1. VIRUS DE L’HEPATITE C
& Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
Des Hépatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris XII
Créteil

2. Virus de l’Hépatite C
I. Aspects Virologiques

3. Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.

4. • Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
Virus de l’Hépatite C
Bartenschalger et al., 2004.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

5. Organisation Structurale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

6. Organisation Structurale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

7. Organisation Structurale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

8. Organisation Génomique
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

9. Régions 5’ et 3’NC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

10. Site d’Entrée Interne du Ribosome
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

11. From Department of Structural Biology, Stanford University Medical School, USA
Site d’Entrée Interne du Ribosome
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

12. Organisation Génomique
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

13. STÉATOSE
ROS
FIBROSE
Activation des cellules étoilées
Insulino-
Résistance
Cytokines (TNF, TGF, IL-8, FasL)
Produits de la peroxydation lipidique
Cytokines
NF-kB
TNF
Nécro
Inflammation
Cytokines
TGF
Cytokines
Réponse
immunitaire
TGF
Capside
TNF
Génotype 3
Capside
NS5A
Adapted from Asselah et al., 2006
Protéine de Capside & Pathogenèse
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

14. Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC génotype 1b

15. xy
z
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.

16. Glycoprotéines E1-E2
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

17. Glycoprotéines d’Enveloppe
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Heijne et al., Nature Reviews Molecular cell Biology, 2006; 7: 909-918

18. Région HVR1 (27 amino-acides)
 80% de divergence nucléotidique entre génotypes
 Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.
Région HVR1
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

19. Protéine Non-structurale 3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

20. 1 631189
Sérine protéase Hélicase/NTPase
Protéine NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

21. Sérine protéase
• Modulateur de la réponse interféron type I via les
Toll-Like receptor (TLR3)
Hélicase/NTPase
Protéine NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1 631189

22. Bode et al., 2007; Archives of Biochemistry and Biophysics, 462: 6254-265
Production d’IFN- en Réponse à
une Infection Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

23. Bode et al., 2007; Archives of Biochemistry and Biophysics, 462: 6254-265
1. Clivage de TRIF 2. Clivage de CARDIF
Inhibition de la Phosphorylation
d’IRF3 par NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

24. Sérine protéase
• Modulateur de la réponse interféron type I via les
Toll-Like receptor (TLR3)
• Cible de molécules antivirales
 VX-950 (Telaprevir®, Vertex)
 SCH503034 (Boceprevir®, Schering-Plough)
 ITMN 191 (Intermune)
Hélicase/NTPase
Protéine NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1 631189

25. OPM Database, University of Michigan, College of Pharmacy.
Site actif
(His57, Asp81, Ser139)

26. Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN 191

27. Protéine NS4B
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

28. Complexe de Réplication
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.

29. ARN Polymérase ARN-dépendante
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881

30. Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold
Des 1999, 7: 1417-1426.
Polymérase Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

31. Réplication
– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN monocaténaire
de polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Réplication Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

32. Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
A
NNI site A (Thumb/fingertips)
Indoles
Benzimidazoles
NNI site B (Thumb)
Phe derivatives
Thiophene-COOH
Dihydroxypirones
Pyranoindoles
B
NNI site C (Palm)
Benzothiadiazine
Acyl-pyrrolidine
Proline sulfonamide
Acrylic acid derivatives
Active Site
Allosteric GTP
C
2’-methyl nucleosides
4’ azido-cytidine
NNI site D (R200 hinge)
Benzofurans
A
B
C
D
Cibles des Molécules Antivirales
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

33. Cycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

34. Cycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

35. Modèle d’Entrée Virale
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

36. Cycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

37. Maturation de la Polyprotéine
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

38. Structure des Protéines NS
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

39. Cycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

40. Complexes de Réplication
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

41. Cycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

42. Virus de l’Hépatite C
II. Modèles d’Etude

43. Souris transgéniques
Souris SCID/uPA
Modèles Animaux
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

44. Visualisation des cellules
Huh7 infectées
3 - Vecteur de transfert de la GFP
2 - Expression des glycoprotéines E1E2 du VHC
1 - Expression de Gag-Pol de MLV
Co-transfection
des cellules 293 T
Production de
ppVHC infectieuses
Infection in vitro
des cellules Huh7
Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

45. A
B
Adapted from Nature Review Drug Discovery, 2002; 1:911-916
Réplicons Subgénomiques
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

46. Adapted from www.molecular-virology.uni-hd.de
Système Productif (HCVcc)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

47. Virus de l’Hépatite C
III. Variabilité Génétique

48. Virus de l’hépatite C
Production virale (/24 heures) 1012
T1/2 virus libre (heures) 2 - 3
T1/2 brin ARN (heures) ~10
Taux de mutation Très élevé
Mutants d’échappement au SI Fréquent
Cellules cibles
Taille du compartiment Probablement grande
Soriano et al., J Antimicro Chemother 2008, 62: 1-4
Dynamique Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

49. • Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
. 10-4
-10-4
mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées
– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’5’
("proofreading")
– Accumulation de mutations
• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces
ARN Polymérase ARN-dépendante
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

50. Simmonds et al. Hepatology 2005.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Diversification des Génotypes

51. 7
Central
Africa
Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
Diversification des Génotypes
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

52. • Facteur prédictif de la réponse au
traitement
• Conditionne
– La dose de ribavirine (800 - 1400 mg)
– La durée de traitement (16 - 72 semaines)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Génotypes

53. Weiner et al., Virology 1991; 180:842-848; Martell et al., J Virol 1992;66:3225-36.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèce

54. • Dérive génétique
– Accumulation de mutations ponctuelles
• Glissement génétique
– Suite à la modification brutale de l’environnement
réplicatif
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Mécanismes d’Evolution de la
Quasi-espèce

55. • Joue un rôle dans le maintien de
l’infection chronique
• Joue un rôle dans l’échec des
traitements antiviraux
• Joue un rôle dans la sévérité de la
maladie
Farci P, 2000; Science, 288: 339-344; Lavillette D, 2005; Journal of Virology, 79(10): 6023-6034; Farci P, 2002; PNAS, 99: 3081-3086;
Chambers TJ et al., 2005; 79: 3071-3083; Sullivan et al., JID 2007, 196: 239-248.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèce

