Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”
- 1. Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen
Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen
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- 2. Mesenchymale Stammzellen (MSZ)
• Stammzellnische (Knochenmark, Knorpel, Fettgewebe, Blut u. a.)
• chemische Signale
• Zellform
• mechanische Signale
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à regenerative Medizin
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- 3. Zielstellung
Hat die Modifikation des Aktinzytoskeletts durch
Inhibitoren Einfluss auf die Mechanotransduktion in
MSZ?
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- 4. Zielstellung
Hat die Modifikation des Aktinzytoskeletts durch
Inhibitoren Einfluss auf die Mechanotransduktion in
MSZ?
• humane MSZ aus dem Knochenmark
• Modifikation des Aktinzytoskeletts
• mechanische Stimulation
• Signaltransduktion (ERK und AKT)
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- 5. Zytoskelett
Aktinfilamente
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- 6. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion
Integrin
Fokale Adhäsionskinase
Vinculin
Aktin
modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm
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- 7. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion
Integrin
Fokale Adhäsionskinase
Vinculin
Aktin
modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm
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- 8. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion
Integrin
Fokale Adhäsionskinase
Vinculin
P
Aktin
modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm
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- 9. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion
Integrin
Fokale Adhäsionskinase
Vinculin
P
Aktin
ERK1/2
P
modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm
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- 10. Fokaladhäsion und Mechanotransduktion
Integrin
Fokale Adhäsionskinase
Vinculin
P
Aktin AKT
P
ERK1/2
P
modifiziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm
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- 11. Aktin und Inhibitoren
Jasplakinolid
G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D
Latrunculin A
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- 12. Aktin und Inhibitoren
Jasplakinolid
G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D
Latrunculin A
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 6
- 13. Aktin und Inhibitoren
Jasplakinolid
G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D
Latrunculin A
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 6
- 14. Aktin und Inhibitoren
Jasplakinolid
G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D
Latrunculin A
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- 15. Aktin und Inhibitoren
Jasplakinolid
G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D
Latrunculin A
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- 16. Verwendung der Inhibitoren
• Konzentrationen ohne Beeinträchtigung der Zellvitalität
• Jasplakinolid: 0,01 µM
• Cytochalasin D: 0,5 µM
• Latrunculin A: 0,1 µM
• Kontrolle: 0,1 % DMSO
0,01 µM 0,1 µM
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- 17. Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett
0,01 µM 0,1 µM
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- 18. Kontrolle (DMSO)
Jasplakinolid 0,01 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Jasplakinolid
0,01 µM
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- 19. Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett – Cytochalasin D
0,01 µM 0,1 µM
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- 20. Kontrolle (DMSO)
Cytochalasin D 0,5 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Cytochalasin D
0,01 µM 0,1 µM
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 9
- 21. Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett – Latrunculin A
0,01 µM
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 10
- 22. Kontrolle (DMSO)
Latrunculin A 0,1 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Latrunculin A
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 10
- 23. Mechanische Stimulation
MSZ
Integrine
Paramagnetische
Mikrobeads
= 0,2 nN / Bead
modifiziert nach Kasten et al., 2010
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
- 24. Mechanische Stimulation
MSZ
Integrine
Paramagnetische
Clustern Mikrobeads
= 0,2 nN / Bead
modifiziert nach Kasten et al., 2010
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
- 25. Mechanische Stimulation
MSZ
Integrine
Paramagnetische
Clustern Mikrobeads
= 0,2 nN / Bead
modifiziert nach Kasten et al., 2010
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
- 26. Mechanische Stimulation
MSZ
Integrine
Paramagnetische
Clustern Mikrobeads
= 0,2 nN / Bead
Reiz
modifiziert nach Kasten et al., 2010
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 11
- 27. Aktivierung von ERK und AKT
Magnetfeld
Kontrolle
Clustern
Reiz
mit DMSO
