PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU
MEDICINA FETAL
Capítulo 1PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO
PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO
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PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO
Seção 1
FATOR ANATÔMICO
Ana Letícia S. Pontes  ...
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Existe uma grande variedade de classificações para essas malformações e alg...
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população de mulheres portadoras de anomalias müllerianas e encontrou uma i...
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A incidência dessas malformações está estimada em aproximadamente 1:200 a 1...
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2 Lesões Miometriais
2.1 Miomas uterinos
Há inúmeras hipóteses a respeito d...
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a patologia determina. A história obstétrica mescla quadros de abortamentos...
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incisão sagital do septo para obtenção de uma cavidade uterina comum seguid...
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Nas sinéquias totais é necessária a realização de laparoscopia contemporâne...
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relatou que, de um grupo de 284 mulheres expostas ao dietilestilbestrol, 9 ...
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Um dos parâmetros utilizados para o diagnóstico da incompetência istmo-cer...
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O período ideal para a realização da circlagem profilática situa-se entre ...
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2 Calcificações Endometriais.
Feyles e cols. (2000) descreveram um caso on...
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Amaral, B. B. Abortamento. In: Pastore, A. R.; ...
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Hunter, R. G.; Henry, G. W.; Civin, W. H. The action of papain and bromela...
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Raga,F; Bauset,C; Remohi,J; Bonilla-Musoles,F; Simon,C; Pellicer,A. Reprod...
Seção 2
FATOR ENDÓCRINO
Laudelino Marques Lopes  Renato Augusto Moreira de Sá  Regina Amélia Pessoa de Aguiar
INTRODUÇÃO...
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Quando analisamos uma população de mulheres que apresentam abortamento de ...
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HIPERSECREÇÃO DE HORMÔNIO LUTEINIZANTE (LH)
Geralmente associada ao achado...
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provou ter benefícios em gestações subsequentes, assim sendo não se justif...
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ACOG practice bulletin. Management of recurr...
PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ENDÓCRINO
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15. Liddell HS; Sowden K; Farquhar CM. Recurrent miscarriage: screening fo...
Seção 3
INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DAS PERDAS GESTACIONAIS E
DOS CASAIS COM PERDAS REPETIDAS
Sérgio D.J. Pena  Helena B.B.L. M...
PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO
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Utilizando o exame cromossômico com cultura a curto termo de vilosidades co...
PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO
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Friedman e Gath11
entrevistaram 67 mulheres quatro semanas após um abortame...
PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO
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Os microssatélites são blocos de unidades repetitivas de DNA, contendo uma ...
PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO
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emergiram na Europa propostas de utilização da citogenética molecular pela ...
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1.5 Proposta desta revisão
Este capítulo faz a revisão da implantação no GE...
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gestacional era conhecida, incluindo 1008 perdas de primeiro trimestre e 88...
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2.5 Diagnóstico molecular da monossomia X (síndrome de Turner)
Quando os te...
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Tabela 1 – Estudo genético de abortamentos feito exclusivamente por citogen...
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citogenética convencional no Protocolo 2 foram encontrados anormalidades ca...
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3.3 Protocolo 3
O Protocolo 3, que inclui apenas estudos de citogenética mo...
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fazendo a coleta, que não haviam recebido informações adequadas, ou que não...
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3.5 Qual dos nossos protocolos é o ideal para estudo de abortamentos?
Em te...
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justificar investigações genéticas deles mesmos, embora, como já discutido ...
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de maior risco, fizemos a análise dos casos de acordo com o número de perda...
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mosaicismos de baixo grau representem uma manifestação de um aumento de eve...
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Simpson JL. Fetal wastage. In: Gabbe SG, Nieb...
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14. Mansfield ES. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using q...
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27. Raedle J, Brieger A, Trojan J, Hardt T, Herrmann G, Zeuzem S. Evaluatio...
