Cours complet sur le rôle de la flore intestinale Gram négatif et des oxydations par le groupe NO dans les pathologies neuro-dégénératives

1. Rôle de la flore intestinale Gram
négatif et des oxydations par le
groupe NO dans les pathologies
neuro-dégénératives
J.C. Leunis
Dr.Sc.Chimiste-Biochimiste-Biologiste
Laboratoire ATEGIS

2. Les bactéries de l’écosystème intestinal :
population de l’ordre de 500 espèces de
germes saprophytes.
Deux groupes :
a)une flore dominante Gram positif, anaérobie
stricte (99 % de la population).
b) une flore sous-dominante Gram négatif.

3. Gramnégatif : une activité toxique liée à la
composition de la structure membranaire de
ce type de bactérie.
Activité toxique = « endotoxine »

4. Endotoxines : complexes macromoléculaires,
fragments de membranes contenant des
lipopolysaccharides (LPS) ancrés dans la
couche externe de la membrane.
Les LPS sont présents de manière
constitutive dans la membrane externe de
toutes les bactéries Gram négatif.
Chaque espèce de bactérie Gram négatif
produit un LPS spécifique.

5. La paroi des bactéries Gram positives et Gram négatives
Porine
Gram négative Lipoprotéine
Chaînes latérales O de Braun
Liposaccharide
(LPS)
Membrane
externe
Espace
périplasmique et
peptidoglycane
Gram positive Membrane
Phospholipides Peptidoglycane plasmique
Acides Protéines
lipotéichoïques Acides intrinsèque
téichoïques
Peptidoglycane
Espace
périplasmique
Membrane
plasmique

6. Structure schématique :
Les endotoxines : constituants hétérogènes
composées de trois régions principales:

7. 1. Le lipide A : sucres aminés et des acides gras variables
selon les espèces bactériennes.
Les principaux acides gras à courtes chaînes
composant le lipide A et estérifiant les sucres
sont les suivants :
- l’acide laurique : H3C-(CH2)10-COOH,
- l’acide myristique : H3C-(CH2)12-COOH,
- l’acide palmitique : H3C-(CH2)14-COOH,
- l’acide -hydroxymyristique : H3C-(CH2)11-CHOH-COOH.
Pourquoi sont-ils saturés ? Réponse en fin d’exposé.
L'intégrité de la structure du lipide A est
nécessaire à l'activité toxique.

8. 2)Lecore oligosaccharidique fait le lien entre le
lipide A et les sucres. Il est spécifique d'une espèce
à une autre (par exemple chez Salmonella : 5
heptoses, 3 pentoses, 2 octoses).
3) Les chaînes-O spécifiques formées par des
unités répétitives portant les déterminants
antigéniques

9. Rôles des LPS
1. Rôle de structure indispensable à la viabilité de la
bactérie.
2. Effet de barrière vis-à-vis des molécules
hydrophobes.
3. Barrière contre les protéines lytiques du
complément.

10. Effets des LPS sur l’hôte
1) hyperthermie
2) agrégation des hématies
3) activation du complément
4) choc septique
5) diminution de la pression artérielle
6) activation de la coagulation
7) activation du facteur XII (fibrinogène → fibrine)
8) induction prostagl.E2 et A2, PAF et leucotriènes
9) effet mitogène sur les lymphocytes B
La toxicité est uniquement liée au lipide A.

11. Lipide A : ne circule jamais libre dans le sang.
Toujours complexé à des fragments de membranes
bactériennes ou à des protéines transporteuses :
l’albumine, la LBP -oula LPS binding protein -, des
anticorps ou à des lipoprotéines du malade.
Différentes cellules répondent aux endotoxines :
- monocytes ou macrophages circulants
- macrophages : production de °NO et de cytokines
- cellules endothéliales par la forme solubledu
récepteur CD14 présent dans le plasma (3 à 6 g/ml).
- Rôle des TLR ou Toll-like receptors

12. Les Toll-like receptors ou TLR
Les TLR sont des récepteurs de l’immunité innée qui
reconnaissent des structures à la fois exogènes et
endogènes des microorganismes.
Les TLR font partie de la famille de PRRs ou Pattern-
Recognition Receptors.
Ils reconnaissent les motifs moléculaires de divers
pathogènes,motifsconservés au cours l’évolution, les
PAMPS ou les Pathogen-Associated Molecular Patterns
tels que des motifs bactériens, viraux,parasitaires et
polymériques comme des polysaccharides, protéines,
des ARN ainsi que les ADN simple brin.