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- 28. Aktivierung von ERK und AKT
Magnetfeld
Kontrolle
Clustern
Reiz
mit DMSO
B 800
**
700
phERK
600
**
Intensität in %
500
400 DMSO 0,1 %
300 Jasp 0,01 µM
200
p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 12
- 29. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid
Magnetfeld
Magnetfeld
Kontrolle
Kontrolle
Clustern
Clustern
Reiz
Reiz
mit DMSO Jasplakinolid 0,01 µM
B 800
**
700
phERK
600
**
Intensität in %
500
400 DMSO 0,1 %
300 Jasp 0,01 µM
200
p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 12
- 30. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid
Magnetfeld
Magnetfeld
Kontrolle
Kontrolle
Clustern
Clustern
Reiz
Reiz
mit DMSO Jasplakinolid 0,01 µM
B 800
**
700
phERK
600
**
Intensität in %
500
400 DMSO 0,1 %
300 Jasp 0,01 µM
200
p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 12
- 31. Aktivierung von ERK und AKT
C 700
**
600
phAKT
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
300
**
Jasp 0,01 µM
200
p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 13
- 32. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid
C 700
*
600
phAKT
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
300
*
Jasp 0,01 µM
200
p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 13
- 33. Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid
C 700
*
600
phAKT
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
300
*
Jasp 0,01 µM
200
p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 13
- 34. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D
Magnetfeld
Magnetfeld
Kontrolle
Kontrolle
Clustern
Clustern
Reiz
Reiz
mit DMSO Cytochalasin D 0,5 µM
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 14
- 35. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D
Magnetfeld
Magnetfeld
Kontrolle
Kontrolle
Clustern
Clustern
Reiz
Reiz
mit DMSO Cytochalasin D 0,5 µM
B
700 *
*
600
phERK
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
300
CytoD 0,5 µM
200
100 p ≤ 0,1
0
**p ≤ 0,05
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 14
- 36. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D
C
700
*
600
phAKT
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
**
300
CytoD 0,5 µM
200
100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz
n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 15
- 37. Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D
C
700
*
600
phAKT
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
**
300
CytoD 0,5 µM
200
100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz
n=3
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK
• Hemmung der Aktivierung von AKT nach Zugstress
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 15
- 38. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A
Magnetfeld
Magnetfeld
Kontrolle
Kontrolle
Clustern
Clustern
Reiz
Reiz
mit DMSO Latrunculin A 0,1 µM
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 16
- 39. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A
Magnetfeld
Magnetfeld
Kontrolle
Kontrolle
Clustern
Clustern
Reiz
Reiz
mit DMSO Latrunculin A 0,1 µM
B 700
**
600
phERK
500
*
Intensität in %
400
DMSO
300
LatA 0,1 µM
200
100 p ≤ 0,1
0
**p ≤ 0,05
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz
n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 16
- 40. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A
C 700
**
600
phAKT
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
300
**
LatA 0,1 µM
200
100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz
n=3
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 17
- 41. Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A
C 700
**
600
phAKT
500
Intensität in %
400
DMSO 0,1 %
300
**
LatA 0,1 µM
200
100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz
n=3
• komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 17
- 42. Zusammenfassung
Jasplakinolid
• verdickte Aktinbündel
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
Cytochalasin D
• Fragmentierung des Aktinzytoskeletts
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK
• Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung
Latrunculin A
• Aktinfilamente nicht mehr parallel
• komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
- 43. Zusammenfassung
Jasplakinolid
• verdickte Aktinbündel
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
Cytochalasin D
• Fragmentierung des Aktinzytoskeletts
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK
• Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung
Latrunculin A
• Aktinfilamente nicht mehr parallel
• komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
- 44. Zusammenfassung
Jasplakinolid
• verdickte Aktinbündel
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
Cytochalasin D
• Fragmentierung des Aktinzytoskeletts
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK
• Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung
Latrunculin A
• Aktinfilamente nicht mehr parallel
• komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
- 45. Zusammenfassung
Jasplakinolid
• verdickte Aktinbündel
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