56. Virus de l’Hépatite C
IV. Exemples d’Application
de la Variabilité Génétique

57. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

58. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

59. 7
Central
Africa
Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
Diversification des Génotypes
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

60. Génotype & Mode de Transmission
52% 54%
63%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
UDVI Transfusion Autres
3
1b
1a
Autres
Pawlotsky et al., J Infect Dis, 1995; 171(6): 1607-10.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

61. 27%
39%
36%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
UDVI Transfusion Autres
4
3
2
1b
1a
1nt
Payan et al., J Viral Hepat 2005;12: 405-13.
Génotype & Mode de Transmission
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

62. Génotype 3a
Chez les UDVI
0.1 substitution per site
JK049
TrKj
NE125
NE048
HCV-3a
HCV-3f
HCV-3c
HCV-3b
HCV-3k
Australie
USA, Côte Ouest
Argentine
Brézil
France
USA, Côte Est
75
72
83
79
100
92
60
62
81
63
98
98
99
62
52
71
95
56
Morice et al., J Med Virol 2006;78:1296-1303.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

63. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

64. • Mise en évidence d’une séroconversion VHC lors du
dépistage et du suivi des patients hémodialysés en
juillet 2005, à l’hôpital Henri Mondor
• L’ensemble des patients hémodialysés ont été testés
(anticorps anti-VHC et ARN viral)
– Mise en évidence d’un 2nd cas au cours de la même période
• Analyses génétique et phylogénique
• Recherche du VHC dans l’environnement
– Supports et surfaces inertes
Transmission Nosocomiale
"Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

65.  Identification de deux cas de
séroconversion en 2004 au sein de l’unité
d’hémodialyse de l’hôpital Henri Mondor :
– Patient "1" infecté par un génotype 3a
– Patient "2" infecté par un génotype 1
Transmission Nosocomiale
"Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

66. 1h_FrSSD98
1h_98CM1521
1h_98CM1357
1f_FR2
1i_FR16
1i_QC77
1iQC181
1m_GUI17
1m_GUI11
1m_GUI24
1d_HC1N16
1d_BA107
1d_FR17
Patient 8
1b_HCJ4
Patient 7
Patient 6
Patient 5
Patient 4
1b_HCP01
1b_HCVBK
1c_HCG9
1c_SR031
1c_Khaja1
1l_M5186N
1l_98CM1427
1l_98CM1457
1e_M4541N
1e_CAM1078
1e_QC172
1g_1382
1g_2152
1g_EG024
1a_HCV1
1a_HCVH
1a_HCJ1
1j_QC2
1j_QC89
1k_QC68
1k_QC82
Patient 3
Patient 2*
Patient 2**
2a_HCJ6
5a_SA13
6a_EUHK2
Patient 1
3a_NLZ1
4a_ED43
0.05
Genotype 4
Genotype 3
Genotype 6
Genotype 5
Genotype 2
Genotype 1
100
100
100
Patients VHC chronique
Séroconversion VHC
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
G1
Analyse
Phylogénique
Région NS5B (329 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

67. 6a_33
2b_JFH1
Patient 1 (7/04)
5a_SA13
1b_HVR3812
S5 (7/05)
Patient 3 (7/05)
Patient 3 (9/05)
Patient 2 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 3 (7/04)
S4 (6/05)
S3 (6/05)
S2 (6/05)
Patient 3 (01/05)
S1 (6/05)
1a_HCT27X5
2a_Q2B
3a_CB
1a_HCT18X5
Patient 6
1b_AWV2C33
Patient 8
Patient 4
Patient 7
4a_ED43
0.2
100
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chronique
Séroconversion VHC
Analyse Phylogénique
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

68. 6a_33
2b_JFH1
Patient 1 (7/04)
5a_SA13
1b_HVR3812
S5 (7/05)
Patient 3 (7/05)
Patient 3 (9/05)
Patient 2 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 3 (7/04)
S4 (6/05)
S3 (6/05)
S2 (6/05)
Patient 3 (01/05)
S1 (6/05)
1a_HCT27X5
2a_Q2B
3a_CB
1a_HCT18X5
Patient 6
1b_AWV2C33
Patient 8
Patient 4
Patient 7
4a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chronique
Séroconversion VHC
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
Analyse Phylogénique
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

69. • Screening de 64 patients hémodialysés à l’hôpital
Hubert Kutuku Maga, Cotonou, Bénin (Afrique)
– Détection anticorps anti-VHC
– Détection ARN VHC (limite détection <50UI/mL)
• Etude génétique et phylogénique de deux régions
distinctes du génome viral
– NS5B
– Core-E1
Transmission Nosocomiale au
Bénin
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

70. Analyse Phylogénique
5aSA13
2aHCJ6
Patient 49
6aEUHK2 3aNLZ1
Patient 62
4aED43
1hFrSSD98
1h98CM1357
1h98CM1521
1cHCG9
1cSR031
1cKhaja1
1aHCV1
1aHCVH
1aHCJ1
1jQC2
1jQC89
1kQC68
1kQC82
1eM4541N
1eCAM1078
1eQC172
1g1382
1g2152
1gEG024
1lM5186N
1l98CM1427
1l98CM1457
1fFR2
Patient 59
Patient 46
Patient 54
Patient 2
Patient 28
Patient 64
Patient 16
Patient 36
Patient 18
Patient 17
Patient 8
Patient 7
1bHCJ4
1bHCVBK
1bHCP01
Patient 40
1iFR16
1iQC77
1iQC181
Patient 48
Patient 60
Patient 52
Patient 26
1dFR17
1dHC1N16
1dBA107
1mGUI17
1mGUI11
1mGUI24
0.05
59
99
96
34
100
72
100
98
43
Région NS5B (286 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
Génotype 2
Génotype 4
Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2
Génotype 5
Génotype 1, sous-type b
Génotype 3, sous-type a
Génotype 1, sous-type i
Génotype 1, sous-type ?
100
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

71. Transmissions Nosocomiales
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
NJPlot
2aQ2B
3aCB
2bJFH1
1aHCT18X5
6a33
4aED43
1aHCT27X5
Patient 7
Patient 8
Patient 16
Patient 18
Patient 17
Patient 2
Patient 28
Patient 64
Patient 54
Patient 46
5aSA13
Patient 59
Patient 52
Patient 48
Patient 60
1bAWV2C33
1bHVR3812
0.2
Patient 26
Patient 40
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

72. MAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire d’un Nouveau
Sous-type : Etude de la région NS5B
Patient 16
Patient 18
Patient 17
Patient 8
Patient 7
Patient 64
Patient 46
1f_L38350
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1i_AY434119
1h_AY434131
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
0.05
PARCIMONIE
Patient 16
Patient 18
Patient 17
Patient 7
Patient 8
Patient 64
Patient 46
1f_L38350
1h_AY434131
1i_AY434119
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

73. MAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire d’un Nouveau
Sous-type : Etude de la région Core-E1
PARCIMONIE
Patient 7
Patient 64
Patient 46
Patient 18
Patient 16
Patient 17
Patient 8
1h_AY434132
1h_AY257087
1d_L38377
1i_AY434120
1i_L48495
1b_M58335
1b_L38372
1b_D90208
1f_L38371
1l_AY257091
1l_AY257083
1c_AY051292
1c_D14853
1g_AF271797
1g_AF271798
1e_AY894553
1e_L38361
1k_AY434123
1k_AY434113
1j_AY434129
1j_AY434106
1a_M67463
1a_M62321
0.02 Patient 64
Patient 46
Patient 18
Patient 16
Patient 17
Patient 7
Patient 8
1d_L38377
1i_AY434120
1i_L48495
1b_D90208
1b_L38372
1b_M58335
1l_AY257091
1l_AY257083
1c_AY051292
1c_D14853
1g_AF271797
1g_AF271798
1e_AY894553
1e_L38361
1k_AY434123
1k_AY434113
1j_AY434129
1j_AY434106
1a_M67463
1a_M62321
1f_L38371
1h_AY434132
1h_AY257087
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

74. • Epidémie à VHC au sein d’une unité d’hémodialyse en
Grèce ("Papageorgiou General Hospital", Thessaloniki)
• 17 patients hémodialysés contaminés en quelques
mois
• Analyses génétique et phylogénique
• Etude de la réponse neutralisante
– Système HCVpp
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Transmission Nosocomiale en Grèce
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

75. 0,1 substitution per site
HCV-1
HCV-H
SR052
HC-G9
SR037
HC-J4
HCV-BK
BE90
Pt-11
Pt-10
Pt-9
Pt-5
Pt-12
Pt-13
Pt-15
Pt-16
Pt-2
Pt-4
Pt-3
Pt-1
Pt-17
Pt-7
Pt-6
Pt-8
1b
HCV-1
1a
1c
Souche B
Souche A
Analyse Phylogénique
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
NJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

76. Incubation HCVpp avec
des dilutions de sérum
Détermination de
l’infectivité (bruit de fond)
Détermination de l’activité
neutralisante du sérum
Infection de
cellules Huh7
Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

77. Patient-10 (souche B)
ARN VHC
(UI/mL)
Semaines
% neutralisation
infection
Huh7
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation
• Absence de réponse neutralisante et absence de
contrôle de l’infection
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Réponse Neutralisante - Groupe 1
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

78. • Réponse neutralisante forte et spécifique
• Réponse neutralisante inversement proportionnelle
à la cinétique de la charge virale
Patient-1 (souche A)
% neutralisation
infection
Huh7
Réponse Neutralisante - Groupe 2
ARN VHC
(UI/mL)
Semaines
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

79. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

80. Histoire Naturelle
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique
50 - 85%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation
6 - 10%
HCC
4 - 5% par an
Mortalité
10-30ans
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

81. Histoire Naturelle
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique
50 - 85%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation
6 - 10%
HCC
4 - 5% par an
Mortalité
10-30ans
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

82. Persistance Virale
• Persistance virale
– Echec de la réponse immune, pourtant
présente et adaptée, à éliminer le virus ou les
cellules qui l’abritent
• Interface complexe
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

83. Processus Multi-étape
Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique
50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

84. Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique
50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale ?
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Processus Multi-étape
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

85. Adapted from Ferrari C, Gasroenterology 2007; 132(2): 801-805
Persistance du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

86. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

87. Roque-Afonso et al., J Virol 2005;79:6349-57)
Région 5’NC Région E1-E2
Compartimentation Plasma-PBMC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

88. • Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

90. HEPATITE C : Stratégie
Diagnostique & Suivi
Virologique

91. Virus de l’Hépatite C
I. Cinétique des Marqueurs
Virologiques

92. Marqueurs Virologiques
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
ARN VHC
Génotype VHC

93. Cinétique des Marqueurs
ARN VHC
Symptômes +/-
Temps après contage (mois)
Titre
Anti-VHC
ALAT
Normal
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Infection Aiguë
Stratégie diagnostique & suivi virologique

94. Cinétique des Marqueurs
ARN VHC
Symptômes +/-
Temps après contage (mois)
Titre
Anti-VHC
ALAT
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Infection Chronique
Normal
Stratégie diagnostique & suivi virologique

95. Virus de l’Hépatite C
II. Tests Virologiques

96. Tests Virologiques Moléculaires
Tests quantitatifs
Seuil de détection ≥ qualitatifs
Quelle quantité est présente ?
Tests qualitatifs
Très sensibles
( 50 IU/mL)
Est-ce que le VHC est présent ?
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination
du Génotype
Quel type de VHC est présent ?

