Chevaliez du hépatites 2015

1. Hépatite C
Virus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil

2. Découverte du Virus de l’Hépatite C
From New England Journal of Medicine, 1975
Hépatite C : Virus et Marqueurs

3. Identification du Virus de l’Hépatite C
From Science 21 April 1989
Hépatite C : Virus et Marqueurs

4. The Global Burden of HCV Infection
• Approximately 170 million people are chronically
infected with HCV
• HCV is responsible for >350,000 deaths per year
worldwide
- 60,000 in Europe
- >7,500 in the US
• Up to 85% of HCV-infected patients are unaware of
their status
- 50.3% in the US
- 42.6% in France (i.e., 100,000 persons)
• Less than 10% of the HCV-infected population has
received treatment in the US
Hépatite C : Virus et Marqueurs

5. SVR Rates in the Past 25 Years
Heim M. Nat Rev Immunol 2013;13(7):535-42.
Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire
2014-2015

6. Outline
Hépatite C : Virus et Marqueurs

7. I. TAXONOMIE

8. Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

9. • Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
• Tropisme : Hépatocyte
Virus de l’Hépatite C
Hépatite C : virus et marqueurs

10. Identification d’Homologues du VHC chez
les Non Primates
Kapoor et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108(28):11608-13; Kapoor et al., Mbio 2013;4(2):e00216-13.
Phylogénie de la région codant RdRp (7711-8550 HCV g1a)
CHV: canine hepacivirus
RHV: rodent hepacivirus
Hépatite C : Virus et Marqueurs

11. II. MODÈLES EXPERIMENTAUX

12. Les Différents Modèles d’Etude in vitro
• cDNA développés en 1997
• Réplicons subgénomiques (1999)
• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp) (2003)
• Système de culture permettant le production
de particules virales infectieuses (HCVcc)
(2005)
Hépatite C : Virus et Marqueurs

13. Les Modèles Animaux
Tawar et al., Cell Res. 2014;24(10):1153-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

14. III. ORGANISATIONS
STRUCTURALE & GENOMIQUE

15. Organisation Structurale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.

16. Densité des Particules Circulantes
Lindenbach BD. Curr Top Microbiol Immunol 2013;369:199-218.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

17. The “Lipidome“ of HCVcc Particles
Merz et al., J Biol Chem 2011;286(4):3018-32.
LPC: lysophosphotidylserine
CE: cholestery ester
Chol: cholesterol
PI: phosphatidylinositol
PS: phosphatidylserine
PE: phosphatidylethanolamine
SM: shingomyelin
PC: phospahtidylcholine
PG: phosphatidylglycerol
Total lipid profile Phospholipid profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs

18. Organisation Structurale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.

19. Organisation Génomique des
Flaviviridae
Hépatite C : Virus et Marqueurs
0 1800 3600 5400 7200 9000 10800
C
4A
p7
NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E1
5’UTR 3’UTR
Hepatitis C virus
Npro
C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
4A
p7
5’UTR 3’UTR
Pestivirus
C
prM
E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap
5’UTR 3’UTR
Yellow fever virus

20. Organisation Génomique
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Scheel TK, Rice CM. Nat Med 2013;19(7):837-49.

21. Structure de l’IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
“Pseudoknot domain“
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.

22. Crystal Structure of the Full HCV IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.

23. MicroRNA (miR)-122 et Infection VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Expression abondante et spécifique du
foie
• Interaction avec la région 5’NC du génome
viral
– 2 sites au niveau du domaine I
• Favorise la stabilité de l’ARNm viral

24. miR-122 : Cible Thérapeutique ?
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Janssen et al., N Engl J Med. 2013;368(18):1685-94.

25. Efficacité Antivirale du Miravirsen
Janssen et al., N Engl J Med 2013;368(18):1685-94.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

26. Pros & Cons des Antagonistes de miR-122
• Activité pangénotypique
• Barrière à la résistance élevée (HTA)
• Administration parentérale
• Faible taux de miR-122 dans les hépatocytes a
été associé au développement d’HCC
Tsai et al., J Clin Invest 2012;122(8):2884-97; Wilson et al., Curr Opin Virol 2014;7C:11-18.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

27. IV. LES DIFFÉRENTES
PROTÉINES VIRALES

28. Protéines du VHC
Bartenschlager et al., Nature Reviews Microbiology 2013; 11, 482–496.
Assembly module Replication module
Hépatite C : Virus et Marqueurs

29. Réseaux d’Interactions
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Park et al, BMC Bioinformatics 2010, 11(Suppl 1): S23.

