1. 미생물학 실습 시 실험실내 주의사항
미생물학 실습은 병원균을 직접 다루는 실험이므로 사고 발생시 여러분 자신은 물론 주변 동
료에게도 위험이 미칠 수 있다는 사실을 명심하여 안전문제와 실습관리에 각별히 주의해 주
시기 바랍니다.
1. 실습실내에서는 책을 보기 위한 테이블과 실험을 위한 테이블 (세이프 매트)을 구분하여
사용하십시오. 다른 용도로 사용하지 않기 바랍니다. 실험실의 창문은 반드시 닫아 두시기
바랍니다.
2. 실험실내에서는 반드시 실험가운을 착용하여야 하며 가방이나 옷가지 등 실험에 불필요
한 물품들은 실습실 캐비닛에 보관하십시오. 가운의 단추를 풀어 헤치는 일이 없도록 합시
다.
3. 현미경 운반 시는 오른손으로 손잡이를 잡고 왼손으로 받침대를 받쳐서 감싸 안 듯이 하여
운반하시기 바랍니다. 절대로 한 손으로 운반하는 일이 없도록 합시다. 현미경에 유침유
(immersion oil)를 사용한 후 (1,000 배 배율 검경시) 반드시 lens paper를 사용하여 렌즈를 가
볍게 누르면서 닦아주시기 바랍니다. Lenz paper이외의 다른 종이를 사용하거나 문질러서
닦는 일이 절대 없도록 합시다.
4. 각 방에 배당된 cart의 사용수칙은 다음과 같습니다.
4-1. Cart의 윗칸에 놓아두어야 하는 물건 :
실험에 사용할 균주, 각종 배지 및 시약, 실험하고 남은 시약, 피펫, 스포이드, bulb 등의 각종
실험기구, 크레졸통, lens paper 및 immersion oil, 슬라이드 글래스

2. 4-2.Cart의 아랫 칸에 놓아 두어야 하는 물건 :
실험에 사용하고 남은 균주, 균을 배양하여 판독이 끝난 배지
5. Cart의 크레졸 통에 실험에사용한 유리제품(ex. 피펫, 슬라이드 글래스)과 면봉을 넣
어 주십시오. 기타 다른 기구(ex. loop)를 넣는 일이 없도록 합시다.
6. Loop는 반환하지 말고 실습방별로 cart 위 보관통에 보관하여 사용한 후 실습 마지막
날 일괄적으로 반환해 주시기 바랍니다.
7. 실험에 사용할 plate나 배양중인 plate, 실험이 다 끝난 plate는 뚜껑이 아래로 향하도
록 놓으시기 바랍니다. Plate나 tube에 표시를 할 때는 name pen만을 사용하시기 바랍
니다. 다른 필기구나 white 등은 사용하는 일이 없도록 합시다.
8. 균을 흘렸을 경우 곧바로 조교선생님께 알려서 크레졸을 부어 소독이 되도록 하고 다
른 안전사고 발생시에도 조교선생님께 즉시 알려서 필요한 조치를 취해 주시기 바랍니
다.
9. 알코올 램프는 불을 켠 채 이동을 금지하며 메탄올은 조교선생님을 통해 채우도록 하
기 바랍니다.
10. 실습 후 매일 청소당번을 정하여 청소를 해 주시기 바랍니다.
서울대학교 의과대학 미생물학교실

3. 10월 18일 목요일
염색
1. 단 염색
2. 그람 염색
3. 항산성 염색

4. 실습 재료 (개인실험)
실습 균주: Nutrient agar slant 에 준비됨
1. Bacillus subtilis
2. Escherichia coli
3. Mycobacterium abscessus
4. Staphylococcus aureus
Staining solution Lens paper
Alcohol lamp Slide glass
Corne forceps Immersion oil

5. 1. 단염색 (Simple staining)
– B. subtilis, E. coli, S. aureus
원리
강염기인 methylene blue를 사용하여
세균의 모양과 배열을 관찰할 수 있다.
: 세균의 세포에는 (-) charge를 띤 nucleic acid가 풍부
하므로 (+) charge 를 띤 basic dye가 binding하는 원
리.

