1. Microbiología de los Alimentos Dr. Prof. Alejandro Dinamarca Facultad de Farmacia Universidad de Valparaíso

2. Tipos de Contaminación Biológica Nemátodos, protozoos Genes, proteínas Bacterias Hongos

5. Parásitos intestinales del tipo nemátodos, platelmintos y protozoos. Giardia lamblia Entamoeba histoytica Trichuris trichura Ascaris lumbricoide Taenia saginata (vacuno) Taenia solium (cerdo) Anisaki Protozoos Nemátodos (gusano) Nemátodos (gusano) Platelminto (gusano plano)

6. Ciclo de vida de Giardia

7. Ciclo de vida de Ascaris

8. Ciclo de vida de Tenia

12. TOXINAS BACTERIANAS

18. Toxina Estable pH ácido y pepsina de estómago Activada por tripsina Absorción linfática Impide liberación de ACh en nervios periféricos colinérgicos Signos aparecen entre 2 h a 6 días. Nauseas, vómitos y diarrea Dolor de cabeza, sequedad de boca, visión borrosa o doble. Parálisis facial y luego descendente Parálisis de músculos respiratorios y muerte.

19. Prevención Buenas Practicas de Fabricación Ebullición por 3 min Calentamiento a 80°C por 30 min Uso de sal y polifosfatos Compuestos antimicrobianos Nisina y Nitritos Procesos de Ahumado Presencia de Ac. Láctico Antitoxina

30. O157 H7 Colitis hemorragica; Sindrome hemolítico uremico (HUS) Entero hemorragica (EHEC) O6 H- Diarrea Secretoria Enterotoxigénica (ETEC) O26 H111 Diarrea Infantil EnteroPatogenica (EPEC) Serotipo Enfermedad Grupo

31. E. coli

34. Agentes Causales según Alimento Involucrado. Región Metropolitana

35. Vibrios en cultivo de agar TCBS

36. Vibriosis

40. Afecciones al tracto gastrointestinal superior Tiempo de inoculación a síntomas 1-6 h ó 2-4h 8-16 h (emésis en 2 a 4 h) Síntomas Nausea, vómitos, diarrea, dolor abdominal, postración. Vómitos, calambres abdominales, diarrea, nauseas. Patógeno/toxina Staphylococcus aureus (toxina) Bacillus cereus (toxina)

41. Afecciones al tracto gastrointestinal inferior Tiempo de inoculación a síntomas 2-36 h, promedio 6-12 h 12-74 h (18 a 36 h) Síntomas Calambres abdominales, diarrea, diarrea putrefacta asociada a C. perfringens, a veces náuseas y vómitos. Calambres abdominales, diarrea, vómitos, fievre, nausea, dolor de cabeza, diarrea mucosa, lesiones cutaneas (V. vulnificus). Yersinia se mimetiza con apendicitis o resfrios. Patógeno/toxina Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium. Salmonella spp., Shigella, Escherichia enteropatogénicas, Vibrio parahemolityticus, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, V. cholerae, V. Vulnificus, V. fluvialis

42. Afecciones neurológicas Tiempo de inoculación a síntomas 0.5-2 h 2-5 min a 3-4 h 30 min a 2-3 h Síntomas Comezón, bochornos, entumecimiento, incoherencia, parálisis respiratoria. Sensación de frió y calor, entumecimiento de labios,lengua y garganta, dolor muscular, diarrea y vómitos. Nausea, vómitos, dolor abdominal, fiebre. Patógeno/toxina Saxitoxina, Toxina paralizante (VPM). Mariscos Bevretoxina, Neurotoxina. Mariscos. Toxina diarréica (VDM). Mariscos.

43. Contaminación Biológica Fuentes de Contaminación Biológica Aire Suelo Animales

44. Salud!!!

46. MECANISMOS DE CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA CONTAMINACIÓN DE ORÍGEN CONTAMINACIÓN CRUZADA Carga microbiana Materias primas Procesamiento Producción Almacenamiento Transporte Venta Adquisición de organismos Materias primas Producto terminado Indica riesgo Indica riesgo Riesgo

47. Como evitar la contaminación cruzada. La contaminación cruzada es aquella que se produce cuando los microbios presentes en los alimentos crudos, utensilios y superficies contaminadas, se expanden hacia los alimentos cocidos o higienizados. Separe siempre los alimentos crudos de los que ya han sido cocidos y/o se encuentren listos para comer. Tenga cuidado al preparar alimentos en los cuales exista una combinación de crudos y cocidos. Conserve los alimentos en recipientes separados para evitar el contacto entre crudos y cocidos. En la heladera evite que los alimentos crudos goteen sobre el resto de sus preparaciones, para ello cúbralos o guárdelos en un recipiente. También es importante no usar, para alimentos cocidos, utensilios como cuchillos o tablas para cortar que se hayan utilizado en la preparación de los alimentos crudos, o que no hayan sido debidamente higienizados.

