1. LES COSMIDES

2. Dans le phage lambda, on peut introduire un fragment
d'ADN eucaryotique de 15 à 20 kb. Cependant, certains
gènes ont une taille supérieure à 20 kb. D'autre part, il
est parfois nécessaire d'isoler et d'analyser une portion
d'ADN chromosomique qui contient une famille de gènes.
La famille des gènes de globine s'étend sur 70 kb et des
familles plus complexes peuvent occuper plusieurs
centaines de kb.
C'est pourquoi on a mis au point le clonage dans les
cosmides .

3. 1-DÉFINITION
Cosmide: site cos du phage + plasmide
→ Clonage de fragment de 45 kb maximum
(capacité ×3)
Sites cos
→ Encapsidation in vitro
→ Particules virales capables d'infecter E. coli
(efficacité > transformation)
Origine de réplication plasmidique
→ Multiplication dans la bactérie de la même
façon qu'un plasmide

4. 2-STRUCTURE
-un gène de résistance à un ou plusieurs
antibiotiques
-une origine de réplication de plasmide
-un ou plusieurs sites de restriction
unique(s) pour le clonage (polylinkers ou
MCS)
-une ou deux séquences cos
-une petite taille : environ 6 kb

5. FIGURE 1: STRUCTURE DE COSMIDE AVEC UN
SEUL COS .

6. 3-ETAPES DU CLONAGE DANS UN COSMIDE
Il existe deux stratégies de clonage associées à deux
cosmides différents. Ces stratégies ne diffèrent
que dans la structure et l’arrangement des signaux
cos dans les cosmides:
 Cosmide à une séquence cos : ce type de cosmide
ne contient qu’une seule séquence cos. Il
correspond à la première génération de cosmides. Il
nécessite une sélection de la taille des inserts afin
de limiter les phénomènes de co-ligation.

7.  Cosmide à deux séquences cos : dans ce
type de cosmide, les sites cos sont
répliqués en tandem. Ils permettent un
clonage rapide et efficace des
inserts, sans présélection sur leur taille.

8. PRINCIPE
La construction d’une banque d’ADN
génomique à partir de cosmides revient à
cloner l’ensemble d’un génome par
fragments dans des cosmides. Le principe
général de cette technique a été établi à
partir des premiers cosmides, contenant
une seule séquence cos (cosmide simple
cos).
 Les grandes étapes sont les suivantes :

9. 1-FRAGMENTATION D’ADN :

10. 2-FRAGMENTAION DE COSMIDE
Parallèlement à la digestion de l’ADN
génomique, le vecteur est linéarisé par
une enzyme de restriction à site
unique, qui coupe dans le multisite de
clonage. L’enzyme BamHI est couramment
utilisée.

11. 3-LIGATION
 Les vecteurs linéarités et les inserts d’ADN génomiques
sélectionnés sont ensuite mélangés pour la légation.
 Celle-ci est effectuée grâce à la T4 DNA ligase. Cette étape
doit être réalisée à haute concentration d’ADN pour favoriser
les associations intermoléculaires par rapport aux associations
intramoléculaires.
 Des concatémères se forment par l’association, par exemple
d’un ADN g entouré de deux cosmides linéarisés. Cette ligation
est possible par la complémentarité des bouts collants générés
par MboI et BamHI.


12. 4-ENCAPCIDATION
 Le vecteur recombinant est alors encapsidé in vitro comme
celui d’un phage à partir des extraits de capsides préparés
préalablement in vitro ou d’extraits commerciaux .
 Décongelés et mélangés, les extraits complémentaires sont
mis en présence des cosmides recombinants, ce qui active
la machinerie pour l’assemblage de la tête de phage et
l’insertion d’ADN.
 Cet empaquetage se fait dans une capside vide de
bactériophage grâce à la reconnaissance des deux sites
cos séparés d’environ 40 kb.

13. 5- INFECTION ET MULTIPLICATION.
 Les bactéries hôtes (E.coli souche DH5α)
sont ensuite infectées par le vecteur.
 Une fois dans la bactérie, le cosmide se
réplique comme un plasmide car il ne possède
pas les gènes du phage nécessaires à la
production de nouvelles particules phagiques.

14. 6- SÉLECTION DES COSMIDES RECOMBINANTS
 Les bactéries contenant les cosmides sont
sélectionnées sur la base de leur
résistance à un antibiotique (gène de
sélection présent sur le cosmide).
 Seules les bactéries ayant intégrées un
cosmide seront résistantes et pourront
pousser sur ce milieu.

15. FIGURE 2 : MODE D'EMPLOI D'UN COSMIDE POUR LA
CONSTITUTION D'UNE BANQUE.

16.  Les cosmides ont donc l’avantage sur les autres vecteurs de clonage
d’accepter de plus grands fragments d’ADN et sont surtout utiliser
pour caractériser des génomes.
 Dans le projet d’analyse génomique à grande échelle, les cosmides
pourraient être utilisés pour la cartographie physique détaillée, pour
convertir des contigs YAC en contigs cosmides, ainsi que pour les
cartes de restriction ou l’isolement de gènes, l’analyse cytogénétique
par hybridation in situ haute résolution et d’autres stratégies
encore…