1. Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique
université Mohamed Heider -Biskra

2.  Introduction
 Généralité
 I-Conservation des souches microbiennes
 1-Définition de conservation
 2-Les types de conservation
 2-1-Conservation de courte durée
 2-2-Conservation de longue durée

3.  3-Les méthodes de conservation
 3-1- La lyophilisation
 3-2-La conservation par congélation
 3-3-La conservation sur gélose
 3-4-La réfrigération
 3-5-Ultra congélation
 3-6-La repiquage des souches
 II-Conservation des champignons
 III-Conservation des virus
 IV-Les applications de la conservation en
générale
 Conclusion

4.  En biologie, la culture cellulaire désigne un
ensemble de technique utilisée pour faire
croître des cellules lors de leur organisme
ou de leur milieu d’origine, dans un but
d’expérimentation scientifique.
 Lorsque en microorganisme ou un virus a
été sélectionné ou construit dans un but
spécifique, il doit être conservé dans son
état original pour usage ultérieur et l’étude
donc :

5. Toutes les souches bactériennes
↓
L’identifier
↓
Confirmer
↓
Et a l'afin : Conserver
A lors comment on fait une conservation
des souches microbienne ?

6.  Les milieux de culture sont des
préparations stériles, solides, semi solides
ou liquides utilisées pour la croissance,
repiquage ou la conservation des
microorganismes, ils offrent sous forme
assimilable toutes les substances
indispensables leur nutrition dans des
conditions physico-chimiques optimum.

7.  Plusieurs centaines de milieux de culture ont
été décrits a ce jour
 Ils doivent apporter tous les éléments
nécessaire a l’élaboration du protoplasme
cellulaire. De ce fait, le micro-organismes
doivent trouver dans le milieu du culture et
son atmosphère toutes les substances
requise pour leur croissance: l’eau, une
source d’énergie, le carbone, l’azote, de
même que des ions essentiels: phosphate,
sulfate, sodium, calcium, magnésium,
potassium, fer ainsi que des traces d’élément
divers sous forme appropriée (Zn, Mn, Mo,
Co, Cu etc.)

8.  Un bon milieu doit :
-Etre stérile.
-Etre nutritif.
-avoir un PH convenable.
-Contenir une quantité d’eau suffisante.
 Ces organismes différent les uns des autres
par leur propriétés nutritionnelles et leur
adaptation aux conditions physiques de
leur milieu de vie (ph, température,
disponibilité en O2, salinité….) et sont divisés
en différant groupes nutritionnels. Les
ingrédients apportés aux milieux de culture
dépendent donc des exigences de chaque
espèce.

9.  1-Définition de conservation:
C'est le maintien de toutes les propriétés
morphologiques et génétiques des souches
microbiennes aussi assure la survie de ces
dernier et indispensable les aux études
taxonomiques.
En microbiologie, ou on travaille avec des
organismes conserver viable a l'identique.
La conservation doit évidemment exclure les
contaminations.

10.  2-Les types de conservation:
Il y a 02 types de conservation
2-1-conservation de courte durée:
Certains souches sont rapidement
perdues, il s'agit par fois des souches de
culture délicate.
Exemple: Neissericeae, streptococcus,
H.influenzae….

11. 2-2-Conservation de longue durée:
Pour les souches plus résistances comme
les Psudomonas se sont souvent des
bactériophages qui sont responsable de
distraction lors de la conservation tue
tous les survivants. Ces souches
nécessitent donc d'autre techniques des
conservations des souches

12.  Définition:
Est le procédé qui fait tout d'abord intervenir
une congélation a basse température
(entre -40 et -80 C0) suivie d'une
dessiccation puis d'une sublimation sous
vide poussé. La sublimation est le passage
direct de l'état solide à l'état gazeux
direct.

13.  La lyophilisation comporte généralement
trois étapes:
La congélation, la sublimation (dessiccation
primaire) et la dessiccation secondaire.
La durée de cette méthode est plusieurs
années. C'est la meilleure technique de
conservation et du transport mais peut
conduire a la perte des plasmides présent
dans ces souches lyophilisées et onéreuse.
La lyophilisation n'est pas compatible avec
tous les microorganismes dans certain cas
elle occasionne des altérations cellulaire
et génétique.

14.  Se fait par appareille ou par des produits
lyophilisée tels que les plasmas oxalate
de lapin qui après réhydratation.
Exemple: staphylococcus…….
 Des microorganismes lyophilisés tels que
la souche bactérienne lyophilisée de
collection internationale.

15.  Définition:
Est un technique de conservation visant à
faire passer un produit a l'état solide par
des technique de refroidissement forcé. La
température de conservation sont en
générale -20 C0 (congélateur standard), -
80C0.

16. *Type de congélation:
1-La congélation à (-18 C0) des cadavres des
animaux injecte expérimentalement (ou
fragment d'organe) permet notamment la
conservation des streptococcus
pneumoniae.
2-La congélation à (-80 C0) de billes
imprégnées de culture.
3-La congélation à (-80 C0) en billon glycérolé
a 20%-30% permet une excellente
conservation de la plupart des souches cette
technique est applicable à (-18 C0).

17. a- Préparation le bouillon trypticase soja et
l'additionner de 20% de glycérol.
b- Le répartir dans des tubes à essai contient
des souches pures a conserver sur gélose.
c- Stérilisation les tubes à 121 C0 pendant 15
min.
d-Le refroidissement du bouillon dans le
congélateur -20 C0→-80 C0

18.  Capacité verticaux ou horizontaux,
ventilés ou non, fonctionnant de -18 C0 à
-25 C0, de -25 C0 à -35 C0 ou -40 C0 (pour
une température ambiante de 35 C0).

