1. Virus de l'hépatite A et E
p
Virus et marqueurs diagnostiques
Vincent THIBAULT
Laboratoire de Virologie
Groupe Hospitalier
Pitié-Salpêtrière
Assistance Publique Hôpitaux de Paris
V.Thibault_janv.-12 1
Hépatites virales
p
mode de transmission préférentiel
parentéral féco-oral
féco oral
B non A non B
A, A
1965 D 1972
Vaccin
1977
C E Vaccin
1990 1991
(Vaccin)
(V i )
F, G, TTV, autres…
V.Thibault_janv.-12 2

2. V.Thibault_janv.-12 3
Historique VHA
q
Avant J.C.: “La Jaunisse” (Ikterus / kirrhos)
1745 : Cockayne, hépatites épidémiques
y , p p q
1908 : McDonald, "notion de virus…"
Reproduction de la maladie 1942 :
p
Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum
Entité clinique :
1995 : Vaccin
17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"1996 : recommandations
-VHB "serum")
Transmission nosocomiale (préparation vaccinale : variole, fièvre jaune…)
Visualisation : 1973 (Feinstone)
1999 : recommandations
Développement de la sérologie : épidémiologie
1979
19 9 : culture (Provost et Hilleman)
l (P H ll )
1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques
1991… Vaccination
1991 : V i ti
2006 : Déclaration obligatoire
V.Thibault_janv.-12 4

3. Virus de l'hépatite A
V.Thibault_janv.-12 5
Virus de l’Hépatite A
• Famille : Picornaviridae
Capside
p (entérovirus type 72)
• Genre : hépatovirus
• Taille 27-32 nm
27-32nm
• Non enveloppé
ARN (+)
• Structure icosaèdrique
• ARN simple brin
brin,
Vpg • polarité positive
• lié de façon covalente à
une protéine Vpg
V.Thibault_janv.-12 6

4. P1 prot. Capside P2 P3
0 Structurales Non structurales
7478
1B 1C 1D 2A 2B 2C 3
A-B 3C (PRO) 3D (POL) AAA
Vpg 1A
2.5kDa IRES
3
Traduction 2A A-B
(eIF-4G)
(eIF 4G) poly-
VP2 VP3 VP1 2B 2C 3C (PRO) 3D (POL)
protéine
VP4 2 227 AA
? Vpg
Protéase
Liaison NTP
Hélicase ARN
VP0 Polymérase
VP2 VP3 VP1 Réplication
Ré li ti
VP4 2A
VP2 VP3 VP1 X5 – X12
VP4 Protéines de surface 2A Maturation finale
immunogénicité
V.Thibault_janv.-12 7
Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules
Attachement
Libération Réplication
du génome
Espace +
de Disse -
Traduction
Synthèse +
de la polyprotéine
-
P3
Maturation
P2 Réticulum
endoplasmique
P1
Empaquetage
Canalicule
Relargage biliaire
V.Thibault_janv.-12 8

5. Interférence du VHA avec les mécanismes
de défense immunitaire
Qu et al. PLoS Pathogens 2011
Vol. 7;9:e1002169
V.Thibault_janv.-12 9
Prédisposition génétique Hép. A / Allergie
HAV-induced severe liver disease was
associated with a 6-amino-acid insertion
d h 6 d Meilleure liaison du VHA
in TIM1/HAVCR1 (157insMTTTVP), the Forme + sévère
gene encoding the HAV receptor.
Kim et al. J Clin Invest. 2011;121(3):1111–1118.
Chatenoud & Bach J Clin Invest. 2011; 121(3):848–850
V.Thibault_janv.-12 10

6. VHA : physiopathologie
Absence d'effet cytopathique direct :
d effet
cytolyse résultant du processus immun de
défense de l'hôte,
médiation cellulaire
édi ti ll l i
médiation humorale
V.Thibault_janv.-12 11
Propriétés Physiques du VHA
p y q
Agents Stabilité
Chaleur
Autoclavage (121°C, 20') Inactivation
100°C Inactivation
60°C Stable heure
St bl 1 h
température ambiante Stable 1 mois (selles, eaux, sols)
Plusieurs jours sur surface sèche
4 h Sur les mains
h. S l i
4°C Stable plusieurs mois
Congelé Stable des mois ou années
Acide-base
A id b pH 1 : stable 5 h
H t bl h.
PH 3-11 : stable au moins 30'
U.V. Inactivation
Chimiques
Chlore, ozone, Inactivation
glutaraldéhyde, iode
Alcool 70° 3' : inactivation partielle
V.Thibault_janv.-12 12