30. Protéine de Capside
• Forme mature formée de ~177 amino
acides (21-kDa)
• Capacité de lier les lipides et l’ARN
• Structure tridimensionnelle non résolue
– Conformation en hélices alpha (~ 50%)
– Constituée de 2 domaines (D1 & D2)
Hépatite C : Virus et Marqueurs

31. Protéine de Capside
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365.
Domaine d’interaction avec l’ARN viral Domaine d’interaction
avec LD

32. Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC G1b

33. Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
Hépatite C : Virus et Marqueurs

34. Kong et al,Science. 2013 Nov 29;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Topologie de la Protéine E2 : Domaine “Ig-like“

35. Structure de E2
Purple and red: Ig ß sandwich
Blue: CD81 receptor binding loop
Kong et al,Science 2013;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

36. Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
• Interaction avec récepteurs membranaires
– CD81
– SRB-I
Hépatite C : Virus et Marqueurs

37. Étape Précoce : Entrée du VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.

38. E2 : Trois Domaines Variables
• E2 contient 3 domaines très variables
– HVR1
– VR2
– VR3
• Délétion HVR1 est non létale mais
augmente la sensibilité du virus aux
anticorps neutralisants
Hépatite C : Virus et Marqueurs

39. Variabilité du VHC
Magiorkinis et al., PLoS Med. 2009;6(12):e1000198.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

40. HVR1
Région HVR1 (27 amino-acides)
 80% de divergence nucléotidique entre génotypes
 Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

41. Transmission du VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs

42. 6a_33
2b_JFH1
Patient 1 (7/04)
5a_SA13
1b_HVR3812
S5 (7/05)
Patient 3 (7/05)
Patient 3 (9/05)
Patient 2 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 3 (7/04)
S4 (6/05)
S3 (6/05)
S2 (6/05)
Patient 3 (01/05)
S1 (6/05)
1a_HCT27X5
2a_Q2B
3a_CB
1a_HCT18X5
Patient 6
1b_AWV2C33
Patient 8
Patient 4
Patient 7
4a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniques
Séroconversion VHC
Analyse Phylogénique
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
Hépatite C : Virus et Marqueurs

43. Protéine p7
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Viroporine dont la
structure 3D a été
récemment déterminée par
ME
• Rôle(s) in vivo ?
• Cible thérapeutique
potentielle
Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.

44. Rôle in vivo ?
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Scheel TK, Rice CM. Nat Med 2013;19(7):837-49.

45. Activité Antivirale du BIT225
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV
• Activité synergique
Luscombe et al., Antiviral Res 2010;86(2):144-53.

46. Activité Antivirale in vivo
• Phase II
- Patients VHC (G1a, G1b, G3)
- Patients VIH (inhibiteur de Vpu)
- Patients coinfectés
• Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de
traitement
- 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4
semaines suivi de la bithérapie pendant 44
semaines
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

47. Taux de Réponses Virologiques
• Futurs développements
– Génotypes 1 & 3
– 3 mois de traitement en association à pegIFN/RBV
– Evaluation de l’efficacité en association à d’autres
DAA
Treatment EVR (%) SVR % (n/N)
200 mg BIT225+ pegIFN/RBV 88 88
400 mg BIT225+ pegIFN/RBV 86 100 (7/7)
pegIFN/RBV 63 75 (6/8)
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire

48. Protéine NS2
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• NS2 (région N-ter)
– Rôle dans l’organisation
de la formation des
nucléocapsides
• NS2pro
(région C-ter)
Jirasko et al., PLoS pathog 2010;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.

49. Protéine NS3-4A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.

50. Inhibition de la Production d’IFN par NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Rehermann B., J Clin Invest 2009;119(7):1745-54.

51. Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAs
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.