97. Tests Virologiques Moléculaires
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Détermination
du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
Tests Quanti-Qualitatifs

98. Détection-Quantification de
l’ARN VHC

99. Intérêts de la Détection -
Quantification de l’ARN VHC
• Evaluation de la réplication virale chez des
patients anticorps anti-VHC positifs
• Evaluation de la réponse virologique au
cours du traitement pegIFN - RBV
– Réponse virologique rapide (semaine 4)
– Réponse virologique précoce (semaine 12)
– Réponse fin de traitement (EOT)
– Réponse virologique soutenue (semaine 24 post-Rx)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

100. Techniques Disponibles
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique

101. Principe des Techniques
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique

102. bDNA : Principe
ARN VHC
Capture Probe
Capture Extender
Label extender
Preamplifier
Amplifier with hybridized
label probe
Adapted from Siemens
Stratégie diagnostique & suivi virologique

103. bDNA : Forces & Faiblesses
• Forces
– Quantification indépendante du génotype
– Tolérance de polymorphismes nucléotidiques
– Faible volume de prise d’essai
– Large intervalle de quantification linéaire
. ≥ 6.90 Log10 UI/mL
• Faiblesses
– Faible sensibilité
. LLOD: 2.80 Log10 UI/mL
– Faux positifs dans les faibles valeurs
– Méthode semi-automatisée (Siemens system 340 analyzer)
– 12 contrôles par run
Stratégie diagnostique & suivi virologique

104. Principe des Techniques
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique

105. PCR : Principe
VHC ARN ADNc Amplicons
(ADNdb)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

106. Avantages Techniques de la PCR
en temps réel
• Diminution du risque de contamination
• Amélioration de la sensibilité
• Augmentation de l’intervalle de
quantification linéaire
• Amélioration précision et reproductibilité
• Augmentation de débit à travers
l’automatisation
• Diminution des coûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique

107. 10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNA
Assay
Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)
Intervalle de Quantification
Stratégie diagnostique & suivi virologique

108. 10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNA
Assay
Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)
TaqMan 48 HCV
(Roche)
HCV Quant ASR
(Abbott)
Versant HCV RNA
1.0 (kPCR, Siemens)*
*en développement
Intervalle de Quantification
Stratégie diagnostique & suivi virologique

109. • Diminution du risque de contamination
• Amélioration de la sensibilité
• Augmentation de l’intervalle de
quantification linéaire
• Amélioration précision et reproductibilité
• Augmentation de débit à travers
l’automatisation
• Diminution des coûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Techniques de la PCR
en temps réel

110. Plates-formes
CAP-CTM96 (ROCHE)
kPCR (SIEMENS)
m2000SP-m2000RT (ABBOTT)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

111. • Remplace les techniques qualitatives de
détection de l’ARN VHC
• Quantifie l’ensemble des charges virales
observées en pratique clinique
– Faibles charges virales au cours du traitement
• Surveille efficacement les cinétiques
virales (évaluation précoce des réponses
virologiques au traitement)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Cliniques de la PCR
en temps réel

112. Quantification de l’ARN du VHC
CAP-CTM48 (Roche) versus bDNA 3.0 (Siemens)
DifferencebetweenHBVDNAlevelsmeasuredin
CAP/CTMandinbDNA(inLog10IU/mL)
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
Mean of HCV RNA levels measured in CAP/CTM and bDNA
(in Log10 UI/mL)
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.
Mean
difference
+ 1.96 mean
difference
- 1.96 mean
difference
Stratégie diagnostique & suivi virologique

113. Différences de Quantification
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
15%
30%
DifferencebetweenHCVRNAlevelsmeasuredin
CAP/CTMandinbDNA(inLog10UI/mL)
CAP-CTM48 (Roche) versus bDNA 3.0 (Siemens)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

114. Chevaliez et al., manuscript in preparation.
m2000SP-m2000RT (Abbott) versus bDNA 3.0 (Siemens)
Mean of HCV RNA levels measured in m2000SP/m2000RT and
bDNA (in Log10IU/mL)
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
DifferencebetweenHCVRNAlevelsmeasuredin
m2000SP/m2000RTandinbDNA(inLog10IUI/mL)
Mean
difference
+ 1.96 mean
difference
- 1.96 mean
difference
Genotype 1 (n=55)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=24)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=3)
Quantification de l’ARN du VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique

115. David Sherman., Molecular Symposium, September 2007 (source: Siemens Medical Solutions Diagnostics).
kPCR HCV 1.0 (Siemens) versus bDNA 3.0 (Siemens)
132 clinical samples
Quantification de l’ARN du VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique

116. Détermination du Génotype

117. Génotypes du VHC
Simmonds et al. Hepatology 2005; Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
7
Central
Africa
Stratégie diagnostique & suivi virologique

118. Intérêts de la Détermination du
Génotype
• Détermination systématique du
génotype
– Facteur prédictif de la réponse au
traitement
– Conditionne
• La dose de ribavirine
• La durée du traitement (24 vs 48 semaines)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

119. Détermination du Génotype
• Détermination moléculaire du génotype
VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du génotype
VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

120. Détermination du Génotype
• Détermination moléculaire du génotype
VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du génotype
VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

121. Cibles pour le Génotypage
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Stratégie diagnostique & suivi virologique

122. Cibles pour le Génotypage
NS4A
NS4B
p7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Stratégie diagnostique & suivi virologique

123. Méthodes de Génotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification1
• Restriction fragment length polymorphism analysis
(RFLP)2
• Hybridation inverse des produits d’amplification sur
support solide : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)3
• Autres méthodes :
– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)4
– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage5
1Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29.; 2Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; 4Lareu et al., 1997; 3Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15
Stratégie diagnostique & suivi virologique

124. Méthodes de Génotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification1
• Restriction fragment length polymorphism analysis
(RFLP)2
• Hybridation inverse des produits d’amplification sur
support solide : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)3
• Autres méthodes :
– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)4
– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage5
1Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29.; 2Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; 4Lareu et al., 1997; 3Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15
Stratégie diagnostique & suivi virologique

125. Versant® HCV Genotype 2.0 Assay
3
17
15
20
21
23. AC
Marker
CC
AC
4
5
10
12
24. 6 c-l
16
2b 3a 4b 6a1b 6c-l1a
6
7
8
9
11
13
14
18
19
25. 1a
25. 1b
5’UTR
Same bands
as the 1.0 version
Core region
Stratégie diagnostique & suivi virologique

126. Importance de la Région Virale pour la
Détermination du Sous-type
Analyse
phylogénique
de la région
5’NC
1ère
génération
de Line
probe assay
(LiPA1.0)
2ème
génération
de Line
probe assay
(LiPA2.0)
PCR en
temps réel
1a (n=233) 80,3%
(n=187)
73,0%
(n=170)
98,3%
(n=229)
94,4%
(n=220)
1b (n=253) 94,1%
(n=238)
91,7%
(n=232)
98,0%
(n=248)
93,3%
(n=236)
Chevaliez et al., EASL 2009.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

