J.C Vidal - Uso de aptámeros en biosensors

APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES

Uso de aptámeros en biosensores

Juan C. Vidal

Aptámeros
8 -Marzo-
2.011


Uso de aptámeros en biosensores

ÍNDICE
SELEX, Transd.+Rec., vs Ab,
I. Aptámeros y Biosensores : Spielgelmers, Plegamientos

II. Transducción de masa : ● QCM ● AFM

● SPR ● Fluorescencia
III. Aptasensores ópticos :
● Aptabeacons ● Microarrays

IV. Aptasensores electroquímicos : ● Voltametría ● EIS

Índice


BIOSENSOR

I. Aptámeros y Biosensores


Características ideales de un biosensor

• Alta sensibilidad (ppb / ng mL-1) • Alta selectividad

• Alta fiabilidad • Tiempo vida largo

• Bajo coste • Tiempo corto análisis

• Pretratamiento muestra innecesario • Manejo sencillo

• Tiempo real • Portátil

• Automatizable • Miniaturizable

• Pequeño requerimiento operativo • Capacidad de multi-análisis



Biosensores analíticos
• Ópticos
BIOSENSORES • Electroquímicos
• Catalíticos (enzimas) • T. Masa (QCM)

• De afinidad (aptámeros, anticuerpos, DNA,
Receptores, tejidos, MIPs…)

Transductor

Bioreactivo inmovilizado

Biosensor: Transductor + Elemento de bio-reconocimiento selectivo


Selección de aptámeros: SELEX
Aptámeros
(DNA o RNA)

o SELEX convencional (1990)
o SELEX mejorado (ej. CE-SELEX)
o SELEX automatizado (1998)

(Librería combinatoria inicial 1013-1015 OLN;
In-vitro transcription; modific. quím.;
Selecc. negativa;Post-SELEX)

Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment


Aptámeros vs. Anticuerpos
Aptámeros Anticuerpos
Afinidad μM - pM μM - pM
Especificidad Alta Alta
Síntesis In-vitro In-vivo (inmunización)
Dianas Moléc. tamaño grande-peq. Moléc. con inmunorespuesta
Réplicas Misma molécula (síntesis) Variaciones (pAb)
Modif. química Sencilla / Afinidad Limitada
Desnaturalización Reversible Irreversible
Tiempo de vida Largo Limitado

5-25 kDa Nucleasas, pleomorfismo, simplicidad
vs
150 kDa Tamaño 6X: accesibilidad L, difusionabilidad,
cinética (superf. sólidas), nº L inmovilizados,
FP / EIS / SPR, Arrays


Spiegelmers / Aptámeros modificados

Nucleósidos modificados (1994<)
(no reconocidos por nucleasas). Post(Pre)-SELEX.
• “Mirror-image aptamers” (1996<)
• Síntesis de L-nucleósidos
(en lugar de D-enantiómeros)
• Mínima toxicidad e inmunogenicidad

Noxxon Pharma AG



Plegamiento de los Aptámeros
(Estructuras terciarias; Señal: Fluoróf. / MTC) • Especificidad
• Espaciadores
• Disoluc. reguladoras
• Iones
• Regeneración

Estabilización: puentes de H, hidrofobicidad, atracciones iónicas,
interacciones dipolares (Van der Waals)


Transducción

II. III y IV. Transducción


Transducción de masa (I)

• Efecto piezoeléctrico
QCM
• NO ETIQUETADO (t. real)
• f0 ~ 5 MHz, 10 MHz
S ~ 0,5 nM (3 ng cm-2),
IgG, Regenerac. (2002) II. Transducción de masa


Transducción de masa (II)

Flexible micro-cantilevers (2004)
Interferometría (“surface-stress” Apts >> Abs)
3-32 nm differential bending (Gold)
2x (referencia – ads. inespecífica)
Ej.: hepatitis HVC virus helicase (100 pg mL-1)
50 x 150 μm

AFM S ~ 1-100 nM Thbr II. Transducción de masa


Resonancia de Plasmón Superficial (SPR)

Sistemas de flujo (Biacore)