52. Protéase NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.

53. Telaprevir
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Kieffer et al. Hepatology 2007;46:631-639.
Telaprevir Dosing Telaprevir Dosing
0
2
4
6
8
0
2
4
6
8
Log10HCVRNA(IU/mL)
Log10HCVRNA(IU/mL)
HCV RNA (>100 IU/mL)
Wild type
T54A
V36A/M
R155K/T
36/155
A156V/T
36/156
Days Days
Patient 1002Patient 1018
LODLOD
1 14 1 14

54. Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
Caractéristiques des IP
DAA
PI 1st
generation
PI 2nd
generation
NS5A Inh. 1s
t
generation
NS5A Inh. 2nd
generation
NS5B
nucleos(t)ide
inh.
NS5B non
nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance
profile
Pangenotypi
c efficacy
Adverse
events
Drug-drug
interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs

55. Telaprevir Approved First generation
Boceprevir Approved First generation
Simeprevir Approved Second wave
Faldaprevir (BI1335) Phase 3 Second wave
Asunaprevir Phase 3 Second wave
ABT450/r Phase 3 Second wave
Sovaprevir Clinical hold Second wave
Vedroprevir Phase 2 Second wave
IDX-320 Phase 2 Second wave
Vaniprevir Phase 3 (Japan) Second wave
Danoprevir Phase 2 Second wave
MK-5172 Phase 3 Second generation
ACH-2684 Phase 2 Second generation
Inhibiteurs de Protéase
Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

56. • Protéine essentielle à la formation des complexes
de réplication
• Phosphoprotéine régulée par PI4KIII alpha
(enzyme localisé au niveau du RE)
– P56 et p58 (forme hyperphosphoryléee)
• Formée de 3 domaines
• Cible d’inhibiteurs spécifiques
Protéine NS5A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Reiss et al., PLoS Pathog. 2013 May;9(5):e1003359.

57. Protéine NS5A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
RNA binding
groove
Tellinghuisen et al., Nature 2005;435(7040):374-9.

58. Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAs
Hépatite C : virus et marqueurs
Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.

59. Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
Caractéristiques des anti-NS5A
DAA
PI 1st
generation
PI 2nd
generation
NS5A Inh. 1s
t
generation
NS5A Inh. 2nd
generation
NS5B
nucleos(t)ide
inh.
NS5B non
nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance
profile
Pangenotypi
c efficacy
Adverse
events
Drug-drug
interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs

60. Daclatasvir Phase 3 First generation
Ledipasvir (GS-5885) Phase 3 First generation
Ombitasvir (ABT-267) Phase 3 First generation
ACH-2928 Phase 2 First generation
PPI-668 Phase 2 First generation
GSK 2336805 Phase 2 First generation
BMS 824393 Phase 2 First generation
Samatasvir Phase 2 First generation
AD4025 Phase 1b ?
MK-8742 Phase 2 Second generation
ACH-3102 Phase 2 Second generation
GS-5816 Phase 2 Second generation
Inhibiteurs de NS5A
Link et al,. J Med Chem. 2014;57(5):2033-46; Degoey et al., J Med Chem 2014;57(5):2047-57; Ivachtchenko et al., J Med Chem 2014 Sep 9.
Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

61. Mécanismes d’Action des anti-NS5A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Eyre NS, Beard MR.
Gastroenterology.
2014;147(5):959-62.

62. Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999,
7: 1417-1426.
Protéine NS5B: RdRp
Hépatite C : Virus et Marqueurs

63. Réplication
– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN monocaténaire de
polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery 2007; 6: 1001-18.
Réplication Virale
Hépatite C : Virus et Marqueurs

64. Variabilité Génétique
• Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
. 10
-4
-10
-5
mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées
– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’
("proofreading")
– Accumulation de mutations
• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces
Hépatite C : Virus et Marqueurs

65. Diversification des Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
4
1
5a
3
2
6
7a

66. Distribution des Génotypes
Manns and von Hahn., Nat Rev Drug Discov 2013;12(8):595-610.
Hépatite C : Virus et Structure

67. Répartition des Génotypes en France
61%
9%
19%
9%
2%
Génotype 1 (n=961)
Génotype 5 (n=29)
Génotype 4 (n=144)
Génotype 2 (n=137)
Génotype 3 (n=293)
Génotypes6 (n=10)
0,6%
Brouard et al., J Hepatol 2009, 50(Supl. 1): S148 (abstract 390).
Hépatite C : Virus et Marqueurs

68. Distribution en Quasi-espèce
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Domingo E., Cell 1978, 13 (4):735-744.