14. La stimulation des récepteurs CD14 et CD18 par les
complexes LPS-LBP (LBP = LPS Binding Protein)
induit la production du TNF, d'IL-1, d'IL-6 et d’IFN-
ainsi qu’une augmentation de l’activité des NK.
La production de NO est augmentée par le LPS
qui stimule la iNOS
Cette stimulation du TNF, du NO, de l’IFN- et des
NK explique l’activité antitumoraledu LPS.
La glycoprotéine MD-2 intimement liée au TLR4 est
indispensable à la reconnaissance innée du LPS par
le TLR4. La MD-2 soluble = opsonine.

15. Voie d’activation du macrophage
Induction de cytokines pro-inflammatoires

16. Rôles des cytokines produites
IL-1 produit par les macrophages et les cellules endothéliales. Rôle dans la
fièvre, stimule la production de prostaglandines. Pyrogène (hypothalamus)
Induit la diapédèse leucocytaire. Active Toll par MyD88 adaptateur de transduction
activant les kinases IRAK qui amplifient le signal orchestrant l’inflammation.
IL-6 produit par les macrophages, production induite par l'IL-1.
Régule la phase inflammatoire.
IL-8 produit par les macrophages et les cellules endothéliales.
Recrute neutrophiles. Rôle capital dans la recrutement leucocytaire et le
chimiotactisme.
L'ensemble de ces cytokines a un effet bénéfique en permettant le
développement d'une réaction inflammatoire qui participe à l'élimination de
l'agent bactérien.

17. Le monoxyde d’azote : °NO
Le radical °NO est messager multifonctionnel généré à partir de
l’arginine et par les NO synthases , 3 isoenzymes :
- NOS constitutive
- NOS endothéliale
- NOS inductible ou iNOS
LPS stimule iNOS dans les macrophages qui se mettent à
produire du NO, un puissant oxydant.
But : détruire bactéries – champignons – cellules tumorales par
inhibition de synthèse de l’ADN.
Oxydation non contrôlée : ROS + NO → ONOO- peroxynitrite

18. A une agression doit correspondre une réponse
immune correctement adaptée
• L'adaptation fait appel à une participation équilibrée de différentes cellules du
système immunitaire et parmi celles-ci on compte :
• les lymphocytes T
• les lymphocytes B
• les cellules NK
• les cellules dendritiques - APC
• les macrophages
• les mastocytes
• des cellules myéloïdes
Ce que l'on appelle " l’immunité " est la résultante d’une communication entre 2 systèmes :
• L’immunité innéeréponse rapide, pas de spécificité antigénique
et donc pas de mémoire
• L’immunité adaptativeréponse lente avec mémoire de contact : LTm

19. L’immunité innée :
Ensemble de défenses anti-infectieuses immédiatement mobilisables et faisant
appel à la fois à des cellules et des facteurs solubles dont :
• les neutrophiles
• les phagocytes mono- et polynucléaires (monocytes et macrophages)
• les cellules NK par le biais de l’IL-2
• probablement des sous-population de cellules B : les Mz-B de la rate (Marginal zone B
cells), et les B1 des cavités pleurales.
• des facteurs du système du complément : les C3 et C4
• des peptides antimicrobiens : les lantibiotiques de 20 à 40 aa (eucaryotes)
• le lysozyme (qui doit avoir subi un choc oxydant pour être actif, d’où l’importance de
l’activité myéloperoxydasique lors d’une infection bactérienne)
• le TNF-a réprimant la réplication virale (sauf celle du virus HIV)
• la transferrine et la lactoferrine régulant le fer disponible
• la fibronectine qui en tapissant les bactéries induit le C3 et la phagocytose
• la flore intestinale

20. Immunité adaptative
Le système immun adaptatif met en jeu les lymphocytes T et B, la
coopération entre ces cellules étant orchestrée par des macrophages.
Les cellules mises en jeu sont :
• descellules présentatrices d’antigènes (APC) ce sont des macrophages.
On peut les appeler les sentinelles du système immunitaire.
• Le rôle principal de ces cellules est la surveillance et la capture des
antigènes qui seront apprêtés et puis associés aux molécules du
complexe majeur d'histocompatibilité (CMH II) avant d'être présentés
aux lymphocytes T.
• des cellules régulatrices (Th ou CD4)
• des cellules effectrices (CD8 - NK -Lympho B)