20. Définition :
 Se fait par des réfrigérateurs de laboratoire de
microbiologie dans ce cas qui concerne la
bactérie
 Il y a 02 types de réfrigération:
a-Réfrigérateur: pendant la conservation des
souches bactérienne.
b-Réfrigérateur: assure la conservation
échantillons.
Destinée à l'analyse microbiologique à 2±2 C0.
Exemples: la réfrigération a 4 C0 d'une
suspension de souches dans un sang stérile
permet une bonne conservation de
Streptococcus pneumoniae.

21.  Ce sont des milieux pauvres qui
maintiennent les micro-organismes dans
un état de vie ralentie. Ce type de milieu
dit "gélose pour conservation des souches
bactériennes "

22.  Les cultures d'un milieu gélose incliné en
tube a essai se conservation mieux, se
contaminent moins, mais la surface est
beaucoup plus réduite.
 Lorsqu'une culture pure a été obtenue elle
peut transférer sur/dans un milieu gélosé
adapté pour constituer une "culture stock"
qui sera repiquée a intervalles réguliers
sur/dans un milieu frais. Il est primordial de
conserver de telles cultures à l'état
ascénique (culture pure).

23.  Généralement il y a 02 types de gélose
plus utilisées pour la conservation
1-Une gélose nutritive inclinée
ensemencée en plusieurs points.
2-Une gélose nutritive en culot
ensemencée par piqure centrale.

24.  Des exemples de milieu de conservation :
A- Une gélose de type VF (milieu complexe gélosé
utilisé pour la détermination du type respiratoire
des microorganismes) en particulier pour les
bactéries anaérobies stricts.
Leur composition:
Viande foie………30g
Glucose ………….02g
Agar Agar………...06g
Eau distillée…….1000ml
PH ……………….. 7.4
-Le gradient de pression partielle en oxygène peut
permettre une conservation optimale de
certaines souches aéro-anearobies.

25. B- L'utilisation de bio-Rad qui distinguer a la
conservation des entérobactéries mais
aussi des vibrionaceae, du
Pseudomonaceae…
-Leur composition chimique (en g/l):
Extrait de viande…..…5
Peptone ……………..10
Chlorure de sodium ......5
Agar …………………10
Ph……………………7.3
Température ………..25 C0

26.  *Ces milieux est disponible en tube prêts.
Pour les bactéries aéro-anaerobies
facultatives, utiliser une culture sur milieu
gélosé (gélose nutritive on gélose
tryplicase soja) a l'aide d'une anse de
platine bien chargée en germes effectuer
plusieurs piqures centrales.
-Pour les bactéries aérobies ensemencer en
surface incubé à 37C0 maximum pendant
24 heures.

27.  *Les milieux de culture continue :
Définition :
C'est un phénomène de renouvellement
régulier de milieu de culture avec
l’élèmentation des métabolites toxique
en même temps.
Par exemple: Chimiostat

29.  Par l'utilisation de l'azote liquide à -196
C0des souches se microorganismes
exigeants ont ainsi été conservées
pendant plus de 15 ans.

31.  Définition :
Est la transplantation d'une culture pure
sur un milieu de culture neuf.

32.  Il est nécessaire de bien connaitre le
milieu le plus convenable: la
température la plus favorable et la durée
de stockage.
 La dessiccation du milieu de culture est
évitée en bouchant saignement l'orifice
des tubes de cultures.
 La culture est conservée à l'abri de la
lumière on à la température de
laboratoire.

33.  Remarque :
La conservation se fait naturellement par la
sporulation des bactéries capable de
sporulées pour éviter leur destruction dans
les conditions défavorables.
Comme chez les Endospores Bacillus qui
est Thermorésistantes a la chaleur humide
et les Exospores des Streptomyces qui ne
possède pas un thermorésistantes a la
chaleur humide mais quand même du
solide sur de très longues durée.

34. Souche Mode de conservation Température de
bactérienne conservation
Staphylocoque Gélose stock + Température
congélation ambiante, -20 C0
Pseudomocoque Congélation -20 C0, -80 C0
Neisseria Congélation -20 C0
gonorrhoeae
Entérobactéries Gélose stock + Température
congélation ambiante, -20 C0
Listeria Gélose stock + Température
congélation ambiante, -20 C0

35.  La conservation des champignons, y
compris les dermatophytes, peut se faire
de la même façon, que pour les
bactéries. Une gélose Sabouraud (milieu
complexe gélosé, pour l'isolement des
champignons).
 Conservée à température ambiant et à
l'obscurité convient généralement.

36.  Dans le cas de champignon provenant
de produits pathologiques, il faut se
méfier de l'éventuelle présence
d'acariens qui risquent d'envahir, le
souchier. Une quarantaine et des
repiquages fréquents permettront d'éviter
cette désagréable présence. Il est
possible aussi de mettre de l'antimite
dans le souchier.

37.  Généralement par l'utilisation de
lyophilisation.

38. 1- Dans le domaine de génie biologique :
 Par exemples: une souche destinée a la
production industrielles d'antibiotique ou
d'une molécule a très haute valeur ajoutée.
 Conserver les caractéristiques d'intérêt
biotechnologique pour tous l’inoculum qui
devant être gérés pendant la période
d'exploitation de la souche.
 Pour limitées la contamination par les
espèces microbienne dangereuses….

39. 2- En médecine :
 La conservation d’une souche isolée sur
un patient et transmise pour étude
complémentaires. (Études des réactions
particulières vis s vis d’antibiotiques)

40.  La conservation est une méthode nécessaire et
étape importante dans le protocole d'études des
souches microbienne pour le but de :
1-La fabrication des vaccins qui rend aussi
nécessaire pour la conservation des souches
vaccinales.
2-La recherche et comme un centre de référence.
3-L'étude dans le domaine de contrôle de qualité.