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IntroduçãoViolaceína,     um      pigmento     azul-violeta, é     um     tipode metabólito secundário com vários bioativo...
ProduçãoA produção de violaceina está sujeita a regulação via Quorum sensing.O sensoriamento populacional é realizado por ...
Como se Forma?
Enzimas relcionadas
Pra que violaceína???   - Proteção contra efeitos da radiação solar   sobre o microrganismo.   • elevado coeficiente de ex...
Violaceina• Propriedades  – Antimicrobianas  – Antifúngicas  – Inseticidas  – Anti células cancerígenas  – Anti-malárico  ...
Micro-organismos• Cromobacterium violaceum    – Gram Negativo    – Descrito em 1881, isolado do Rio      Amazonas•   C. fl...
Micro-organismos• Geralmente são cocobacilos ou bastonetes  curtos.• geralmente encontrados em solo e água  (principalment...
Material e Métodos• Bioprospecção:     • Sedimento marinho e de       corais da costa brasileira de       diferentes regiõ...
Material e MétodosKeeble Cross Agar                                King’s B Agar            Arroz estéril  Autoclave, esfr...
Material e MétodosIdentificação de Micro-organismos.- Caracterização colonial- Caracterização de Gram- Provas bioquímicas-...
Material e MétodosProdução• A produção de  violaceína será realizada  em shaker e em reator   – Em shaker serão     defini...
Quantificação e Caracterização• A violaceína e deoxyviolaceina       Violaceína  serão extraídas utilizando Acetato  de Et...
Purificação                                                      Cristalização                                         Sec...
Complexação em ciclodextrinasViolacein/-Cyclodextrin Inclusion Complex Formation Studied by Measurements of DiffusionCoeff...
ComplexaçãoComplexação: Concentrações equimolaresCiclodextrina em água + Violaceina em acetonaMisturas 1:1, 1:2 e 1:4Forno...
Avaliação das propriedades• Caracterização do complexado X  controle ciclodextrina X controle  violaceina   – H RNM   – FT...
Perspectivas futuras• Novas derivatizações utilizando dextranas de  baixo peso molecular.• Verificar eficácia em células t...
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Apresentação para Disciplina de Isolamento, Preservação e Identificação de Micro-organismos de Lara Durões Sette