21. L’immunité innée dépend de la génétique
• L’immunité innée fait appel à des macrophages possédant
« génétiquement » des récepteurs pour des antigènes (Ag) dérivant
de groupes de pathogènes plutôt que des récepteurs pour des Ag
spécifiques.
• Il y aurait environ 50 gènes impliqués dans la réponse innée.
• Parmi les Ag induisant l’immunité innée on compte :
• - les LPS des Gram – (macrophages/monocytes CD14)
• - le peptidoglycane et l’acide lipotéichoïque des Gram+
• - la flagelline,
• - des polysaccharides,
• - des protéoglycans,
• - de l’ARN double brin.

22. La peste (LPS de Yersinia pestis)
Virulence :
a) paralysie du système immunitaire inné,
b) LPS tétra-acétylé non détecté par TLR4,
c) APC maintenues immatures,
d) Blocage de l’immunité adaptative.
Pas d’inflammation mais infection létale.
Si hexa-acétylation : reconnaissance par le TLR4 > inflammation > immunité
Nature Immunology, 2006, 7, 1017-1019.

24. Augmentation de la concentration
plasmatique des LPS dans le sang :
a) apport graisseux
b) résistance à l’insuline
(Amar et Burcelin, Diabetes, avril 2007).
Un régime gras modifie la flore intestinale et
facilite le passage de LPS au niveau de
l’intestin.
=> Lien LPS – Diabète II

25. Rôle de la flore intestinale
La citation de Pasteur :
« un germe donne une maladie »
est dépassée.

26. Yersinia enterolytica :
- entérite
- spondylarthrite si HLA B27+
- maladie de Crohn
Si HLA DR3 + :
anticorps contre récepteur TSH thyroïdite
auto-immune
Mais ce n’est pas parce que le gène DR3 est
présent que le patient fera nécessairement la
maladie auto-immune. Cf. Haplotype étendu.
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa et Helicobacter pylori,
également associées à la SPA

27. En 2004, M. Geffard trouve, dans la SEP, la
présence d’anticorps IgM et IgA dirigés contre
des constituants des germes intestinaux.
D.Bodet et al. Immuno-analyse & Biologie spécialisée 19, 2004, 138-147.
Divers LPS testés dans le modèle d’encéphalite
allergique expérimentale (EAE) chez le rat.
Tous les LPS ne sont pas inducteurs de crise
d’encéphalite !
Il y aurait une spécificité moléculaire liée aux
LPS qui reconnaissent la protéine basique de
la myéline (MBP).

28. Dans la SEP on ne détecte que des IgM et des IgA.
La raison serait liée à :
- la nature des néo-antigènes
- leurs faibles poids moléculaires (haptènes)
- la réponse auto-immune ferait appel à une sous-population
de cellules B : les Mz-B de la rate -Marginal zone B cells et
les B1 des cavités pleurales dont la réponse n’est pas
médiée par les APC.
L'anti-idiotypie de type IgM jouerait un rôle par neutralisation
de la réponse Th1 (MAI).
Autre possibilité : les cytokines moduleraient la production
du type d'anticorps IgM et IgA.
IL-5 et TGF-bIgA,
IFN et IL-4IgG.

29. Prenons l’exemple de la SEP, nous constatons que :
1)dans les phases rémittentes, on mesure
surtout des IgM
2)dans la phase d'évolution progressive,
on trouve des IgM et des IgA
Avec le temps, les IgM disparaissent et
l'apparition des IgA correspond à une forme
irréversible de la SEP.
Il y aurait une spécificité moléculaire liée aux
LPS qui reconnaissent la MBP.

30. Dans le cadre de l’étiologie oxydative des maladies
autoimmunes neurodégénératives certains types de composés
ou de fonctions chimiques jouent un rôle important :
1) Le radical MDA
2) Le radical °NO.
3) La fonction amide -CO-NH-
Exemple : CH3-( CH2 )7 -CH=CH- ( CH2 )7-COOH ac. oléique
+NO ou NO2-
HOOC-( CH2 )7 -COOH ac. azélaïque
HOOC-( CH2 )7-CO-NH amide azélaïque
Fonction amide : rôle dans l’interface Protéine-Phospholipide tel
que entre la protéine basique de la myéline et les
phospholipides. C’est la fonction amide qui est importante.