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  1. 1. PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU MEDICINA FETAL Capítulo 1PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO
  2. 2. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 1 PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO Seção 1 FATOR ANATÔMICO Ana Letícia S. Pontes  Milton Saito INTRODUÇÃO Podemos classificar as causas anatômicas das perdas fetais de repetição em fatores relacionados às malformações do corpo uterino como as anomalias de fusão dos ductos de Müller, a presença de alterações miometriais adquiridas tais como os miomas e adenomiose, e alterações da cavidade endometrial, mais especificamente as sinéquias. Além desses fatores causais não podemos deixar de destacar a incompetência istmo-cervical (IIC) como responsável por aproximadamente 10 a 20% das perdas de fetos sem viabilidade sendo seu principal fator etiológico o trauma tocoginecológico. MALFORMAÇÕES UTERINAS 1 Anomalias dos Ductos de Müller As anomalias müllerianas representam um grupo de malformações congênitas resultantes da formação anormal, retardo no desenvolvimento ou fusão incompleta dos ductos de Müller. Com exceção das anomalias associadas à exposição intraútero do teratógeno diethilestilbestrol (DES), a etiologia dessas malformações permanece incerta. O DES é atualmente reconhecido como causa de malformações uterinas em mulheres cujas mães utilizaram essa substância durante o pré-natal. Essa droga era antigamente administrada no tratamento de perdas fetais de repetição, trabalho de parto prematuro e outras complicações obstétricas principalmente nos anos 40 e seu uso foi abandonado na década de 70 após sua comprovada associação com adenocarcinoma de vagina, porém sua potencial alteração na função reprodutiva perdurou ainda por pelo menos mais 10 a 15 anos. A anomalia uterina mais encontrada nessas mulheres é o útero em “T” (Propst, 2000). O corpo uterino é originado a partir da fusão dos dois ductos de Müller e alterações na embriogênese poderão determinar a duplicação parcial ou total do corpo do útero acompanhada ou não da duplicação do colo uterino ou vagina. 1
  3. 3. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 2 Existe uma grande variedade de classificações para essas malformações e algumas vezes podemos ter associadas anomalias renais ou agenesias gonadais. A Figura 1 mostra as principais alterações uni ou bilaterais, enquanto a Figura 2 traz aquelas principalmente envolvidas com as perdas fetais de repetição. Figura 1 - Agenesias do aparelho genital pela parada do desenvolvimento dos dois canais de Müller (formas bilaterais simétricas ou assimétricas) ou de um só canal de Müller (formas unilaterais) (redesenhado de CONTAMIN et al.). As malformações müllerianas há tempos são reconhecidas como causas de abortamentos ou perdas fetais e envolvem primariamente a cavidade uterina que se apresenta com suas dimensões reduzidas e funcionaria de maneira análoga ao que ocorre com as gestações múltiplas em úteros normais. Um estudo de Raga et al (1997) realizado em 2000 revisou todas as gestações de uma
  4. 4. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 3 população de mulheres portadoras de anomalias müllerianas e encontrou uma incidência de 25,5% de perdas precoces (antes de 13 semanas) e 6,2% de perdas tardias (entre 14 e 22 semanas) no grupo com útero septado. Um outro estudo de Blum (1978) sugere que a causa das perdas fetais poderia estar relacionada a alterações bioquímicas além do fator anatômico. Segundo este autor, os níveis séricos de cistino-aminopeptidase - enzima responsável pela neutralização da ocitocina - mostraram-se significativamente reduzidos em mulheres portadoras de anomalias müllerianas levando à ocorrência de contrações incoordenadas no útero malformado culminando com os abortamentos ou perdas fetais precoces por trabalho de parto prematuro. Figura 2 – Malformações resultantes de não fusão (úteros bicornes) ou da má fusão (úteros septados) dos canais de Müller (redesenhado de CONTAMIN et al.).
  5. 5. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 4 A incidência dessas malformações está estimada em aproximadamente 1:200 a 1:600 mulheres, segundo Patton (1994). O diagnóstico baseia-se fundamentalmente em história clínica e exame físico, além dos exames complementares listados na Tabela 1. Tabela 1 – Modalidades diagnósticas nas anomalias müllerianas Histerossalpingografia Ultrassonografia transabdominal Ultrassonografia transvaginal 2D e 3D Histeroscopia Laparoscopia A história clínica de abortamentos de repetição e em idades gestacionais cada vez mais adiantadas chama a atenção para a presença de útero septado ou bicorno. O exame físico combinando especular e toque vaginal poderá ser útil no diagnóstico de suspeita de útero bicorno ou didelfo na dependência da presença de septo vaginal ou duplicação do colo e alargamento do corpo uterino ao toque bimanual. A histerossalpingografia é o exame mais utilizado e é considerado o estudo mais importante para a identificação das malformações müllerianas sendo capaz de fornecer informações quanto às dimensões uterinas e de suas cavidades. Segundo estudo realizado por Portuondo et al (1986), o útero septado foi uma das duas principais anomalias encontradas em histerossalpingografias de pacientes com história de perdas fetais de repetição no primeiro e segundo trimestres, seguido do útero arqueado e bicorno. A histeroscopia é utilizada na identificação interna da cavidade uterina sendo bastante útil nos casos de útero septado. Porém é incapaz de diferenciar os úteros bicorno e septado sendo indicado nesses casos o exame combinado com laparoscopia que fornecerá as informações quanto à superfície externa do útero. As ultrassonografias transabdominal e transvaginal tem adquirido importância no diagnóstico das malformações uterinas, pois são exames não invasivos capazes de identificar pormenores que possam escapar ao exame clínico ou à histerossalpingografia, como por exemplo, a diferenciação entre útero septado e bicorno. A ultrassonografia 3D vem se tornando um exame bastante útil no estudo da morfologia uterina e sua principal vantagem em relação à ultrassonografia convencional é a melhor diferenciação entre os úteros arqueado, bicorno e septado, pois permite uma avaliação coronal do corpo uterino que é raramente vista com os aparelhos em 2D. A visão coronal permite ao ultrassonografista avaliar tanto a cavidade endometrial quanto o fundo uterino, permitindo desta forma um acesso mais completo da morfologia do útero.