69. Quasi-espèces
• Décrites pour la première fois en 1978 par
Domingo et coll
– Bactériophage Qβ
• Evolution Darwinienne
– Génération de mutants compétition
avantages aux variants les plus “fit“
Domingo et al., Cell 1978;13(4):735-44; Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

70. “Last but not Least“
Hépatite C : Virus et Marqueurs

71. Consequence of Genetic Bottleneck
Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

72. Inhibitors of RdRp
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
Site A (Thumb/fingertips)
Site B (Thumb)
Site C (Palm)
Site Actif
Site D (Palm)
AA
BB
CC
DD
EE
Hépatite C : Virus et Marqueurs

73. Caractéristiques des anti-NS5B
Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
DAA
PI 1st
generation
PI 2nd
generation
NS5A Inh. 1s
t
generation
NS5A Inh. 2nd
generation
NS5B
nucleos(t)ide
inh.
NS5B non
nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance
profile
Pangenotypi
c efficacy
Adverse
events
Drug-drug
interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs

74. Sofosbuvir Approved Nuc
VX-135 Partial clinical hold Nuc
Deleobuvir Phase 2 NNuc
BMS-791325 Phase 2 NNuc
TMC-647055 Phase 2 NNuc
Lomibuvir Phase 2 NNuc
GS-9669 Phase 2 NNuc
ABT-333 Phase 3 NNuc
ABT-072 Phase 2 NNuc
Setrobuvir Phase 2 NNuc
Inhibiteurs de NS5B
Pawlotsky et al., Seminars in Liver Disease, in press.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

75. 0
1
2
3
4
5
6
7
-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Days
HCVRNA(LogIU/mL)
TMA + + + + - - - - - - - - + +
LOQ
(20 IU/mL)
MK-0608 at 1mg.kg-1
orally
- 4,6 - 4,1
wt S282R/T/I wt S282
Activité Antivirale du MK-0608
Hépatite C : Virus et Marqueurs

76. Efficacité de la Combinaison Paritaprevir/r (ABT-
450/r), Ombitasvir (ABT-267) et Dasabuvir (ABT-
333) ±RBV
Population Treatment groups SVR12 rates (n/N)
PEARL-II
G1b
Treatment-exp.
AbbVie regimen+RBV 12 wks
AbbVie regimen 12 wks
97% (85/88)
100% (91/91)
PEARL-III
G1b
Treatment-naïve
AbbVie regimen+RBV 12 wks
AbbVie regimen 12 wks
99% (209/210)
99% (207/209)
PEARL-IV
G1a
Treatment-naïve
AbbVie regimen+RBV 12 wks
AbbVie regimen 12 wks
97% (97/100)
90% (185/205)
TURQUOISE-II
G1
Treatment-naïve &
-exp. with cirrhosis
AbbVie regimen+RBV 12 wks
AbbVie regimen 24 wks
92% (191/208)
96% (165/172)
SAPPHIRE-I
G1
Treatment-naïve
AbbVie regimen+RBV 12 wks 96% (455/473)
SAPPHIRE-II
G1
Treatment-exp.
AbbVie regimen+RBV 12 wks 96% (286/297)
Andreone et al., Gastroenterology 2014 May 9; Ferenci et al., N Engl J Med 2014 May 22;370(21):1983-92; Poordad et al., N Engl J
Med 2014;370(21):1973-82; Feld et al., N Engl J Med 2014;370(17):1594-603; Zeuzem et al., N Engl J Med 2014;370(17):1604-14.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

77. Efficacité du SOF-LDV (FDC) ±RBV
Population Treatment groups SVR12 rates (n/N)
ION-1
G1
Treatment-naive
SOF+LDV 12 wks
SOF+LDV+RBV 12 wks
SOF+LDV 24 wks
SOF+LDV+RBV 24 wks
99% (211/214)
97% (211/217)
98% (212/217)
99% (215/217)
ION-2
G1
Treatment experienced
SOF+LDV 12 wks
SOF+LDV+RBV 12 wks
SOF+LDV 24 wks
SOF+LDV+RBV 24 wks
94% (102/109)
96% (107/111)
99% (108/109)
99% (110/111)
ION-3
G1
Treatment-naive
SSOF+LDV 8 wks
SOF+LDV+RBV 8 wks
SOF+LDV 12 wks
94% (202/215)
93% (201/216)
95% (206/216)
Afdhal et al., N Engl J Med 2014;370(20):1889-98; Afdhal et al., N Engl J Med 2014;370(16):1483-93; Kowdley et al. N Engl J Med
2014;370(20):1879-88.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