31. On peut schématiser le processus de crise de SEP :
Facteurs étiologiques dont LPS
initiateurs de phases d'oxydation (NO)
mobilisation des Ag membranaires
réponse autoimmune
démyélisation de la membrane
crise de SEP

32. Dès la naissance, que des IgM dirigés contre le
Soineutralisés ensuite par des IgG (anti-idiotypie).
Cependant, dans la sclérose en plaques on ne
trouve pas d'IgG.
Traitement de la SEP :
corticoïdes, l'IFN- et immunosuppresseurs.
Ce type de traitement n'est pas spécifique, il
engendre une immuno-suppression généralisée et
donc tout à fait inadaptée.
Peakman introduit l’idée d’une immunothérapie par des
antigènes spécifiques.
Mark Peakman, Colin M.Dayan., Immunology 2001, 104, 361-366.

33. D'un point de vue thérapeutique, il faudrait
maintenir le patient dans la phase
rémittente et mettre en œuvre un
traitement bloquant l'évolution
progressive.

34. Autre approche thérapeutique : apport
d'immunoglobulines.
Ig en i.v. réprime la production des cytokines IL-2 et
d'IFN- par les Th1.
L’auto-immunité fait partie de l’immunité adaptative,
dans le pool d’immunoglobulines apportées au
malade, il doit donc se trouver des anticorps anti-
idiotypiques de type IgM bloquant la réponse Th1.
On peut aussi espérer pouvoir utiliser une
thérapeutique basée sur des leurres immunologiques
permettant de dévier les anticorps IgM vers des cibles
mimant la composition lipidique de la myéline.

35. DC = sentinelles de l'auto-immunité.
Les DC– dendritic cells- vivent deux états différents :
un état immature et un état mature.
A l'état immature, en l'absence de stimuli
inflammatoires, les DC captent par pinocytose toutes
les molécules se trouvant à leur portée, même les
antigènes du soi.
Dans cet état immature, les DC n'activent pas les
lymphocytes T :
Induction d’un état de tolérance et de suppression.

36. Dans un contexte peu inflammatoire, ou lors d'une
infection limitée, les DC sont faiblement activées
mais suffisamment pour alerter le système
immunitaire.
Ce qui permet la différenciation de cellules Tm
sans induire de réponse innée.

37. LPS antigène détecté par des récepteurs de
signaux de danger.
Signaux de danger maturation des DC et migration
vers les ganglions, interaction avec les cellules T et
stimulation de cytokines.
Nous pensons que le maintien des DC dans l’état
immature (ou le renversement de la maturation
des DC ?) doit pouvoir ouvrir la voie à des
nouvelles thérapeutiques des maladies auto-
immunes.
Certains composés naturels empêchent la maturation
des cellules DC, parmi ceux-ci le FK 506, Tacrolimus,
immunosuppresseur isolé à partir du Streptomyces
tsukabaensis, offre de nouvelles perspectives.

38. LPS et Maf (macrophage activating factor)
Tant les LPS que le Gcmaf activent les macrophages.
• Mais il n’y a jamais de stimulation simultanée ou concomitante.
• On assiste à une affinité compétitive entre LPS et Gcmaf.
• L’affinité du Gcmaf est nettement plus élevée pour les
macrophages que l’affinité des LPS pour les macrophages.
L’activation des macrophages par les LPS est fortement diminuée, si
pas inhibée, par le Gcmaf dont la Gc ne peut pas être saturée en
vitamine D.
. Utilisation de leurres « immunologiques » de type polylysine portant
les acides gras composant la myéline et mis au point par Geffard.
• D’où nouvelles sources thérapeutiques.

39. LPS et Maf
Rappelons que la stimulation du macrophage par un
LPS provoque :
• 1. une production de NO* et ONOO*
• 2. une perte de contrôle redox.
• 3. une cholestase et évidemment desTr.digestifs.
• 4. une production d’Ac
• 5. une auto-immunité
Ce qui n’est pas le cas du Gcmaf constitutif.
Mais il est trop tôt pour juger l’apport thérapeutique
de Gcmaf et ses conséquences immunologiques tant dans
les cancers que dans le SFC.