6. 단염색 과정
우선 slide glass 를 불에 달군 후 빨간 색연필로 경계선을
그어준다.
백금이로 물을 한방울씩 떨어뜨린다.

7. 도말 (Smear) 백금이가,
빨갛게
될때까지
위아래로
달군다

8. 단염색 과정 계속
도말 (Smear)
B. subtilis, E. coli, S. aureus
도말 표본을 공기 중에서 건조(Drying)

9. 단염색 과정 계속
고정 (Fixation)
불꽃 위로 2-3회 통과

10. 단염색 과정 계속
Methylene Blue
염색 (Staining)
1분간 염색

11. 단염색 과정 계속
수세 (Rinsing)
물이 직접 도말면에 닿지 않도록
뒷면에서 물을 흘린다
건조여지를 이용하여 물기를 흡입 제거
주의: 여지를 슬라이드 위에서 비비지 말 것

12. 단염색 과정 계속
유침유(immersion oil)
검경 (Microscopic observation): X 1000

13. <E. coli> <B. subtilis> <S. aureus>

14. 2. 그람염색 (Gram staining)
; E. coli, S. aureus, B. subtilis
Gram positive 세균은 cell 주위에 두껍고, cross-linked,
meshlike structure를 가진 peptidoglycan layer가 둘러싸고
있어 탈색되지 않고 crystal violet을 유지하는 반면,
Gram negative 세균은 peptidoglycan layer가 얇으므로
탈색제인 유기용매에 의해 crystal violet 상실.
그람 염색은
세균의 중요한 분류 기준이 된다.
Gram positive : primary stain(crystal violet)을 유지
진청색 or 보라색
Gram negative : 탈색과정에 의해 primary stain을 소실
counter stain(safranin)에 의해 염색됨
적색 or 핑크색

15. 그람 양성 균과 음성 균의 세포벽 구성의 차이

16. 그람 염색 과정
균 도말, 건조, 고정(단염색과 동일)
Crystal violet으로 1분간 염색 후
물로 세척
Gram’s iodine으로 1분간 처리 후
95% 에탄올로 15~20초 동안 탈색한다.
물로 세척 후
Safranin으로 20초 동안 대조염색한다.
물로 세척, 건조, 검경( x 1000).

17. <E. coli> <B. subtilis> <S. aureus>

18. 3. 항산성 염색 (Acid-fast staining)
- M. abscessus, S. aureus, E. coli -

19. 항산성 염색 원리
50~90개의 carbon으로 구성된 Long-chain fatty acid (mycolic acid)를
가지고 있는 세균들은 cell wall이 lipid가 풍부하여 hydrophobic하고
염색약이 통과할 수 없다.
Staining 과정 초기에 열을 가하여 일단 primary dye가 들어간 후에는 acid-
alcohol로 처리해도 탈색되지 않는다.
항산성 세균은 carbol fuchsin에 의해 red로 염색되고 Cellular background나 다른
세균들은 blue로 염색된다.
항산성이 있는 세균속에는 Mycobacterium, Nocardia 등이 있다.

20. 항산성 염색 과정
균 도말, 건조, 고정(단염색과 동일)
Carbol fuchsin 을 올려놓고 나무 집게로
slide glass를 집어서 알콜램프 위에서 가열하여 증기가 오르면
빼낸다. (끓지 않게 주의 ) 염색약을 보충하고 가열하는 것을
반복하며 이를 5분간 지속한다.
Acid alcohol로 15~20초 동안 세척한다.
물로 세척하여 acid alcohol의 작용 중지시킨 후
methylene blue로 20초 동안 대조염색한다.
물로 세척, 건조, 검경( x 1000).

21. 항산성 염색 과정 계속
*주의사항
염색과정 중 가열을 오래 해야 하므로
빨간색연필로 경계선을 그어서는
안되며, 유리가 뜨거우므로 조심해야
한다.

22. 항산성 염색 결과
<M. abscessus>