48. Tipos de daños producidos por contaminación biológica Biodeterioro Salud Intoxicación Infección Economía Directos Indirectos Desequilibrio nutricional Extrinsecos Intrinsecos Directos Indirectos

49. Biodeterioro Extrinsecos Intrinsecos Factores abióticos: Temperatura Luz Agua pH Factores bióticos: Carga Microbiana Contaminación ambiental Características Físico-químicas de los alimentos: Contenido de proteínas Carbohidratos Lípidos

50. Biodeterioro Extrinsecos Intrinsecos Salud Proliferación Microbiana Intoxicación Infección Alteración Bioquímica Intoxicación

51. Biodeterioro Extrínsecos Intrínsecos Daño económico Proliferación Microbiana Alteración (Física-organoléptica) Riesgo Salud Alteración Bioquímica Alteración (Física-organoléptica) Riesgo Salud Almacenamiento Cadena de frío Manipulación

52. Análisis de microorganismos en alimentos Verificar la presencia y cantidad Identificar el tipo o grupo de microorganismo Cuantificar la cantidad de microorganismos

53. Tipo o grupo de microorganismo Patógeno No Patógeno Vasta con verificar su presencia Indica riesgo o contaminación Indica deterioro

54. ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS Recuento.

57. 9 ml de solución salina de dilución 1 ml 1 ml 1 ml Dilución 10 –1 10 –2 10 –3 10 -4 0.1 ml de inóculo Incubar a T º adecuada por 24 horas

58. 9 ml de solución salina de dilución 1 ml 1 ml 1 ml Dilución 10 –1 10 –2 10 –3 10 -4 0.1 ml de inóculo 14 colonias Número de microorganismos por ml = Nº de colonias X inóculo X Factor de dilución (1/dil) UFC/ml (g).

60. BACTERIAS COLIFORMES Coliformes totales: Son aquellas bacterias de morfología bacilar, Gram negativas, aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa negativas, no esporógenas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y de gas a 37°C en un tiempo máximo de 48 horas. Este grupo comprende los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter , pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. COLIFORMES FECALES : Bacterias coliformes de origen fecal son aquellas comprendidas en el grupo anterior, que además son capaces de fermentar la lactosa, con producción de ácido y de gas a 44°C, en un tiempo máximo de 24 horas. Método de los tubos múltIples ( NMP = número más probable ). Este método podrá utilizarse para cualquier tipo de agua y será el procedimiento oficial obligatorio en casos de litigio. Fundamento : Determinación del número de coliformes mediante siembra de distintos volúmenes del agua a analizar en series de tubos con caldo lactosado y resiembra en medios de cultivo selectivos incubando a temperaturas adecuadas. El procedimiento comprende las pruebas: presuntiva, de confirmación de coliformes totales y de confirmación de coliformes fecales. Medio de cultivo : -Caldo lactosado -Agar- lactosa- eosina- azul de metileno ( EMB, Medio de Teague- Levine ) -Medio Irquido lactosado con sales biliares y fosfatos ( EC, Medio Hajna- Perry )

62. Prueba de confirmacion de coliformes totales . Es un procedimiento mediante el cual una reacción negativa excluye la presencia del grupo coliforme mientras que una reacción positiva indica su presencia inequívoca y deben someterse a esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva. Técnica : Se resiembran en placa de Petri con medio EMB los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva, se incuban en estufa a 37°C (± 1°C ) las placas invertidas durante 24 h (± 2 h ) Sobre este medio las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias características opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta oscuro con o sin reflejo metálico. Las colonias distintas de las descritas corresponden a bacterias no fermentadoras de la lactosa. Lectura e interpretación de resultados : Si en la placa de medio Teague-Lévine no se han desarrollado colonias o bien las que han aparecido no son fermentadoras de lactosa con producción de gas, la prueba de confirmación es negativa. Para el cálculo del NMP de coliformes totales se contabilizarán como positivos aquellos tubos de la serie elegida que hayan dado una prueba de confirmación positiva

