1. PATHOGENÈSE DES LÉSIONS
HÉPATIQUES DU VHC :
Mécanismes moléculaires
Dr. Hervé LERAT, PhD.
INSERM U955
Département de Virologie Moléculaire et Immunologie
Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)
Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.

2. Pathogenèse associée au VHC
Chronic viral infection
Liver Tumor
Host & Environmental factors
Fibrosis
Steatosis
Diabetes
Cirrhosis
Viral
Proteins

3. Hépatocarcinomes viro-induits :
rôle direct et/ou indirect des protéines virales?
Infection VHC
Réponse immunitaire de l’hôte
Protéines virales
Lésions
hépatiques
Cirrhose
?
CANCER

4. Pathologies viro-induites:
contribution du virus?
Contexte d’un organe entier
dans un animal vivant.
Nécessité de développement de
modèles animaux

5. Modèles animaux pour l’étude des
pathologies induites par le VHC
Modèles d’infection

Primates non-humains


Chimpanzé
Ouistiti

Problème de disponibilité et de coût.

6. core E1
E2
NS2
NS3
NS4a
Promoteur Albumine
p7
Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35)
NS4b NS5a
NS5b
SV40 PolyA
Génotype 1b
micro-injections
C57Bl6J x C3H/HeJ
FOIE
ADN HCV +
X C57BL6J ou C3H
ARN VHC +
Lerat et al., Gastroenterology 2002
FL-N/35
FL-N

7. core E1
E2
NS2
NS3
NS4a
Promoteur Albumine
p7
Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35)
NS4b NS5a
NS5b
FL-N
SV40 PolyA
Génotype 1b
micro-injections
C57Bl6J x C3H/HeJ
CHC
FOIE
Stéatose
ADN HCV +
X C57BL6J ou C3H
ARN VHC +
+CCl4
fibrogenèse
Lerat et al., Gastroenterology 2002

8. CHC induit par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?

9. Hepatocellular Carcinomas
1 cm
FL-N/35-171UNC
1 cm
FL-N/35-170UNC
1 cm
FL-N/35-102CERFE
A
Lerat et al., Gastroenterology 2002.

10. Inhibition de la voie apoptotique FAS dans le foie des souris VHC
FasL
Membrane cellulaire
Fas
VHC (NS5A)
calpaïne
mitochondrie
caspase 8
Bid
cytochrome C
caspase 3
Etape vers le
cancer
APOPTOSE
caspase 9
CIDE-B
fragmentation ADN
VHC
(NS2)

11. Lésions de l’ADN – La famille GADD
GADD34
GADD153
GADD45a
GADD45g
GADD45b
Senseurs de stress
G0
M
CyclinB1
Lésions de
l’ADN
GADD45β
G1
G2
Cdc2
S
Q
VHC
Histone H3
Histone H1
Lamine
P
P
P
Arrêt du cycle
cellulaire (G2/M)
Les protéines du VHC induisent la méthylation du promoteur de GADD45β:
inhibition de sa transcription : évasion du point de contrôle.

12. Effects of c-Myc over-expression
G0
M
Abnormal
G1-S progression
ROS production
(reactive oxygen species)
VHC
G1
S
c-Myc
c-Myc c-Myc
c-Myc
Genomic instability
DNA damage
SSB
G2
DSB
Normal
Cancer

13.  Signalling events activating Akt – Downstream effects
Human
hepatoma cells
Mice
wt
p=0.02
300
FL-N/35
p=0.02
250
Relative Akt activity (%)
Relative Akt acitvity (%)
250
200
150
100
50
200
150
100
50
Hepatic lysates
Primary cells
p = 0,006
200
p = 0.003
100
0
0
0
300
p = 0.01
P-AKT/total AKT (EtOH = 100%)
300
Human liver
400
Huh7 Huh7
+ SGR
EtOH
HBV +
HCV +
Non-tumoral tissue
AKT is activated in the context of HCV infection and HCV protein expression.
Higgs et al. Oncogene, 2013

14. HCV infection
Viral protein
expression
Non structural proteins
NS5A
GADD45b promoter
Pi3K/P-AKT
CH3
CH3
Bid
b-catenin
b-catenin
Mitochondrial dysfunction
Metabolic syndrome
(IR,steatosis)
Oxidative
Stress
DNA damage
c-Myc
promoter
c-Myc
c-Myc
c-Myc
c-Myc
Defective
DNA repair
Gadd45b
Cell cycle
Blockade
Stem cell
recruitment
Diminished
apoptosis
Genomic instability
Evènements pro-carcinogènes
Abnormal
cell-cycle checkpoints
Gastro 2002, 2004, 2006, 2008
JBC 2003
JBC 2009
Hepato 2009
Cancer Res 2010
J Hepatol 2012
Oncogene 2013