127. Virus de l’Hépatite C
III. Diagnostic Virologique

128. Diagnostic de l’Infection Aiguë
Ac anti-HCV
-
-
+
+
ARN VHC*
-
+
-
+
* Technique sensible seuil de détection ≤ 50 IU/ml
Diagnostic
Absence d’infection aiguë
Infection aiguë C
Probablement pas d’infection
aiguë
Difficile de conclure
Stratégie diagnostique & suivi virologique

129. Diagnostic de l’Infection Chronique
• Détection des anticorps anti-VHC totaux
par ELISA
• Recherche d’ARN du VHC par un test
sensible*
• Détection d’ARN du VHC* si le test ELISA (-
) chez des patients hémodialysés ou
immunodéprimés
* Technique sensible seuil de détection ≤ 50 IU/ml
Stratégie diagnostique & suivi virologique

130. Virus de l’Hépatite C
III. Prise en Charge
Thérapeutique

131. Intérêts des Tests Virologiques
en Thérapeutique
Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20
• Décision de traiter
• Optimisation du schéma
thérapeutique
• Etude de la réponse virologique au
traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique

132. Classification des Patients
Type
1
Types
2, 3
Types
4, 5, 6
Génotypes VHC
Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20
Stratégie diagnostique & suivi virologique

133. Indications Actuelles du Traitement
• Patients infectés par un VHC de génotype 1
– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)
– Durée : 48 semaines
• Patients infectés par un VHC de génotype 2/3
– Interferon pégylé plus ribavirine (800 mg/j)
– Durée : 24 semaines
• Patients infectés par une VHC de génotype 4, 5 et 6
– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)
– Durée : 48 semaines
Stratégie diagnostique & suivi virologique

134. Génotype VHC
VHC-1 (4,5,6)
Quantification ARN
VHC-2,3
Bithérapie
24 semaines
Ribavirine 800 mg
Bithérapie
48 semaines
Ribavirine 1000-1400 mg
Quantification ARN à S12
Diminution < 2 Log Diminution  2 Log
ARN VHC +
Arrêt traitement
poursuite avec
IFN pégylé pour
ralentir la
progression de la
maladie
hépatique
Poursuite jusqu’à
S24
Si ARN VHC -
Poursuite jusqu’à
S48
diminution  2 Log
ARN VHC -
Poursuite jusqu’à
S48

135. Optimisation du Traitement en
Fonction de la Réponse Virologique
• Outils virologiques sensibles
– Sensibilité : 10-15 UI/mL
– Evaluation de la réponse au traitement
• Répondeurs virologiques rapides
– Raccourcissement de la durée de traitement
• Répondeurs virologiques précoces partiels
– Allongement de la durée de traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique

136. Raccourcissement de la
Durée de Traitement

137. RVR facteur prédictif de la RVS
Fried et al., EASL 2008, Journal of Hepatology, 48(Suppl.2): S5
N= 1383 (Analyse rétrospective)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

138. Importance de la RVR
• Analyse rétrospective de patients infectés par un VHC de génotype 1
traités pendant 48 semaines par pegIFN alfa-2a + RBV (N = 453)
ARN VHC
Positif
À S24
4 12 24
Semaine ARN négatif
91
66
45
2
Ferenci P, et al. J Hepatol. 2005;43:425-433.
20
40
60
80
100
RVS(%)
0
Stratégie diagnostique & suivi virologique

139. Traitement Court : Génotype 1
• Patients par un VHC de génotype 1
– ARN VHC < 600,000 IU/ml
– PegIFN-2b + ribavirine
– 24 semaines de traitement
– Comparaison des données obtenus avec les
résultats de l’étude pivot (Mann et al., Lancet
2001)
Zeuzem et al., J Hepatol 2006;44:97-103.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

140. Traitement Court : Génotype 1
Zeuzem et al., J Hepatol 2006;44:97-103.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Week 4 Week 12 Week 24
24 weeks
48 weeks
(Mann et al.,
2001)
Time to first negative HCV RNA (< 50 IU/ml)
%SVR
Stratégie diagnostique & suivi virologique

141. Jensen et al., Hepatology 2006;43:954-960
Traitement court : Génotype 1
0
20
40
60
80
100
%deRVS
Peg-IFN alpha 2a 180 µg/semaine + RBV 800 ou 1000-1200 mg/j
ARN VHC > 50 UI/mL à S4
24-DF
24-DS
48-DF
48-DS
73%
89% 88% 91%
ARN VHC < 50 UI/mL à S4
44%
23%
35%
16%
Stratégie diagnostique & suivi virologique

142. Shiffman et al., EASL 2006.
Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
%RVS
p=<0.0001 p=0.1565
65%
82%
65%
71%

143. Rapid virological response
HCV RNA < 50 IU/ml at week 4
No rapid virological response
HCV RNA ≥ 50 IU/ml at week 4
Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shiffman et al., EASL 2006.
82%
90%
27%
49%
SVR rate SVR rate

144. 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
14 weeks
24 weeks
%Sustainedvirologicalresponse
Dalgard et al., Hepatology 2008;47:35-42
RVR (HCV RNA < 50 IU/ml at week 4)
93%
84%
Genotype 2 Genotype 3
92%
97%
Traitement court : Génotypes 2/3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
PegIFN-2b

145. 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
12 weeks
24 weeks
%Sustainedvirologicalresponse
(Lagging et al., Hepatology 2008;47:1837-45)
71%
91%
RVR
62%
41%
n = 120n = 111 n = 68n = 71
No RVR
PegIFN-2a
Traitement court : Génotypes 2/3
Stratégie diagnostique & suivi virologique

146. • Durée de traitement de 6 mois chez tous les
patients avec une RVR indépendamment du
génotype
• Raccourcissement de la durée de traitement
à 12 ou 16 semaines chez les patients
infectés par une génotype 2/3 avec un ARN
indétectable à S1 ou S2 (?)
Résumé
Stratégie diagnostique & suivi virologique

147. Allongement de la Durée de
Traitement

148. Traitement Long : Génotypes 2/3
• Older age
• Male gender
• High BMI
• Fibrosis ≥ F3
Stratégie diagnostique & suivi virologique

149. Génotype 1 : Traitement Long
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
48 weeks
(n=230)
72 weeks
(n=225)
53% 54%
%SVR
Berg et al., Gastroenterology 2006;130:1086-97
Stratégie diagnostique & suivi virologique

