água [1-3].
Os CYPs são enzimas muito promissoras para aplicação em biossensores devido à existência de diferentes isoformas com
especificidade para uma grande panóplia de substratos. Dada a natureza redox das reações por eles catalisadas a
eletroquímica é a escolha óbvia para método de transdução destes biossensores. Todavia, o design do biossensor dita, não só, a
eficiência da transferência eletrónica como tem um papel crucial na sua performance; em particular, a sensibilidade e o tempo
de resposta que são muito dependentes da matriz de imobilização.
Fe3+ RH Fe2+ RH
Fe4+
RH
O
+.
Fe3+
H2O
1
5 4
3
2
6
H2O
ROH
RH
H2O
O2
Fe2+ RH
O2
e-
e-
Fe2+ RH
O2
H2O H+
H2O
H2O2
Peroxide
shunt
H2O
2H+,2e-
Direct
electrochemical
reduction
Proposed electrochemically driven P450 catalytic cycle. RH is the substrate.
Adapted from Michael Honeychurch. The direct electrochemistry of cytochrome
P450. What are we actually measuring?
Proposed electrochemically driven P450 catalytic cycle. RH is the substrate.
Adapted from Michael Honeychurch. The direct electrochemistry of cytochrome
P450. What are we actually measuring?