78. V. CYCLE VIRAL

79. Cycle Viral
deLemos & Chung., Trends Mol Med 2014;20(6):315-21.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

80. HCV Entry
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

81. Réplication du VHC
• Mécanismes moléculaires encore mal
connus
• Localisation cytoplasmique au sein de
complexes de réplication (membranous
web)
– NS4B, NS5A, NS34A et NS5B (RdRp)
– Association étroite avec des facteurs cellulaires
Hépatite C : Virus et Marqueurs

82. "Membranous Web"
Paul et al., J Virol 2013;87(19):10612-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

83. Modèle de Réplication du VHC
• Selon modèle des virus à ARN ss polarité
positive (exemple du PV)
Ding., Nature Reviews Immunolog, 2010; 10: 632-644.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

84. Assemblage & Sécrétion du VHC
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

86. Hépatite C
Stratégie Diagnostique & Suivi
Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil

87. Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
Ag de capside (AgC)
ARN VHC
Génotype VHC
Profil de résistance
Marqueurs Virologiques
Stratégie diagnostique & suivi virologique

88. Tests Sérologiques
• Détection of des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème
génération
• Tests “Combo”
– Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC
• TROD (test rapide d’orientation diagnostique)
• Détection et quantification de l’antigène de capside
(AgC)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

89. Détection des Anticorps Anti-VHC
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Trousses commerciales
– Faciles à utiliser, automatisées
– A l’aide d’un test de 3ème
génération
. ADVIA Centaur (Siemens)
. VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic)
. AXSYM HCV 3.0 (Abbott)
. Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)
. INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics)
. Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

90. Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Trousses commerciales (2 trousues disponibles)
– Faciles à utiliser
– Non automatisées
– Diminution de la fenêtre sérologique d’environ
20-30 jours
– Moins sensibles que les tests de 3ème
génération
pour la détection des anticorps anti-VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique

91. Tests rapides Disposant d’un Marquage CE/IVD
ou OMS pour la Détection des Ab anti-VHC
Oraquick
®
HCV
Toyo®
HCV
Labmen®
HCV
Multisure
HCV
Signal
HCV v2.0
HCV
TriDot 4th
Manufacturer Orasure Turklab Turklab
MP
Diagnostics
Span
Diagnostics
J Mitra & Co
Specimen
type
oral fluid,
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
serum,
plasma
serum,
plasma
Volume
required (µL)
40 (oral fluid)
20
30 10 25 100
One drop
(35 µL)
Time to read
(min)
20 15 15 15 10 3
Stratégie diagnostique & suivi virologique

92. Tests rapides “en cours de Marquage CE/IVD“
pour la Détection des Ab anti-VHC
Assure®
HCV
First Response®
HCV
Manufacturer MP Diagnostics
Premier Medical
Corporation Ltd
Specimen type
whole blood,
serum, plasma
whole blood,
serum, plasma
Volume required (µL) 50 One drop (35 µL)
Time to read (min) 15 20
Stratégie diagnostique & suivi virologique

93. Performances des Tests rapides pour la
Détection des Ab anti-VHC
Spécificité Sensibilité VPP VPN
Sang total capillaire
OraQuick® HCV
Rapid Ab Test
100% 99,4% 100% 98,4%
TOYO® anti-HCV test 98,2% 96,2% 99,0% 93,1%
Labmen® HCV test 100% 62,7% 100% 49,6%
Liquide craviculaire
OraQuick® HCV
Rapid Ab Test
100% 98,2% 100% 96,6%
Chevaliez S, et al., article soumis.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

94. Performances des Tests rapides pour la
Détection des Ab anti-VHC
Spécificité Sensibilité VPP VPN
Sang total veineux
OraQuick® HCV
Rapid Ab Test
100 98,7 100 98,1
Assure® anti-HCV 100 94,9 100 93,0
First Response HCV 100 96,2 100 94,6
Multisure HCV 100 96,2 100 94,6
Chevaliez S, et al., unpublished results.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

95. Antigène de Capside : un Marqueur
de la Réplication
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel m2000 (LogIU/mL)
HCVcoreAglevel(Logfmol/L)
r=0.89;p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel CAP/CTM v2.0 (LogIU/mL)
HCVcoreAglevel(Logfmol/L)
r=0.88;p<0.0001
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