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Violaceína

  1. 1. Bactérias marinhas produtoras deViolaceína: prospecção, produção epurificação para complexação em β- cliclodextrina para obtenção de fármacos. Paulo Marcelo Avila Neto Projeto apresentado na Disciplina de Isolmento, preservação e identificação de micro-organismos.
  2. 2. IntroduçãoViolaceína, um pigmento azul-violeta, é um tipode metabólito secundário com vários bioativos importantes produzidospor várias bactérias Gram-negativas.
  3. 3. ProduçãoA produção de violaceina está sujeita a regulação via Quorum sensing.O sensoriamento populacional é realizado por meio de pequenasmoléculas, denominadas autoindutores (AI). Os autoindutores podemser de diferentes naturezasquímicas: em organismos Gramnegativos, via de regra osautoindutores são do tipo N-acilhomoserina lactonas (AHL).
  4. 4. Como se Forma?
  5. 5. Enzimas relcionadas
  6. 6. Pra que violaceína??? - Proteção contra efeitos da radiação solar sobre o microrganismo. • elevado coeficiente de extinção molar e baixa solubilidade em água - Regulação da concentração do triptofano • esse aminoácido em elevadas quantidades seria tóxico
  7. 7. Violaceina• Propriedades – Antimicrobianas – Antifúngicas – Inseticidas – Anti células cancerígenas – Anti-malárico – Antiviral – Anti-oxidante – Etc...
  8. 8. Micro-organismos• Cromobacterium violaceum – Gram Negativo – Descrito em 1881, isolado do Rio Amazonas• C. fluviatile Janthinobacterium lividum• Janthinobacterium lividum• Iodobacterium sp.• Pseudoalteromonas luteoviolacea• Duganella sp.• Collimonas sp. Pseudoalteromonas sp.• Massillia sp. Isolada do fundo do mar produtora de violaceina Cromobacterium violaceum
  9. 9. Micro-organismos• Geralmente são cocobacilos ou bastonetes curtos.• geralmente encontrados em solo e água (principalmente na interface água-solo). – Nascentes – Sedimento – Rios, lagos e oceano
  10. 10. Material e Métodos• Bioprospecção: • Sedimento marinho e de corais da costa brasileira de diferentes regiões. • Alternativamente poderão ser isolados microrganismos de sedimentos de nascente, corpo e margem do Rio Negro – MA.
  11. 11. Material e MétodosKeeble Cross Agar King’s B Agar Arroz estéril Autoclave, esfrie a 550c efiltrar esteril solução de Meio de Manutençãoneomicina, ciclohexamida e produção deand nistatina a uma pigmentosconcentração final de 50mg/l. Peptona pode ser Peptona 20g/lusada ao invés de Glicerol 10g/lCasitona. Glicose por ser K2HPO4 1.5g/lsubstituido por glicerol MgSO4 1.5g/l Agar 15g/l Água 1000ml Extrato de Lev. 1g/l pH 7.2 Extrato de carne 1g/l Casitona 2g/l Glicose 10g/l Agar 15g/l Água 1000 pH 7.3
  12. 12. Material e MétodosIdentificação de Micro-organismos.- Caracterização colonial- Caracterização de Gram- Provas bioquímicas- Identificação rDNA 16s -As sequencias serão comparadas no GenBank usando método BLAST. Análises filogenéticas serão realizadas utilizando o Software MEGA. Os cladogramas serão construídos usando método de máxima máxima verossimilhança
  13. 13. Material e MétodosProdução• A produção de violaceína será realizada em shaker e em reator – Em shaker serão definidos os parametros nutricionais e temperatura para uma melhor produção usando DCCR. – Em reator será realizado cultivo para determinar melhor pH, agitação e aeração.
  14. 14. Quantificação e Caracterização• A violaceína e deoxyviolaceina Violaceína serão extraídas utilizando Acetato de Etila (Amotra:Acetato de Fase Aquosa Etila, 1:1 v/v), quantificadas por HPLC, utilizando uma coluna ZORBAX SB-Aq e fase móvel MeOH:Água (70:30 v/v) via absorbância a 577nm e 555nm.• Serão caracterizadas e confirmadas utilizando H NMR a 500MHz.
  15. 15. Purificação Cristalização Secagem em SecagemClorofórmio Dietil-eter Etanol Metanol:Água rotavapor 100ºC 1:1 Secagem a Coleta das HPLC 100 ºC frações x 10 Preparativo C18 MeOH:H2O (75:25)De acordo com: Rettori, D., Dura´n, N., 1998. Production, extraction andpurification of violacein: an antibiotic produced by Chromobacteriumviolaceum . World J. Microbiol. Biotechnol. 14, 685/688.
  16. 16. Complexação em ciclodextrinasViolacein/-Cyclodextrin Inclusion Complex Formation Studied by Measurements of DiffusionCoefficient and Circular Dichroism MARIÂNGELA B. M. DE AZEVEDO, JOEL B. ALDERETE, ANTONIO C.S. LINO, WATSON LOH, ADELAIDE FALJONI-ALARIO and NELSON DURÁN. Journal of InclusionPhenomena and Macrocyclic Chemistry 37: 67–74, 2000
  17. 17. ComplexaçãoComplexação: Concentrações equimolaresCiclodextrina em água + Violaceina em acetonaMisturas 1:1, 1:2 e 1:4Forno a vácuo: 50ºC overnight
  18. 18. Avaliação das propriedades• Caracterização do complexado X controle ciclodextrina X controle violaceina – H RNM – FTIR – HPLC • Propriedades – Antimicrobianas
  19. 19. Perspectivas futuras• Novas derivatizações utilizando dextranas de baixo peso molecular.• Verificar eficácia em células tumorais.• Verificar eficácia contra Tripanossoma cruzi e outros protozoários.
  20. 20. OBRIGADO

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