7. VHA et agents physiques ou chimiques
http://www.invs.sante.fr/publications/2009/guide_hepatite_a
V.Thibault_janv.-12 13
Variabilité génétique
P1 prot Capside
prot. P2 P3
0 Structurales Non structurales
7478
1B 1C 1D 2A 2B 2C 3
A-B 3C (PRO) 3D (POL) AAA
Vpg 1A
2.5kDa
Comparaison nucléotidique
C i lé tidi
6 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VI
⌦Homme : génotype I (90%), (III, II)
⌦Singes : IV, V, VI
Sérotype unique
é
⌦Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3
⌦Tests immunologiques
T i l i
⌦Vaccination (HM175, CR326)
virus i
i inactivé cultivé sur MRC 5
ti é lti é MRC-5
V.Thibault_janv.-12 14

8. Répartition mondiale des génotypes
Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge.
Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.
(g yp ), g
Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.
V.Thibault_janv.-12 15
Phylogénie et
facteurs de
risque
n=1156 cases
Klevens et al. Arch Intern Med.
2010;170(20):1811-1818
V.Thibault_janv.-12 16

9. Epidemiology and Genetic
Characterization of Hepatitis
A Virus Genotype IIA
Vi us G n t p
IA
IB
Diffusion du génotype IIA en IIB
France à partir d'une origine
p g
Autochtones
A h
Africaine
IIA
West Africa
VP1 sequences (900 nt.)
IIIB
Desbois et al. J CLIN MICROBIOLOGY, IIIA
2010, 48, 9:3306–3315
V.Thibault_janv.-12 17
Génotypes et sévérité de l'hépatite
Globalement, pas de consensus pour un lien direct entre le
génotype et la sévérité de l'atteinte hépatique –
Données en faveur de facteurs liés à l'hôte (TIM-HAVCR).
Hepatitis A Virus Genotype and Its Correlation With the Clinical
Outcome of Acute Hepatitis A in Korea: 2006–2008
p
Yun et al. J. Med. Virol. 83:2073–2081 (2011)
•n=556 (497 ARN positifs) Sept. 2006 à Août 2008
•Génotype IIIA induit des symptômes plus sévères
yp y p p
Comparative Analysis of Disease Severity Between Genotypes IA
and IIIA of H
d f Hepatitis A Vi
titi Virus
Yoon et al. J. Med. Virol. 83:1308–1314 (2011)
•n=111, comparaison de deux périodes 1998 et 1999 (IA) (n = 45) et 2009
(IIIA) ( = 66)
(n
•IIIA plus sévère (ALAT et durée hospitalisation)
V.Thibault_janv.-12 18

10. VHA : Paramètres Biologiques
Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination
IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)
protection contre réinfection
Ag foie IgG
Symptomes
Ictère
VHA Selles
IgM
VHA Sang
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24
Semaines 19
V.Thibault_janv.-12
IgM HAV uniquement à bon escient !
1%
11 %
82 %
Faux positifs = 30%
p
Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887
Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales +
réflexe Ig VHA Ig M HAV
⌦32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)
Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant
l'injection…
NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË
V.Thibault_janv.-12 20

11. Marqueurs biochimiques
Diagnostic ⌦ Transaminases (ALAT, ASAT)
⌦ Bili bi
Bilirubine
⌦ Phosphatase alcaline
⌦ Facteurs de coagulation
F g
Sérologie +++
IgM anti VHA : infection récente
IgG anti VHA : infection passée ou vaccination
IgM et IgG anti VHA
ti direct ( ) [ i
Diagnostic di
Di t (-) [uniquement d
t dans l cadre d'ét d ]
le d d'études]
Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)
Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante
(109v./mL), épidémiologie
Salive
S li :
IgG (ELISA)
V.Thibault_janv.-12
Génome viral (RT-PCR)
21
Quantification de la virémie ?
Limite de
quantification
11 Hépatites A
Normann et al.,
Journal of Medical Virology 72:10–16 (2004)
72:10 16
Hépatite fulminante Evolution bénigne Fujiwara K et al.
50 Hépatites A dont 19 fulminantes (10 OLT)
p f ( ) J. Med Virol. 2011 Feb;83(2):201-7.
Hépatite fulminante : Hepatitis A viral load in relation to
-virémie (p=0.03) * severity of the infection.
-bilirubine -(p=0.04) * 11 patients with fulminant hepatitis
-age (p=0 09)
age (p=0.09) 10 with severe acute hepatitis
-génotype non IA (p=0.09) 70 with self-limited acute hepatitis
Rezende et al., Hepatology 38:613-618 (2003)
V.Thibault_janv.-12 22