96. Antigène de Capside en Fonction des
Génotypes
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

97. Quantification de l’AgC à partir de Sang
Total Déposé sur DBS
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 2 4 6
0
2
4
6
Core antigen level in serum with
the Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)
CoreantigenlevelinwholebloodfromDBS
withtheArchitectHCVAgassay(Logfmol/L)
r=0.56; p<0.0001
0 1 2 3 4
0
1
2
3
4
Mean of HCV core antigen level in serum
and whole blood from DBS (Log fmol/L)
Diffrencebetweenserumand
wholebloodfromDBS(Logfmol/L)
2.46
1.66
3.26
0 2 4 6
0
2
4
6
Core antigen level in serum with
the Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)
CoreantigenlevelinwholebloodfromDBS
withtheArchitectHCVAgassay(Logfmol/L)
r=0.56; p<0.0001
0 1 2 3 4
0
1
2
3
4
Mean of HCV core antigen level in serum
and whole blood from DBS (Log fmol/L)
Diffrencebetweenserumand
wholebloodfromDBS(Logfmol/L)
2.46
1.66
3.26

98. Quantification de l’AgC à partir de Sang
Total Déposé sur DBS
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNA level in whole blood
from DBS with m2000 (Log IU/mL)
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
r=0.65; p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
HCV RNA level in whole blood
from DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)
r=0.66; p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNA level in whole blood
from DBS with m2000 (Log IU/mL)
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
r=0.65; p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
HCV RNA level in whole blood
from DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)
r=0.66; p<0.0001

99. Intérêts Cliniques de la Quantification de
l’AgC
• Diagnostic de l’infection
– Trousses commerciales
– Facile à utiliser, automatisé, peu coûteux (30% par
rapport à une charge virale VHC)
• Décision de traiter et suivi de l’efficacité des
traitements antiviraux
– Quantitatif
– Alternative aux techniques de détection-quantification
de l’ARN du VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique

100. Performances Analytiques de la Trousse
Architect (Abbott)
• Spécificité
– 99,2% à 100%
• Sensibilité
– 3 fmol/L (i.e ~ 500 to 3 000 UI/mL d’ARN VHC)
– Tous les génotypes (excepté génotype 2)
• Intervalle de quantification
– 3 à 20 000 fmol/L (≤ 7,8 Log10 UI/mL d’ARN VHC)
• Stable à 37°C pendant 96 heures
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8; Mederacke et al., J Clin Virol 2009, 46(3): 210-5; Miedouge et al., J Clin Virol 2010, 48(1):18-21.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

101. Trousse Architect : Monitorage des
Cinétiques Virales
RVR (G1b) RVS (G1b)
Rechuteur (G1b) Non-répondeur (G1a)
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8.
Core Ag
RNA
Stratégie diagnostique & suivi virologique

102. Performances de la Trousse Architect
chez Différentes Populations
Mederacke et al., J Clin Virol. 2012 Feb;53(2):110-5.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

103. Tests Moléculaires
Détermination
du Génotype
Quel est le génotype du VHC ?
Détection de la résistanceDétection de la résistance
Quel type de VHC est présent ?
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Tests Qualitatifs-Quantitatifs
Stratégie diagnostique & suivi virologique

104. - Identify active viral replication
- Make appropriate decisions
. Shorten or extend treatment duration
. Stop treatment due to futility
­ Identify treatment failure and the emergence
of resistance
. Virological failure is associated with selection of viral
variants with reduced susceptibility to DAAs
Clinical Utility of HCV RNA Assays
Stratégie diagnostique & suivi virologique

105. Requirements for HCV RNA Assays
• Real-time-based assays with
– A low lower limit of detection
– A broader range of linear quantification
– Identical lower limits of detection (LLOD) and
quantification (LLOQ)
• Satisfactory analytical performance, regardless
of the HCV genotype
Stratégie diagnostique & suivi virologique

106. 10 102
103
104
107
108
Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNA
Assay
Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)
CTM HCV test v2.0CTM HCV test v2.0
(Roche)(Roche)
RealTiRealTimme™ HCVe™ HCV
(Abbott)(Abbott)
Artus HCV QS-RGQArtus HCV QS-RGQ
(Qiagen)(Qiagen)
CAP/CTM HCV test,CAP/CTM HCV test,
v2.0 (Roche)v2.0 (Roche)
Versant HCV RNAVersant HCV RNA
1.0 (kPCR, Siemens)1.0 (kPCR, Siemens)
105
106
Chevaliez et al., Gastroenterology 2012;142(6):1303-1313.
Intervalles de Quantification
Stratégie diagnostique & suivi virologique