SPR ~ 10 pg/mm2
QCM ~ 1 ng/mm2

Kd (afinidad)

Afinidad (y cinética) aptámero-diana en tiempo real,
sin etiquetado (2001) III. Aptasensores ópticos


Aptasensores de fluorescencia (FP)

Fibra óptica-avidina+bi-RNA-Apt,
L-adenosina (μM) (1998)

• Anisotropía fluorescente: F. luz Polarizada
• Tamaños Ab-Apt => cambio difusión rotacional, onda evanescente
• Etiquetado fluorescente del aptámero
• Gran sensibilidad (LOD 0,7 amol ThBr, 3 órdenes magnitud; 10 min.)
• También cinética y Ka´s (en disolución, no immovilizados)

III. Aptasensores ópticos


Aptamer microarrays

Lisozima + HIV +
Ricina (glass-slides)
(LODs 320 ng mL-1)
(Ellington, 2004)

• Spotting”
• Multianalito (1998, FP)
• Somalogic (LOD 10 fM)
• FP (fibras ópticas)
• Bi-Apt + av-agarosa



Aptamer molecular beacons - FP

F*-Q* Aptabeacon: F*-Apt-F*(Q*) (hairpin) (1996)

• Versatilidad frente Ab’s
• Composición disoluciones
• En disolución (no inmovilizac. Apt)
F*-F* • No regeneración

FRET
Mayor sensibilidad
(ej. thrombin pM) (TBA, 2002)

Cocaine (dye displac.)


Aptasensores electroquímicos

Desplazamiento

ELAA (<1 nM) (2005)
TBA (CNTs)
(*): enz., MB, NPs
•S~20-200 mM (LOD ≤ 1 nM)

•DPV, CRA, SWV, LSV, …
•EIS

IV. Aptasensores electroquímicos


Aptasensores: sandwich / competitividad

Sandwich: Competitividad o desplazamiento:
=> necesidad de 2º Apt*/Ab* y epitopo => Necesidad de Ag*

• Conjugaciones previas
ELONAs (~ ELISAs)
• No influye el cambio conformacional (3D)
• Ensayo directo o indirecto (o sobre MBs) LODs ~ 0,5 pM



Espectroscopía de Impedancia e-

• No etiquetado (difus. externa)
• Sensibilidad (Ab’s)
• Modulac. carga Apt.(-)
• IgG (Ferric.), hairpin,
(2-100 nM, LOD 0,1 nM)
EIS (2005)
• Medida rápida (10-90 min.) IV. Aptasensores electroquímicos


Electrochemical aptabeacons
•Etiqueta electroquímica (mediador)
•Regeneración (immovilizac.)
•“Reagentless” (as SPR, QCM)
•No “contaminación óptica”
•Cuádruple / helix-junction
•Grandes cambios conformac. (Prot.)

Ejemplos:
TBA, 15 mesh, MB, DPV, nM-μM, G-quad. (2002)
Cocaína, MB, 3-stem, DPV, LOD 10 μM (2006)

Señal ON / Señal OFF


Aptasensor electroquímico de OTA (ejemplo)

Determination of OTA in wheat flour

DPV

LODs: 0,10 ng mL-1 OTA UE < 3-5 ppb´s


Aptasensores: ejemplos

• Factor Xa (p-Thbr=>Thbr)
Cocaína (500 μM)
• 2 Apt* (FM - híbrido) Platelet PDGF
• LOD 50 pM (3-way-juntion)

Aplicaciones Aptasensores:
Drogas, proteínas, peq. molec.,
Thrombina, fact. coagulac., Vit. B12, Aminoácds.,
Citoquinas, fact. crecim., IgG, toxinas, HIV, Bi/Av,
Dip-stick assays (ej. embarazo, micotoxinas)
NPs (CNTs, QDs)


Aptasensores (inmunosensores)
electroquímicos:
Prof. Juan R. Castillo (GEAS – Chairman)
Prof. Juan C. Vidal (GEAS)
Lcda. Alba Ezquerra (GEAS)
Dra. Laura Bonel (Capher IDI SL)
Lcda. Susana Hernández (Capher IDI SL)

Gracias por su atención !!

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