  6. 6. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 5 2 Lesões Miometriais 2.1 Miomas uterinos Há inúmeras hipóteses a respeito da perda fetal de repetição causada pelos leiomiomas. Podemos ter pacientes assintomáticas em que estaremos apenas frente a um achado ultrassonográfico, porém são comumente descritas as complicações obstétricas que incluem abortamentos, parto prematuro, ruptura prematura de membranas e apresentações fetais anômalas. Dependendo das dimensões e localização do nódulo, ele poderá obliterar parcialmente ou modificar o contorno da cavidade uterina levando a alterações na vascularização endometrial que poderão dificultar a implantação ou comprometer o fluxo placentário posteriormente. Descrevem- se alterações venosas acompanhadas de padrões anormais de fluxo que poderiam ter efeito adverso no desenvolvimento do concepto. O diagnóstico é realizado através da suspeita pela história clínica e exame físico, sendo confirmado por exames complementares tais como a ultrassonografia, histeroscopia, histerossalpingografia e em alguns casos a laparoscopia. A paciente portadora de miomatose refere na grande maioria das vezes, história de ciclos menstruais abundantes e prolongados e a história obstétrica relata abortamentos repetidos ou perdas fetais precoces. O exame físico revela útero aumentado de volume e com superfície irregular, porém os exames subsidiários fornecerão as informações relevantes no que concerne à localização e tamanho dos nódulos. A ultrassonografia transvaginal é um exame bastante eficaz, pois permite avaliação minuciosa da parede e cavidade uterinas, bem como as dimensões de cada nódulo e sua localização aproximada. Nos casos de miomas submucosos, a histerossalpingografia poderá ser complementar ao adicionar informações quanto a lacunas e imagens de adição, delineando a cavidade endometrial. A histeroscopia tem como função o estudo da superfície endometrial demonstrando a repercussão das alterações miometriais sobre a cavidade uterina e a laparoscopia realizada simultaneamente à histeroscopia algumas vezes poderá complementar algumas informações sobre o aspecto externo do corpo uterino alterado pelos nódulos. 2.2 Adenomiose O miométrio afetado pela adenomiose apresenta alterações progressivas decorrentes da fibrose podendo interferir no processo da concepção de maneira semelhante ao que ocorre com os miomas. A paciente geralmente refere ciclos menstruais irregulares, com sangramentos abundantes acompanhados de dismenorreia, ambos causados pela alteração na contratilidade miometrial que
  7. 7. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 6 a patologia determina. A história obstétrica mescla quadros de abortamentos precoces e às vezes pré-clínicos, com perdas fetais mais tardias. Os exames complementares utilizados para confirmação diagnóstica são praticamente os mesmos acima citados para os miomas, destacando-se aqui a ultrassonografia transvaginal que muitas vezes é definitiva para diferenciar a miomatose da adenomiose e deste modo permitir um plano terapêutico mais adequado para cada caso. 3 Sinéquias Uterinas Sinéquias são definidas como aderências intracavitárias de extensão variável, levando a alterações endometriais que determinam a ausência de resposta do endométrio aos estímulos hormonais assim como a alteração na forma e dimensões da cavidade uterina causando interferência significativa na implantação do embrião e crescimento do útero ou por redução do espaço físico ou por deficiência na vascularização. As aderências também podem ser responsáveis pela obstrução dos óstios tubáreos impedindo a fertilização ou posterior nidação. Sua causa geralmente está relacionada a curetagens repetidas ou abortamentos infectados, além de endometrites e miomectomias nos quais a destruição de grandes fragmentos de tecido endometrial determina a aderência entre as faces (também chamada Síndrome de Asherman). Numa série de 1856 mulheres com diagnóstico de Síndrome de Asherman, Schenker e Margalioth (1982) relataram que 88% dos casos estavam associados à curetagem pós parto ou pós abortamento. A história clínica é bastante sugestiva com quadros de oligomenorréia ou amenorréia secundária geralmente após procedimentos cirúrgicos como os descritos acima, seguidos da queixa de infertilidade com abortamentos precoces e perdas fetais de repetição. O diagnóstico é feito através da histerossalpingografia na qual a ausência de contraste no interior da cavidade uterina poderá corresponder à sinéquia total ou apenas da região ístmica com cavidade normal, ou a presença de pontos isolados que serão melhor identificados através da histeroscopia. 