150. 0
20
40
60
80
100
%deRVP
NS NS
NS
p=0.04
S 4 S 12 S 4 S 12
ARN VHC < 50 UI/ml ARN VHC ≥ 50 UI/ml
Berg et al., Gastroenterology 2006;130:1086-97
48 semaines
72 semaines
Génotype 1 : Traitement Long
Stratégie diagnostique & suivi virologique

151. Résumé
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Allongement de la durée de traitement à
72 semaines améliore la RVS :
– Chez les patients avec une RVP partielle
– Chez les non-répondeurs à un premier
traitement par une bi-thétrapie standard qui
sont retraités

153. HEPATITE C : Résistance
aux Traitements

154. • Définition
– Propriétés intrinsèques des souches
virales qui s’opposent à l’action antivirale
des effecteurs ou à des médicaments
antiviraux
Résistance aux traitements
Résistance Virale

155. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC

156. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC

157. PEG-IFN- 2a + ribavirine
(Fried et al., 2002)
PEG-IFN- 2b + ribavirine
(Manns et al., 2001)
Manns et al., Lancet 2001;358:958-65 ; Fried et al., N Engl J Med 2002;347:975-82; Hadziyannis et al., Ann Intern Med 2004;140:346-55.
PEG-IFN- 2a + ribavirine
(Hadziyannis et al., 2004)
54%
24%
58%
48%
18%16%
Résistance aux traitements
Taux d’Echecs

158. Facteurs
Viraux
Caractéristiques
de la maladie
Facteurs
d’Hôte
Traitement
ECHECS DU TRAITEMENT

159. Cinétique Virale sous Traitement
2nde phase
7 14 T(n)
Cutoff
1ère phase
1
0 1 2 3
2
3
4
5
6
7
Jours
Neumann et al., Science 1998;282:103-7.
Résistance aux traitements

160. 0
1
2
3
4
5
6
7
0 4 7 8 15 22 291-7-28
Cut-off tests qualitatifs
Cut-off tests quantitatifs
Génotype 4
Génotype 1
Génotype 3
ARNduVHC(Log10UI/mL)
Jours
7
Résistance Intrinsèque
Résistance aux traitements
Pawlotsky et al., manuscript en preparation.

161. 0
1
2
3
4
5
6
7
0 4 7 8 15 22 291-7-28
Cut-off tests qualitatifs
Cut-off tests quantitatifs
Génotype 4
Génotype 1
Génotype 3
ARNduVHC(Log10UI/mL)
Jours
7
Résistance Intrinsèque
Résistance aux traitements
Pawlotsky et al., manuscript en preparation.

162. 0
1
2
3
4
5
6
7
0 4 7 8 15 22 291-7-28
Cut-off tests qualitatifs
Cut-off tests quantitatifs
Génotype 4
Génotype 1
Génotype 3
ARNduVHC(Log10UI/mL)
Jours
7
Résistance Intrinsèque
Résistance aux traitements
Pawlotsky et al., manuscript en preparation.

163. Viral Factors
Antiviral
resistance
Delayed
clearance
Longer
half-life of
infected cells

164. – Motif nucléotidique responsable de
cette différence de sensibilité ?
– Pas de sélection de mutations de
résistance, même si modification de
la composition de la quasi-espèce
virale
Résumé
Résistance aux traitements

165. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC

166. Mécanismes d’Action
Hypothétiques de la RBV
Adapted from Lau et al., Hepatology 2002; 35: 1002-9.
Ribavirine
Ribavirine
Transporteur
RMP RDP RTP
GMP
GTP
IMPDH
IMP
RdRp
Réplication
HCV RNA
Hépatocyte
(2) Inhibition de la RdRp VHC(1) Inhibition de l’IMPDH
HCV RNA "Catastrophe
(3) Effet mutagène
erreur”
CTL
Th1 IFN-, TNF-
(4) Effets immunomodulateurs
Résistance aux traitements

167. Pawlotsky et al., Gastroenterology 2004;126:703-14
-1.0
-0.5
0.0
0.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Mean HCV RNA decrease (log IU/ml)
Time (days)
Controls
Ribavirin
monotherapy
Résistance aux traitements
Effet Antiviral de la RBV

168. Semaines
*
*
*
*
*
* p<0.05
24 7260524830 36
RBV jusqu’à S52
Arrêt RBV à S24
Bronowicki et al., Gastroenterology 2006
PourcentagedeRechutes(HCVRNA+)
Suivi post-thérapeutique
Prévention de la Rechute
Résistance aux traitements

169. Prévention de la Rechute
(PROVE-2)
Résistance aux traitements
Hézode et al., en révision favorable.
T12/PR12
n/N=
T12/P12
(Sans RBV)
48
22/46
0
10
20
40
50
Tauxderechutes(%)
30
T12/PR24
14
8/5719/63
30
PR48
(Contrôle)
22
10/45

170. • Ribavirin mechanisms of action in chronic
hepatitis C remain unknown
• Ribavirin direct antiviral effect is modest
and transient
• Long-term ribavirin administration does
not select for specific resistance
substitutions
Résumé
Résistance aux traitements

171. • Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHC

172. Cibles Potentielles
des Inhibiteurs
Spécifiques
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
1. Attachement viral, fusion, décapsidation
2. Traduction de l’ARN viral
3. Maturation de la polyprotéine
4. Réplication du génome viral
5. Maturation de la particule virale
Résistance aux traitements

173. Viral entry inhibitors
Hepatitis C immunoglobulin HCIg)
HCV-Ab 68 and Ab 65 (monoclonal Ab)
HCV RNA translation inhibitors
ISIS 14803 (antisense)
AVI – 4065 (antisense)
Heptazyme (ribozyme)
VGX-410C (small molecule IRES inhibitor)
TT 033 (siRNA)
Posttranslational processing inhibitors
NS3-4A serine proteinase inhibitors
BILN 2061
ITMN 191
VX-950
SCH 503034
ACH-806/GS-9132
HCV replication inhibitors
NS5B polymerase inhibitors
MK-0608
HCV-796
R1626
JTK-003
NM-283
XTL 2125
Cyclophilin B inhibitors
DEBIO-025
NIM 811
NS5A inhibitors
A-831, A-689
Helicase inhibitors
QU663
Recombinant Ab fragments
Virus assembly and release inhibitors
UT-231B (iminosugar-glucosidase inhibitor)
Celgosivir (glucosidase inhibitor)
Phase of Development
*
*
*
*
Preclinical I II III IV
*
*
*
Pawlotsky JM, Chevaliez S, McHutchison JG, Gastroenterology 2007;132:1979-98.
Résistance aux traitements
Molécules en Développement