63. Prueba de confirmación de coliformes fecales Es un procedimiento mediante el cual una reacción negativa excluye la presencia de coliformes fecales, mientras que una reacción positiva indica su presencia inequívoca. Deben someterse a esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva. Técnica. Esta prueba debe llevarse a cabo simultáneamente a la de confirmación de coliformes totales. Resembrar cada tubo positivo de la presuntiva en medio EC mediante un asa o dos gotas de pipeta Pasteur. Llevar a estufa o baño maría antes de transcurrir 30 minutos. Incubar a 44°C (± 0,5°C) durante 24 h (± 2 h ) Lectura e interpretación. Si se observa crecimiento bacteriano con producción de gas a las 24 h o antes, la presencia de bacterias coliformes fecales se considerará confirmada. Para el cálculo del NMP de coliformes fecales se contabilizarán como positivos aquellos tubos de la serie que hayan dado prueba de confirmación positiva.

64. Muestra de agua o sólido diluído 10 ml 1 ml 0,1 ml Se inoculan 15 tubos de medio lauryl sulfato, cada uno con una campana Durham. Los 5 primeros tubos se inoculan cada uno con 10 ml Los 5 segundos con 1 ml cada uno Los 5 últimos con 0,1 ml Los tubos se inoculan a 35 º C durante 24 +/- 2 horas.

65. Muestra de agua o sólido diluído 10 ml 1 ml 0,1 ml 24 hrs 35 º C Coliformes totales Se da por resultado positivos aquellos tubos turbios y con producción de gas

66. Muestra de agua o sólido diluído 10 ml 1 ml 0,1 ml 24 hrs 37 º C Coliformes totales 4 4 1

67. Prueba confirmatoria de coliformes totales Cada tubo postivo de lauryl se inocula en un tubo de medio Bilis Verde Brillante, cada uno con una campana Durham. Los tubos se incuban a 35 º C por 24 / 48 horas.

68. Prueba confirmatoria de coliformes totales 3 3 0

69. Prueba confirmatoria de coliformes fecales Para determinar la presencia de bacterias coliformes fecales, cada uno de los tubos confirmatorios para Coliformes totales se inocula en medio caldo EC y se incuba a 42 º C por 24 horas.

71. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

74. PRUEBAS BIOQUÍMICAS OXIDASA

75. PRUEBAS BIOQUÍMICAS CATALASA

76. PRUEBAS BIOQUÍMICAS UTILIZACIÓN DE AZÚCARES LACTOSA

78. Resultados de la prueba TSI/HIERRO KLIGLER  K / A = superficie alcalina (color fucsia) sobre fondo ácido (amarillo): el microorganismo es capaz de usar sólo la glucosa . En la superficie del tubo la glucosa es degradada aeróbicamente (vía oxidativa). A las 24 h, tiempo requerido para la lectura de esta prueba, la glucosa ha sido agotada y el microorganismo comienza a usar las peptonas, con lo cual el medio se alcaliniza dando una superficie de color fucsia. En el fondo del tubo, la glucosa es fermentada produciéndose ácidos estables, por lo tanto se observa un fondo amarillo.  A / A = superficie ácida (amarillo) sobre fondo ácido (amarillo): el microorganismo es capaz de usar ambos azucares . Después de 24 h, cuando el microorganismo a usado toda la glucosa comienza a usar la lactosa. Debido a que éste azúcar está 10 veces más concentrado, aún no se ha consumido totalmente, por lo que el medio se mantiene ácido (color amarillo).  K / K = superficie alcalina (fucsia) sobre fondo alcalino (fucsia): el microorganismo no usa ninguno de los dos azúcares , por lo que usa directamente las peptonas del medio. Si el microorganismos puede usar este compuesto tanto aerobia como anaeróbicamente, el resultado es K/K. Por el contrario, si sólo usa las peptonas aeróbicamente el resultado es K/sin cambio (fucsia/rojo).

80. PRUEBAS BIOQUÍMICAS UTILIZACIÓN DE AZÚCARES LACTOSA

81. PRUEBAS BIOQUÍMICAS UTILIZACIÓN DE CITRATO

83. PRUEBAS BIOQUÍMICAS UREA

86. Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos(ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Rojo Metilo y Voges-Proskauer

92. HACCP INFECCIONES INTOXICACIONES MICROORGANISMOS TOXINAS Materias primas Procesos Productos terminados Manipuladores Disminuir/Eliminar Disminuir/Eliminar