107. Quantification de l’ARN VHC (CTM v1.0)
Adapted from Chevaliez et al., Hepatology 2007;46(1): 22-31.
HCVRNAlevelinCAP/CTMv1.0(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA
(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and
bDNA (Log10IU/mL)
Differencebetween
CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.15
+0.48
+1.11
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 1 (n=29) Genotype 4 (n=30)
Genotype 6 (n=2)
Genotype 5 (n=9)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

108. Impact de Substitutions Nucléotidiques
sur la Quantification de l’ARN du VHC
Chevaliez et al., Hepatology 2009;50(5):1681.
WT G4 or WT G1
A165T or G145A
G145A+A165T
HCVRNAlevels(Log10IU/mL)
5.7
6.1
6.4
4.0
6.0
6.7
4.3
5.9
6.3
<1.2
6.0
6.6
0
2
4
6
8
CTM v1.0 m2000RT bDNA
Stratégie diagnostique & suivi virologique

109. Quantification de l’ARN VHC G4
(CAP/CTM v2.0)
HCVRNAlevelinCAP/CTMv2.0(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and
bDNA (Log10IU/mL)
Differencebetween
CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
+0.08
+0.35
+0.62
Genotype 4 (n=122)
Chevaliez et al., J Clin Microbiol 2013;51(4):1078-82.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

110. Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.
HCV RNA Quantification
(m2000, Abbott)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 1 (n=55) Genotype 4 (n=24)
Genotype 6 (n=3)
Genotype 5 (n=9)
876543
Mean of HCV RNA levels in m2000 and bDNA
(Log10IU/mL)
Differencebetween
m2000andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.06
+0.26
+0.58
HCVRNAlevelinm2000(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA
(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543
Stratégie diagnostique & suivi virologique

111. HCV RNA Level Assessment in the Era of DAA
• HCV RNA quantification should be regularly assessed
before, during and after treatment
• HCV RNA quantification should be based on a real-
time PCR (or TMA) assay
– With results expressed in IU/mL
– With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL
• In a given patient, HCV RNA level monitoring must
be performed with the same real-time assay
Stratégie diagnostique & suivi virologique

112. Europe or FDA Approval for HCV RNA
Quantification Tests
• Only 2 tests are approved by the FDA and in
Europe for HCV RNA quantification in clinical
practice
– m2000 since May 2011
– New version of CAP/CTM since March 2013
Stratégie diagnostique & suivi virologique

113. Monitorage de l’Efficacité des
Traitements avec DAA
Avant
traitement
Au cours du traitement Après
traitementFin de traitement
S2 S4 S10 S12 S24 S48 SVR12 SVR24
SOF/PR X X X
SMV/PR X X X Xa
Xa
DCV/PR X X X X
SANS IFNb
X X Xc
Xc
X X
a
Fin de traitement en fonction si en échec d’un traitement antérieur et si oui le type de réponse
b
SOF+RBV; SOF+SMV±RBV; SOF+DCV±RBV
c
S12 ou S24 : fin de traitement selon la combinaison thérapeutique utilisée
Stratégie diagnostique & suivi virologique

114. Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
4
1
5a
3
2
6
7a
Stratégie diagnostique & suivi virologique

115. Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

116. Arens et al., J Clin Virol 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype

117. Analyse Phylogénique après Séquençage
Direct
Région NS5B(286 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
5aSA13
2aHCJ6
Patient 49
6aEUHK2 3aNLZ1
Patient 62
4aED43
1hFrSSD98
1h98CM1357
1h98CM1521
1cHCG9
1cSR031
1cKhaja1
1aHCV1
1aHCVH
1aHCJ1
1jQC2
1jQC89
1kQC68
1kQC82
1eM4541N
1eCAM1078
1eQC172
1g1382
1g2152
1gEG024
1lM5186N
1l98CM1427
1l98CM1457
1fFR2
Patient 59
Patient 46
Patient 54
Patient 2
Patient 28
Patient 64
Patient 16
Patient 36
Patient 18
Patient 17
Patient 8
Patient 7
1bHCJ4
1bHCVBK
1bHCP01
Patient 40
1iFR16
1iQC77
1iQC181
Patient 48
Patient 60
Patient 52
Patient 26
1dFR17
1dHC1N16
1dBA107
1mGUI17
1mGUI11
1mGUI24
0.05
59
99
96
34
100
72
100
98
43
Génotype 2
Génotype 4
Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2
Génotype 5
Génotype 1, sous-type b
Génotype 3, sous-type a
Génotype 1, sous-type i
Génotype 1, sous-type ?
100
Stratégie diagnostique & suivi virologique