15. Stéatose induite par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?

16. Microvesicular steatosis
Non TG
HCV TG
HCV TG
HCV TG
Lerat et al., Gastroenterology 2002.

17. Stéatose micro-vésiculaire
coloration Oil Red O
p<0.001
25
% de l’aire total
20
n=12
12.5 ± 0.4
15
10
n=10
n=12
14.4 ± 0.8
13 ± 0.8
5
M
0
n=7
14.1 ± 0.3
HCV TG
NON TGM
analyse in silico
F

18. Résumé
SREBP1c
SREBP1c =
Domaine de transactivation
(Noyau)
Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Stress RE
Lipogenèse
Acetyl-CoA
ACC
RE
=
PERK
ATF6
IRE-1
Malonyl-CoA
P-eiF2α
Epissage ARNm XBP1
FAS
Arrêt traduction
Dégradation protéique
Acyl-CoAs
SCD1
TG
Accumulation TG intracellulaires
ApoB
MTP
VLDL
Exportation TG
STEATOSE
HEPATIQUE

19. Potential mechanisms of HCV-induced steatosis
Lerat et al., Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 5(3):341-52, (2011)

20. Fibrose induite par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?

21. Fibrosis is enhanced in CCl4-treated FL-N/35 mice
WT
FL-N/35
p<0.005*
Area of fibers (%)
3.0
- CCl4
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
+ CCl4
WT
n
FL-N/35
WT
FL-N/35
5
5
13
17
- CCl4
+ CCl4
*Mann-Whitney test
Scale bars : 100µm.

22. Fibrogenèse
Lésion hépatique chronique
Altération de
la prolifération
hépatocytaire
HPC
Fibrogenèse
périportale
Réaction
Ductulaire
Chouteau et al. J Hepatol. (2012)

23.  HCV, liver fibrosis and regeneration:
CCl4 injection
(IP, 795mg/kg)
FL-N/35
WT
Sacrifice, liver sections, BrdU staining
0h
Quiescent liver
24h
/
40h
Liver damage
/
48h
72h 120h
60h
Hepatocyte proliferation
/
Liver repair
0h
p<0.0001
250
BrdU + hepatocytes / µm2
24h
+ CCl4
40h
48h
200
wt
150
FL-N35
p<0.0001
100
50
0
0h
n=
60h
24h
40h
48h
60h
4/4
4/4
8/8
4/4
4/4
- CCl4
wt
+ CCl4
FL-N/35
The hepatocyte cell cycle is deregulated in HCV mice during liver repair.

24.  HCV, liver fibrosis and regeneration:
HCV infection
HCV protein
expression
Hepatocyte
cell cycle
perturbation
?
DNA
damage
Higgs et al. Cancer Research, 2010
Chouteau et al. J Hepatol 2012
Higgs et al. Oncogene, 2013

25.  HCV, liver fibrosis and regeneration:
HCV
ROS
ATM
P
p53
Chk 2
ATR
Chk 2
P
Chk 1
Chk 1
Degradation
P
p21
p53
cdc25a
cdc25a
Ub
Ub
Ub
P
Cyclin E
Rb
Cdk2
Rb
E2F
E2F
S phase genes
(Cyclin A)
Delayed
The modulation of the oxidative stress-DNA damage-cell cycle axis by HCV protein expression results in a
delayed G1/S phase.

26. Conclusions

Modèle reproduisant les principales pathologies induites par le
VHC


Niveau d’expression similaire à l’infection chronique chez l’homme
Absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation ni de cirrhose)

La cirrhose n’est pas un pré requis au développement de CHC :
en accord avec données cliniques (méta-analyse, Maisonneuve
2009)

Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines
virales en absence de cirrhose.







Inhibition de l’apoptose (voie FAS)
Inhibition de l’expression du suppresseur de tumeur GADD45β
Stimulation de l’expression de l’oncogène c-myc
Activation de la kinase AKT
Inhibition de la sécretion des VLDL (MTP)
Stimulation de la lipogenèse
Fibrogenèse associée à une réaction ductulaire due à une inhibition de
la prolifération hépatocytaire (ROS, lésion de l’ADN)

27.  PERSPECTIVES:
Co-morbidity (non-viral) factors in virally-induced HCC
•
Main objective: To induce liver inflammation in HCV mice. HCC incidence?
MCD or DIO
FLN/35 or HLE mice
HCC incidence
and mechanisms
Mdr2 KO
FLN/35 or HLE mice