12. Durée de la virémie: conséquences cliniques et biologiques
6-7 5-6 2-5 Log particules/mL
Suivi de 13 patients : durée moyenne 95 jours Suivi de 27 patients
dont 2 avec rechute (1-2 mois)
High and Persistent Excretion of Hepatitis A
Duration of viremia in hepatitis A virus
p
Virus in Immunocompetent Patients
infection
Tjon et al.
Bower et al. Journal of Infectious Diseases
Journal of Medical Virology 78:1398–1405 (2006)
2000;182:12–7
V.Thibault_janv.-12 23
Hépatite A : le vaccin
virus inactivé
AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie
⌦ Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC-
p p
5 , inactivé
HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue
HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue
El / l E f/
⌦ Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines
diploïdes MRC5
p
Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à
12 mois plus t d
i l tard.
La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est
actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance
des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur au moins jusqu'à 20 ans
après primo-immunisation.
Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis
Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17
V.Thibault_janv.-12 24

13. Difficultés diagnostiques
En routine
Adresser prélèvements
au
Centre national de référence du VHA
Laboratoire de virologie
Hôpital Paul Brousse
12-14 P l V ill t Couturier
12 14 av Paul Vaillant C t i
94804 Villejuif cedex
Tel : 01 45 59 37 21
http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste
V.Thibault_janv.-12 25
SRAS ?
Hépatite E ? Grippe
V.Thibault_janv.-12 26

14. Historique VHE
Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites
⌦1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le
VHA, épidémie
VHA é idémi particulière. "NANBH"
ti liè
Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A :
Inde : prévalence de l hépatite A importante
l’hépatite
Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau
1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire
p p
immunisé contre VHA (Balayan)
Hépatite à J36
J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm)
Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus)
Hépatite "non A - non B à transmission entérique (ENANB)
non B"
1990 : Reyes et al. clonage et séquençage "VHE"
1991 : Tam et al. VHE
2000 : Panda et al. cDNA infectieux
V.Thibault_janv.-12 27
Coloured transmission electron micrograph of hepatitis E virus particles (purple)
Holmberg, Lancet Vol 376 September 11, 2010
V.Thibault_janv.-12 28

15. VHE Virus non enveloppé
Sphérique (SRV)
Famille : Hepeviridae Surface irrégulière
Genre : Hepevirus Capside 27-34 nm
27 34
Symétrie icosaédrique
ARN simple brin
hélice droite
polarité +
7,5kb
poly-A
poly A extrémité 3’
3
Stabilité
Au laboratoire : instable(-70 à +8°C)
Décongélation/congélation
Tractus GI : stable (pH)
V.Thibault_janv.-12 29
Organisation génomique
Non t
N structurales
t l Structurales
St t l
7 200 nt ARN polarité +
p
3’NC
5’ NC 28 5109 7124
Poly-A
5109
ORF3 114 AA
MeT Y Pro P X Hel RdRp 5123
ORF2 660 AA
G notyp s
Génotypes 1-4
Protéines
P téi
DIAGNOSTIC
immunogènes
Hétérogénéité génétique
Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés
en 24 sous groupes dont homologues animaux
Epitopes majeurs : parties C t d l’ORF3 et ORF2
E it j ti C-ter de t
Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype
⌦ Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre
les différents types ?)
ffé
⌦ Vaccin : ORF 2 recombinante
V.Thibault_janv.-12 30

16. Répartition des différents génotypes
Aggarwal Hepatology 2011
V.Thibault_janv.-12 31
Similarités des souches humaines et animales
Bilic et al. Journal of General Virology
(2009), 90, 863–873
Sporadique
Epidémique
humaines aviaires
Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV
and nine mammalian HEV isolates, based on
the complete genome region
V.Thibault_janv.-12 32