4 Orientação Terapêutica A indicação cirúrgica na tentativa de restabelecer a anatomia uterina normal deverá ser considerada após avaliados alguns parâmetros. Nas pacientes com tratamento clínico utilizando relaxantes uterinos e repouso sem resultado satisfatório evoluindo para abortamentos repetidos sempre na mesma idade gestacional está caracterizada a impossibilidade de parto a termo, pois é sabido que geralmente uma gravidez melhora as condições da cavidade uterina para as próximas e que em alguns casos a infertilidade resolve-se naturalmente com várias gestações seguidas. A metroplastia nas malformações está indicada principalmente nos úteros septados e bicornos sendo infrequente a necessidade de intervenções nos úteros didelfos. As técnicas mais conhecidas são a metroplastia de Strassman e a histeroplastia de Bret-Palmer que consistem basicamente na
  8. 8. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 7 incisão sagital do septo para obtenção de uma cavidade uterina comum seguida de incisão com bisturi para acesso aos cornos separados, terminando com sutura em dois planos. A técnica de Bret-Palmer permite o mesmo resultado com menor lesão do miométrio, segundo Silveira (2000). Atualmente a técnica de correção do útero septado via abdominal tem sido considerada obsoleta devido a alta morbidade relacionada ao pós-operatório que inclui grande número de complicações, tais como redução do volume uterino, formação de sinéquias com posterior obstrução tubárea, aderências em cavidade abdominal, além das próprias complicações inerentes a qualquer lapatotomia, como maior tempo de hospitalização, necessidade de anestesia e analgesia e maior risco de infecção. Além disso, a metroplastia abdominal requer um maior intervalo para a próxima gestação (3 a 6 meses) e o dano cirúrgico causado à espessura total do miométrio principalmente em região fúndica está associado a um risco significativamente maior de ruptura uterina na gestação selando o futuro obstétrico da paciente já que é mandatória a realização de parto cesárea, segundo Homer et al (2000). A técnica abdominal tem sido substituída pela correção histeroscópica que utiliza a incisão do septo uterino a qual deve ser realizada de modo equidistante entre as paredes anterior e posterior do útero e se estender até o fundo, porém sem atingir o miométrio fúndico. A metroplastia histeroscópica tem se mostrado um método seguro e simples na correção do septo uterino, além de possuir inúmeras vantagens sobre a técnica abdominal que incluem redução na morbidade intra e pós-operatória, ausência de sequelas da laparotomia como aderências pélvicas e cicatriz abdominal, rápida convalescença com retorno às atividades habituais e ausência de danos ao miométrio fúndico, havendo chance de parto futuro por via vaginal. Nas pacientes com diagnóstico de miomatose, as indicações cirúrgicas seguem os mesmos critérios já descritos acima para as malformações müllerianas. A miomectomia deve ser o mais econômica possível na tentativa de minimizar os danos ao miométrio. Na revisão feita por Buttram e Reiter (1981), 1941 mulheres foram submetidas a miomectomia via abdominal com redução na taxa de abortamentos de 41 para 19% no pós operatório. A miomectomia via histeroscópica tem sido indicada nos casos de miomas submucosos utilizando-se ressectoscópio com excelentes resultados. As pacientes que engravidam após a cirurgia devem ser rigorosamente monitorizadas estando indicado o uso de miorrelaxantes, abstinência sexual e repouso principalmente no primeiro trimestre da gestação. Na adenomiose o tratamento cirúrgico é descrito como miometrectomia parcial nas áreas acometidas, porém os resultados são quase sempre a perda da capacidade contrátil do miométrio em graus variados, sendo a cirurgia por esse motivo, raramente indicada. O tratamento clínico da adenomiose é o mesmo utilizado para a endometriose utilizando-se drogas hormonais bloqueadoras do estrógeno como os análogos do GnRh. O tratamento das sinéquias baseia-se em sua ressecção via histeroscópica e medidas posteriores que possam evitar sua recidiva.