174. sensible
résistant
sensible
résistant
Inhibiteur
résistant
sensible
Résistance aux traitements
Mécanismes de la Résistance
Arrêt
inhibiteur

175. sensible
résistant
Inhibiteur
résistant
sensible
Résistance aux traitements
Mécanismes de la Résistance
sensible
résistant + fit
Arrêt
inhibiteur

176. sensible
résistant
Inhibiteur
résistant
sensible
Résistance aux traitements
Mécanismes de la Résistance
résistant trés fit
sensible
Arrêt
inhibiteur

177. De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Inhibiteurs en
Développement
Résistance aux traitements

178. • Inhibiteurs de la maturation de la
polyprotéine
– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)
• Boceprevir (SCH503039)
• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale
– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128
– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en Développement

179. • Inhibiteurs de la maturation de la
polyprotéine
– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)
• Boceprevir (SCH503039)
• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale
– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128
– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en Développement

180. Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN 191

181. NS4B
p7
NS4A
Résistance aux traitements
Inhibiteurs de la Maturation
de la Polyprotéine

182. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data

183. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data

184. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data

185. Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux
Inhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T,
T54A, V36A/M
T54A
No data
No data

186. • A highly selective, reversible
peptidomimetic inhibitor of the HCV NS3-
4A serine protease
• IC50 of the order of 0.5 µM in vitro
• HCV RNA level reduction of 3-4 Log10 in
vivo
Lin et al., AAC 2006, 50(5): 1813-1822; Zhou et al., Antimicrob Agents and Chemother 2008, 52(1): 110-120.
Résistance aux traitements
Telaprevir (VX-950)

187. Welsch et al., Genome Biology 2008, 9(1): R16.1-R16.18.
Telaprevir

188. Reesink et al., Gastroenterology 2006, 131: 997-1002.
HCVRNAchangefrom
baseline(Log10IU/mL)
Days
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Baseline
Placebo (n=6)
VX-950 750mg q8h
(n=8)
-4.41
-0.21
Résistance aux traitements
Antiviral Effect of TVR Monotherapy
(Phase Ib)

189. Reesink et al., Gastroenterology 2006, 131: 997-1002.
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Baseline
Placebo (n=6)
VX-950 450mg q8h
(n=10)
VX-950 1250mg q12h
(n=10)
VX-950 750mg q8h
(n=8)
-4.41
-0.21
-2.21
-2.37
HCVRNAchangefrom
baseline(Log10IU/mL)
Days
Résistance aux traitements
Antiviral Effect of TVR Monotherapy
(Phase Ib)

190. T54
R155
A156
V36
Amino Acid Substitutions Associated
with Telaprevir Resistance
Sarrazin et al., Gastroenterlogy 2007, 132: 1767-1777.
466 7811 3.5 9 12 71
36/156A156V/T36/155T54AR155K/TV36M/AWT
Résistance aux traitements

191. PROVE-2 Trial
Weeks
480 2412
Placebo + Peg-IFN2a + Ribavirin (RBV)
VX-950 750 mg q8h
+ Peg-IFN2a
+ RBV
VX-950 750 mg q8h
+ Peg-IFN2a
VX-950 750 mg q8h
+ Peg-IFN2a
+ RBV
Peg-IFN2a + RBV Follow-up
Follow-up
Follow-up
PR48
T12/PR24
T12/PR12
T12/P12
Follow-up
72
Zeuzem et al., AASLD 2008, Abstract 243.
Résistance aux traitements

192. Zeuzem et al., AASLD 2008, Abstract 243.
80
T12/PR12
69
T12/PR24
Wk4
T12/P12
(No RBV)
13
PR48
(Control)
50
0
20
40
60
80
100
PatientsWithUndetectable
HCVRNA(%)
Wk4 Wk4 Wk4Wk12
43
62
Wk12
80
Wk12
73
Wk12
46
SVR
36
SVR
60
SVR
69
SVR
11/82 39/7835/82 38/82 66/8248/78 28/78 66/82 49/82 56/81 59/81 56/81
PROVE-2: RVR, EVR, SVR
Résistance aux traitements

193. Relapse Rate
Zeuzem et al., AASLD 2008, Abstract 243.
T12/PR12 and
T12/PR24 Combined
3
0
10
20
30
5/163
PatientsWithVirologic
BreakthroughbyWeek12(%)
0
10
20
30
19/78
T12/P12
(No RBV)
24
19/78PatientsWithVirologic
BreakthroughbyWeek12(%)
Résistance aux traitements

194. Patients Receiving Telaprevir
and Peg-IFN 2a without RBV
• Among the 6 patients who received the
combination of telaprevir and Peg-IFN2a
without RBV
– 3 subtype 1a patients remained HCV RNA positive on
treatment
– 3 patients became HCV RNA undetectable upon
therapy and relapsed after treatment
• 2 infected with subtype 1b
• 1 infected with subtype 1a
Résistance aux traitements
Chevaliez et al., IASL 2008.