17. Etudes des souches de l'homme (n=100)
et du porc (n=43) en France
p ( )
Bouquet et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 17, No. 11, November 2011
V.Thibault_janv.-12 33
Homologie des souches de
l'homme et du porc
p
Bouquet et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 17, No. 11, November 2011
V.Thibault_janv.-12 34

18. VHE du lapin…
Cossaboom et al. Emerging Infectious Diseases Vol. 17,11, Nov 2011
V.Thibault_janv.-12 35
V.Thibault_janv.-12 36

19. Culture et Modèles animaux
• Culture
Difficile
Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)
Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome et "A549" cellules cancer
A549
poumon (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007; Takahashi et al. Arch. Virol. 2012)
Cellule embryonnaire
• Modèles animaux
Primates : reproduction de la pathologie humaine
Volontaires...
VHE du porc, du poulet
Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...
Lapin… Ma H et al. Experimental infection of rabbits with rabbit and genotypes 1
and 4 hepatitis E viruses. PLoS One. 2010 Feb 11;5(2):e9160
V.Thibault_janv.-12 37
Résistance thermique du VHE…
VHE dans des suspensions fécales :
Inactivation : 70°C 10' ou 95°C 1 min;
I ti ti i
56 °C 30 min maintien de l'infectiosité
Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007
Colson et al. JID 2010:202
V.Thibault_janv.-12 38

20. VHE et contamination des eaux
Presence of hepatitis A virus (
p (HAV) and hepatitis E virus (
) p (HEV) in
)
urban wastewater
Prédominance du génotype 3
g yp
J. Rodriguez-Manzano et al. Excretion patterns of HAV and HEV infections
in Eastern Spain Journal of Water and Health 08.2 2010
V.Thibault_janv.-12 39
VHE : Paramètres Biologiques
Khuroo MS, Khuroo MS.
Seroepidemiology of a second epidemic of hepatitis
E in a population that had recorded first epidemic
Titre peu élevé
p
30 years b f
before and h
d has b
been under surveillance
d ill
protection contre réinfection ?
since then.
Hepatol Int. 2010 Feb 3;4(2):494-9 IgG
Symptomes
Ictère
VHE Selles
IgM
VHE Sang
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200
Jours 40
V.Thibault_janv.-12

21. Virémie et excrétion fécale
Virémie Selles
Détection du RNA-VHE chez 20 patients ayant une hépatite E aiguë
Aggarwal et al. THE LANCET • Vol 356 • September 23, 2000, p1081-1082
Chandra NS et al. Dynamics of HEV viremia, fecal shedding
and its relationship with transaminases and antibody
response in patients with sporadic acute hepatitis E.
V.Thibault_janv.-12 Virol J. 2010 Sep 6;7:213 41
Stratégie Diagnostique Pratique
Hépatite aigue sans immunosuppression
1. IgM anti-VHE
Délai d'obtention du résultat rapide
2. Recherche du génome du VHE (S
2 R h h d é d (Sang et Selles)
t S ll )
Fiabilité des tests ?
Hépatite dans un contexte d'immunosuppression
d immunosuppression
1. Recherche du génome du VHE (Sang et Selles)
2.
2 Eventuellement quantification ARN VHE avant traitement
ARN-VHE
3. Marqueurs sérologiques sans intérêt clinique
Recherche d'anticorps (IgG) anti-VHE
d anticorps
Intérêt ?
Fiabilité des tests ?
V.Thibault_janv.-12 42

22. Stratégie Diagnostique
g g q
Se donner les moyens de faire le diagnostic
Diagnostic Indirect Diagnostic Direct
Recherche de l'immunité antivirale Recherche du génome sur
IgM anti VHE prélèvements sang et selles
IgG anti VHE
Diagnostic
Di ti IgG
I G IgM RT-PCR
I M RT PCR
Certain +/- ++ +
Probable +/- - +
Douteux +++ - -
Immunité
+ - -
ancienne
Huang S et al. 2010 Profile of Acute Infectious Markers
in Sporadic Hepatitis E. PLoS ONE 5(10): e13560
V.Thibault_janv.-12 43
Stratégie Diagnostique
(à adapter en fonction du lieu géographique...)
p g g p q
Marqueurs non biologiques
circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)
A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?)
Priorité hépatite
P i ité hép tit A ou hép tit E
u hépatite
Enquête alimentaire
"profil" du patient (âge, facteurs de risque…)
clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez
l'immunocompétent ! )
Portage prolongé en cas d'immunodépression
P l é d' dé
Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion
Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D)
é
Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)
V.Thibault_janv.-12 44