40. Approches diagnostiques et
thérapeutiques
• Dosages des divers anticorps cf.analyses 07 et 08
• Profil IPL cf. demande d’analyses poste 02
• Profil phytothérapeutique cf. poste 01 demande d’analyses
• Aromatogramme sur les selles cf. poste 06
• Importance des huiles essentielles
• Traiter la dysbiose intestinale
• Phytothérapie
• Réponse à la question page 7 : parce qu’il est difficile d’oxyder des acides gras saturés.

47. Références
1.
Normalization of leaky gut in chronic fatigue syndrome (CFS) is accompanied by a clinical
improvement:effects of age, duration of illness and the translocation of LPS from gram-negative bacteria.
• Maes M, Leunis JC.
• Neuro Endocrinol Lett. 2008 Dec;29(6):902-10.
• 2.
• An IgM-mediated immune response directed against nitro-bovine serum albumin (nitro-BSA) in chronic fatigue
syndrome (CFS) and major depression: evidence that nitrosative stress is another factor underpinning the
comorbidity between major depression and CFS.
• Maes M, Mihaylova I, Kubera M, Leunis JC.
• Neuro Endocrinol Lett. 2008 Jun;29(3):313-9.
• 3.
• The gut-brain barrier in major depression: intestinal mucosal dysfunction with an increased translocation of LPS
from gram negative enterobacteria (leaky gut) plays a role in the inflammatory pathophysiology of depression.
• Maes M, Kubera M, Leunis JC.
• Neuro Endocrinol Lett. 2008 Feb;29(1):117-24.
• 4.
• Increased serum IgM antibodies directed against phosphatidyl inositol (Pi) in chronic fatigue syndrome (CFS) and
major depression: evidence that an IgM-mediated immune response against Pi is one factor underpinning the
comorbidity between both CFS and depression.
• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.
• Neuro Endocrinol Lett. 2007 Dec;28(6):861-7.

48. Références
• 5.
• Normalization of the increased translocation of endotoxin from gram negative enterobacteria (leaky gut) is
accompanied by a remission of chronic fatigue syndrome.
• Maes M, Coucke F, Leunis JC.
• Neuro Endocrinol Lett. 2007 Dec;28(6):739-44.
• 6.
• Chronic fatigue syndrome is accompanied by an IgM-related immune response directed against neopitopes
formed by oxidative or nitrosative damage to lipids and proteins.
• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.
• Neuro Endocrinol Lett. 2006 Oct;27(5):615-21.
• 7.
• Increased serum IgA and IgM against LPS of enterobacteria in chronic fatigue syndrome (CFS): indication for the
involvement of gram-negative enterobacteria in the etiology of CFS and for the presence of an increased gut-
intestinal permeability.
• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.
• J Affect Disord. 2007 Apr;99(1-3):237-40. Epub 2006 Sep 27.
• 8.
• In chronic fatigue syndrome, the decreased levels of omega-3 poly-unsaturated fatty acids are related to lowered
serum zinc and defects in T cell activation.
• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.
• Neuro Endocrinol Lett. 2005 Dec;26(6):745-51.

49. Références
9. IgM-mediated autoimmune responses directed against anchorage epitopes
are greater in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome
(ME/CFS) than in major depression.
Maes M, Mihaylova I, Kubera M, Leunis JC, Twisk FN, Geffard M.
Metab Brain Dis. 2012 May 22. [Epub ahead of print]
10. Increased IgA and IgM responses against gut commensals in chronic
depression: Further evidence for increased bacterial translocation or leaky
gut.
Maes M, Kubera M, Leunis JC, Berk M.
J Affect Disord. 2012 Mar 11. [Epub ahead of print]
11. Increased IgA responses to the LPS of commensal bacteria is associated
with inflammation and activation of cell-mediated immunity in chronic fatigue
syndrome.
Maes M, Twisk FN, Kubera M, Ringel K, Leunis JC, Geffard M.
J Affect Disord. 2012 Feb;136(3):909-17. Epub 2011 Oct 2.

50. MERCI et RESTEZ CURIEUX