Cytochalasin D
• Fragmentierung des Aktinzytoskeletts
• keine Hemmung der Aktivierung von ERK
• Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung
Latrunculin A
• Aktinfilamente nicht mehr parallel
• komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
- 46. Fazit
• Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können
die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von
ERK und AKT hemmen
• allerdings führte eine strukturelle Modifikation des
Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der
Signaltransduktion
• das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb
des gesamten Zytoskeletts
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
- 47. Fazit
• Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können
die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von
ERK und AKT hemmen
• allerdings führte eine strukturelle Modifikation des
Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der
Signaltransduktion
• das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb
des gesamten Zytoskeletts
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
- 48. Fazit
• Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können
die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von
ERK und AKT hemmen
• allerdings führte eine strukturelle Modifikation des
Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der
Signaltransduktion
• das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb
des gesamten Zytoskeletts
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
- 49. Fazit
• Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können
die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von
ERK und AKT hemmen
• allerdings führte eine strukturelle Modifikation des
Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der
Signaltransduktion
• das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb
des gesamten Zytoskeletts
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
- 50. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 20
- 51. Quellen
• Caplan AI (2009) Why are MSZs therapeutic? New data: new insight. J Pathol 217(2): 318-24
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activates vinculin binding. Science 323(5914): 638-41
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signaling networks, the starting point of cellular movement. Cell Mol Life Sci 62(9): 955-70
• Discher DE, Mooney DJ und Zandstra PW (2009) Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.
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• Horwitz A, Duggan K, Buck C, Beckerle MC und Burridge K (1986) Interaction of plasma membrane fibronectin receptor
with talin-a transmembrane linkage. Nature 320(6062): 531-3
• Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Deans RJ, Krause DS und Keating A (2005)
Clarification of the nomenclature for MSZ: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 7(5):
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• Kasten A, Müller P, Bulnheim U, Groll J, Bruellhoff K, Beck U, Steinhoff G, Möller M und Rychly J (2010) Mechanical Integrin
Stress and Magnetic Forces Induce Biological Responses in Mesenchymal Stem Cells Which Depend on Environmental
Factors. J Cell Biochem 111(6): 1586-97
• Pantaloni D, Le Clainche C und Carlier MF. (2001) Mechanism of Actin-Based Motility. Science 292(5521): 1502-6
• Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S und Marshak
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19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 18
- 52. Quellen
• Scadden DT (2006) The stem-cell niche as an entity of action. Nature 441(7097): 1075-9
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organization and affect cell growth: I. Comparison with cytochalasin D. Cell Motil Cytoskeleton 13(3): 127-44
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• www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 19
- 53. Anhang
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
- 54. Anhang
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- 55. Kontrolle (ohne DMSO)
Kontrolle (mit DMSO) DMSO – Morphologie und Aktinzytoskelett
0,01 µM 0,1 µM
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- 56. Jasp und Lat A – Morphologie
Kontrolle (ohne DMSO) Jasplakinolid 0,01 µM Jasplakinolid 0,1 µM
Kontrolle (mit DMSO) Latrunculin A 0,01 µM Latrunculin A 0,1 µM Latrunculin A 0,5 µM
0,01 µM 0,1 µM
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- 59. Vitalitätstest – MTS / KV
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- 60. Schematischer Ablauf des Integrinreizes
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- 61. Coomassie
Latrunculin A
Jasplakinolid
Cytochalasin D
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
- 62. Kontrolle
2100
**
**
1800
1500
phERK
Intensität in %
1200
EM
**
900 DMSO 0,1 %
600
300
0
K Cl MF Reiz
19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach
- 63. Kontrolle
600
**
500
400
**
phAKT
Intensität in %
EM
300
DMSO 0,1 %
200
100
0
K Cl MF Reiz
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