23. Performance des tests sérologiques
Panels
50 sérums ARN HEV (+), G3
406 sérums IgG ARN HEV (-)
( )
IgM anti-HEV
Microplaque
p q Microplaque
p q Test rapide
p
Adaltis MP Diagnostics MP Diagnostics
anti-HEV IgG
positif négatif positif négatif positif négatif
Positif (n=41) 40 1 39 2 37 4
Negatif (n=9) 5 4 5 4 4 5
Total (n=50) 45 5 44 6 41 9
Sensibilité 90 88 82
Spécificité
p f 100 99.5 100
VPP 100 95.7 100
VPN 98.8 98.5 97.8
Legrand-Abravanel CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, May 2009, p. 772–774
V.Thibault_janv.-12 45
Des données à affiner...
% d'enfants ou de donneurs de sang positifs pour les IgG anti-VHE (test Wantai)
Séroprévalence de 16.6% rapportée antérieurement...
Séroprévalence par tranche d'âge
é é l h d'â
80
70
70
62.1 Facteurs de risque :
60 56
âge
50 résidence rurale
é id l
42.5
40 chasse
%
32.8
contact avec les
30
chats
20
44% (n 18) de
(n=18)
10 saucisses ARN-VHE +
3.7
0
24
2‐4 18 27
18‐27 28 37
28‐37 38 47
38‐47 48 57
48‐57 58 65
58‐65
n=188 n=64 n=106 n=184 n=116 n=40
Mansuy et al. 2011 Em. Inf. Dis 17;12,2309 46
V.Thibault_janv.-12

24. Performance des tests : détection du
génome viral (RT-PCR)
Panel de 24 échantillons envoyés à
% de détection positive différents laboratoire
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
titre (log) 6.2 /5.2/4.2/3.2/2.2/1.2 6.4 /5.4/4.4/3.4/2.4/1.4 5.1 /4.1/3.1/2.1/1.1 5 /4 /3 /2 /1
HRC‐HE104 (3a) JRC‐HE3 (3b) RKI (3f) HRC‐HE15 (4c)
Baylis et al. J. Clin. Microbiol. 2011, 49(4):1234.
V.Thibault_janv.-12 47
HEV – virémie- selle
transmission
ran m n
serum
salive
Concentré de plaquettes à J0
Transfusé à un homme de 64
ans traité pour Lymphome
non-Hodgkinien par GM IgG
autologue
IgM
Matsubayashi K, et al. Transfusion.
2008 Jul;48(7):1368-75.
V.Thibault_janv.-12 48

25. Immunodépression, hépatite chronique et
stratégie diagnostique
Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé,
D l d d' i ti ti h ti t i dé i é
La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée !
(ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR)
s applique
Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748
V.Thibault_janv.-12 49
VHE et vaccination
20 μg d'antigène rHEV (capside exprimée
dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur
0.5
0 5 mg d'hydroxyde d'aluminium.
d'h d d d' l i i
3 injections
Moyenne géométrique du taux
d'anticorps anti-VHE
Efficacité : 95,5% après 3 doses
Risque cumulé d'un premier épisode
d'hépatite E
Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9
V.Thibault_janv.-12 50

26. HEV 239 (Hecolin; Xiamen Innovax Biotech,
Xiamen, China), produced in bacterial cells :
VHE et vaccination safe and efficacious against infection with
hepatitis E virus in seronegative participants in
a phase 2 trial
Zhu et al Lancet. 2010 Sep 11;376(9744):895-902
V.Thibault_janv.-12 51
Difficultés diagnostiques
En routine
Adresser les prélèvements
au
Centre national de référence du VHA/VHE
Laboratoire de virologie
Hôpital Paul Brousse
12-14 P l V ill t Couturier
12 14 av Paul Vaillant C t i
94804 Villejuif cedex
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