195. Patient 1: subtype 1a Patient 2: subtype 1a Patient 3: subtype 1a
Patient 4: subtype 1b Patient 5: subtype 1a Patient 6: subtype 1b
NON-RESPONDERS
RELAPSERS
Weeks
WeeksTVR + Peg-IFN2a for 12 weeks
SOC
SOC
Viral Kinetics
Résistance aux traitements

196. Weeks
WT
A
B C D
E F
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Chevaliez et al., IASL 2008.
Résistance aux traitements

197. Weeks
WT
A
B C D
E F
A
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements

198. Weeks
WT
A
B C D
E F
A B
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements

199. Weeks
WT
A
B C D
E F
A B C
D E
R155K/N
V36L/M
WT
A40T
V36L/M + A40T
R155K/N + A40T
V36L/M + R155K/N
V36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements

200. Weeks
WT
A
B
C
D
E
R155K/E + T42S
WT
A BWT
C E
Patient 3
TVR-Peg-IFN
SOC
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements

201. Weeks
WT
A
B
C
D
E
R155K/E + T42S
WT
A BWT
C E
Patient 3
TVR-Peg-IFN
SOC
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements

202. Weeks
WT
A
B
C
D
E
R155K/E + T42S
WT
A BWT
C D E
Patient 3
TVR-Peg-IFN
SOC
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements

203. Pt 1 Pt 2 Pt 3 Pt 4 Pt 5 Pt 6
R26K
V36L/M V36A
T42S
A40T A40T
T54S T54S T54A
Y56F
T91A
R155K R155K R155K/E R155T/A
G174S
Observed Amino Acid Changes
Résistance aux traitements

204. Location of the Amino Acid Changes
Résistance aux traitements

205. Location of the Amino Acid Changes
Résistance aux traitements

206. • Among the 9 patients who received the
triple combination of telaprevir, Peg-IFN2a
and RBV
– 7 patients achieved an SVR
– 1 patient relapsed
– 1 subtype 1b patient stopped antiviral treatment at 6
weeks when HCV RNA was undetectable and
relapsed thereafter
Patients Receiving the Triple
Combination
Résistance aux traitements

207. Weeks
Patient 8
WT
L14F
WT
L14F + V36C
A
B C
A B
CV36C
*
*TVR + Peg-IFN + RBV for 6 weeks
Quasispecies Analysis
Résistance aux traitements

208. Cys36
D81
S139
H57
F43 C36
Val36
D81
S139
H57
F43 V36
3D Structure of the V36 Mutations
Résistance aux traitements

209. V36
Variants
N (%)
Fold-
change in
IC50
Relative replication capacity in
Huh7.5 cells (%)
WT 1.0 100
V36M 24 (10%) 7.7 77 ± 12
V36A 10 (4.1%) 8.2 104 ± 26
V36L 3 (1.2%) 2.5 ND
V36G 1 (0.4%) 12.3 59 ± 8
V36C 1 (0.4%) 8.6 98 ± 9
V36 Variant Resistance
Résistance aux traitements

210. V36
Variants
N (%)
Fold-
change in
IC50
Relative replication capacity in
Huh7.5 cells (%)
WT 1.0 100
V36M 24 (10%) 7.7 77 ± 12
V36A 10 (4.1%) 8.2 104 ± 26
V36L 3 (1.2%) 2.5 ND
V36G 1 (0.4%) 12.3 59 ± 8
V36C 1 (0.4%) 8.6 98 ± 9
V36 Variant Resistance
Résistance aux traitements

211. V36
Variants
N (%)
Fold-
change in
IC50
Relative replication capacity in
Huh7.5 cells (%)
WT 1.0 100
V36M 24 (10%) 7.7 77 ± 12
V36A 10 (4.1%) 8.2 104 ± 26
V36L 3 (1.2%) 2.5 ND
V36G 1 (0.4%) 12.3 59 ± 8
V36C 1 (0.4%) 8.6 98 ± 9
V36 Variant Resistance
Résistance aux traitements

212. 100
5 10
50
100
FRET Technology
Telaprevir (µM)
WT
V36C
V36M
V36L V36
Variants
IC50 VX-950
(S.E.)
(µM) Fold-change
WT 0.6 (0,2) 1
V36L 1.3 (0.1) 2
V36C 2.4 (1.3) 4
V36M 3.05 (3.85) 5
V36 Variant Resistance
Résistance aux traitements

213. • Inhibiteurs de la maturation de la
polyprotéine
– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)
• Boceprevir (SCH503039)
• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale
– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128
– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en Développement

214. Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
A
NNI site A (Thumb/fingertips)
Indoles
Benzimidazoles
NNI site B (Thumb)
Phe derivatives
Thiophene-COOH
Dihydroxypirones
Pyranoindoles (HCV371)
B
NNI site C (Palm)
Benzothiadiazine (A-848837)
Acyl-pyrrolidine
Proline sulfonamide
Acrylic acid derivatives
Active Site
Allosteric GTP
C
2’-methyl nucleosides (NM283, MK608)
4’ azido-cytidine (R1626)
NNI site D (R200 hinge)
Benzofurans (HCV086, HCV796)
A
B
C
D

215. Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
A
NNI site A (Thumb/fingertips)
Indoles
Benzimidazoles
Pro 495, Pro 496, Val 499
NNI site B (Thumb)
Phe derivatives
Thiophene-COOH
Dihydroxypirones
Pyranoindoles (HCV371)
Met 423
B
NNI site C (Palm)
Benzothiadiazine (A-848837)
Acyl-pyrrolidine
Proline sulfonamide
Acrylic acid derivatives
Asn 411, Met 414, Tyr 448
Active Site
Allosteric GTP
C
2’-methyl nucleosides (NM283, MK608)
4’ azido-cytidine (R1626)
NNI site D (R200 hinge)
Benzofurans (HCV086, HCV796)
Cys 316, Val 201
A
B
C
D

216. Placebo
500 mg bid
1500 mg bid
3000 mg bid
4500 mg bid
Traitement Suivi
Jours
0 5 10 15 20 25 30
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
-2.6 log10
-3.7 log10
-1.2 log10
Réductiondel’ARNduVHC
(LogUI/mL)
R1626 : Phase Ib
Résistance aux traitements

217. R7128 : Phase II
Jours
0 5 10 15 20 25 30
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0 PegIFN + RBV + placebo
PegIFN + RBV + R7128 500 mg bid
PegIFN + RBV + R7128 1500 mg bid
RéductionARNVHC(Log10)
Lalezari et al., EASL 2008.
Résistance aux traitements

218. MK 7009
monotherapy
0
1
2
3
4
5
6
0 50 90 130 170 210 250
Day
logIU/mL
LOQ
MK 7009
+ MK-608 Chimp A
Chimp B
Chimp C
SVR
Olsen et al., APASL 2008
Combinaison de MK-7009 et
MK-608
Résistance aux traitements

219. Prévention de la Résistance
• Réduire au maximum la réplication virale
• Augmenter la barrière pharmacologique
• Utiliser des molécules avec une barrière
génétique élevée
• Compliance
Résistance aux traitements