118. Versant®
HCV Genotype 2.0 Assay
(INNO-LiPA)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

119. Résumé
• Détermination du génotype (sous-type)
VHC
– La détermination du génotype sur la seule
région 5’NC doit être proscrite
– La 2nde
génération de Line Probe Assay qui utilise
des sondes dirigées contre la région core en
plus de la région 5’NC est la meilleure méthode
permettant de distinguer les sous-types 1a et
1b
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

120. Intérêt de la Détermination du Sous-Type
(1a vs 1b) ?
- Différence d’efficacité de la combinaison
thérapeutique
- Profils de résistance différents en cas d’échec
thérapeutique
- Influence sur la décision thérapeutique
Stratégie diagnostique & suivi virologique

121. Impact du Sous-Type sur la Barrière
Génétique à la Résistance aux IP
HCV-1a prototype ...PAGHAVGIFFRAAVCTRGVAKAVDFIP...
HCV-1b prototype ...-S------------------------V-...
HCV-1a AGAAAA (R155K)
AGAACA (R155T)
HCV-1b CGAAAA (R155K)
CGAACA (R155T)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

122. Résistance au SMV dans les Essais
• 1254 patients G1 inclus dans les phases 2b/3
(C206,C208, C216, HPC3007)
– 197/1254 (15,7%) étaient en échec
% patients with mutations at time
of failure not achieving SVR
Emerging mutations at time of failure
Overall 91 (180/197)
GT1a* with Q80K 93 (49/53) 84% (41/49) R155K
12% (6/49) D168E
4% (2/49) Other
GT1a* without
Q80K
97 (61/63) 41% (25/61) R155K
36% (22/61) R155K in combination with
mutations at 80, 122 and/or 168
23 (14/61) Other
GT1b 86 (70/81) 60% (42/70) D168V
17% (12/70) D168A, E, H, T, A/V or E/V
22% (16/70) Other
Stratégie diagnostique & suivi virologique

123. Impact du Sous-Type sur la Barrière
Génétique à la Résistance aux anti-NS5A
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Gao et al., Nature 2010 6;465(7294):96-100.

124. SMV plus PegIFN/RBV: QUEST-1 − 24-48
Weeks in Treatment-naïve G1 patients
SMV group
(n=261)
Placebo group
(n=130)
Week 4
<25 IU/mL (RVR) 202/254 (80%) 15/127 (12%)
<25 IU/mL 230/254 (91%) 25/127 (20%)
SVR12 210/264 (80%) 65/130 (50%)
Breakthrough 24 (9%) 44 (34%)
Relapse 21/234 (9%) 18/84 (21%)
41%
With Q80K
60/146
59%
Without Q80K
At baseline
86/146 SVR12
31/60
Jacobson et al., Lancet 2014;384(9941):403-13.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

125. Impact du Polymorphisme Q80K sur la
Réponse au SMV plus SOF ± Ribavirin
Cohorte 1 : répondeurs nuls à la
bithérapie pégylée F0-F2 (N=74)
Cohorte 2 : naïfs de traitement et répondeurs nuls
à la bithérapie pégylée F3-F4 (N=40)
Lawitz et al., Lancet 2014;384(9956):1756-65.
24/27 31/31 17/17 25/26 38/40 18/18
Stratégie diagnostique & suivi virologique

126. Le Génotype du VHC Détermine l’Approche
du Traitement VHC
• Siméprevir uniquement chez les patients de
génotypes 1 et 4
– Excepté les patients de génotype 1a avec la mutation Q80K
• Importance de la ribavirine chez les patients non
cirrhotiques de génotype 1a avec la combinaison
“3D“ Abbvie
Stratégie diagnostique & suivi virologique

127. Intérêt de la Détermination des Profils de
Résistance ?
• Pas d’intérêt à la détermination
systématique avant traitement des
patients naïfs de traitement et en échec
d’un traitement par bithérapie pégylée car
taux de RVS élevés
• Pas d’intérêt à la détermination au
moment de l’échec car la plupart des
patients abritent des variants résistants
Hépatite C : Résistance au traitement

128. Intérêt de la Détermination des Profils de
Résistance ?
• Intérêt à la détermination chez les
patients en échec d’un traitement
contenant un ou plusieurs DAA avant
retraitement
– Importance des études observationnelles
longitudinales
Hépatite C : Résistance au traitement