  9. 9. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 8 Nas sinéquias totais é necessária a realização de laparoscopia contemporânea devido à grande facilidade de falsos trajetos e perfuração uterina durante a histeroscopia. Após a reabertura da cavidade uterina utiliza-se um DIU para manter as superfícies afastadas evitando assim, novo acolamento. Pode-se utilizar também uma sonda de Folley com aproximadamente 5 ml de soro inflando o balão, mantendo assim as paredes afastadas. Nas sinéquias ístmicas o tratamento é bastante simples, pois a cavidade uterina encontra-se normal e após a ressecção da fibrose não é necessária a colocação de DIU ou balão de Folley. O mesmo ocorre nas sinéquias parciais em que o debridamento histeroscópico permite a verificação imediata do grau de acometimento da cavidade e do controle do tratamento realizado. O uso de estrógenos em altas doses após a lise das aderências é mais indicado nos casos de sinéquias totais ou parciais em múltiplos focos e antibioticoterapia tem sido descrita para aqueles procedimentos com tempo cirúrgico ou sangramento aumentados. INCOMPETÊNCIA ISTMO-CERVICAL A incompetência istmo-cervical foi a primeira causa amplamente aceita como causa de perda fetal de repetição. Desde o seu reconhecimento como um fator causal de perda de repetição, e graças aos esforços de Lash, Barter e Shirodkar, entre outros, a cerclagem cervical tem sido amplamente aceita para o tratamento desta alteração uterina. 1 Incidência Nas décadas de 50 e 60, a incidência de incompetência istmo-cervical se situava em torno de 3/1.000 nascimentos (Picot, 1958 e Baden, 1960). Um aumento desta incidência para 5/1.000 foi observado no John Hopkins Hospital na década de 80 (Rock, 1986), aparentemente não relacionado a um aumento do número de abortamentos eletivos. 2 Etiologia Três fatores principais têm sido descritos como causas da incompetência istmo-cervical: traumático, congênito e hormonal. Entre os fatores traumáticos estão: curetagem diagnóstica com dilatação cervical; laceração cervical após parto vaginal; cirurgia cervical como conizações cervicais profundas ou incisão de Duhrssen; amputação do colo; problemas de cicatrização após histerotomia (cesariana). Lesões cervicais durante abortamentos eletivos também tem sido sugeridos como um dos fatores etiológicos mais frequentes (Miyamoto, 1973; Liu, 1972; Wright, 1972). Um desequilíbrio na composição dos tecidos que compõem o colo uterino, com um percentual inadequado entre os tecidos musculares, fibroso e conectivo também foi sugerido como causador de incompetência istmo-cervical. Evidências clínicas tem mostrado que a incompetência istmo-cervical pode estar presente em mulheres cujas mães foram expostas ao dietilestilbestrol no início da gestação. Goldestein (1978)
  10. 10. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 9 relatou que, de um grupo de 284 mulheres expostas ao dietilestilbestrol, 9 engravidaram e 5 desenvolveram uma incompetência istmo-cervical. Desta forma, um acompanhamento mais frequente deve ser realizado durante a gestação destas pacientes, a fim de se diagnosticar e tratar adequadamente uma possível incompetência istmo-cervical. O risco relativo em relação ao grupo controle para abortamento é de 1,8 para abortamento espontâneo e 3,2 para trabalho de parto prematuro (Salomão, 1994). Alguns autores sugerem ainda que a junção istmo-cervical atue como um esfíncter funcional, que talvez se baseie em variações hormonais (Asplund, 1952). Mann (1961) e co-autores demonstraram um istmo hipotônico em mulheres com incompetência istmo-cervical, através do uso de um balão capaz de provocar uma expansão sequencial do corpo, istmo e colo. Eles observaram uma correlação próxima entre a hipotonia ístmica fora da gravidez e a incompetência istmo-cervical durante a gravidez. Hunter (1957) e co-autores demonstraram a influência relaxante da papaina e bromelina no colo. 3 Diagnóstico A investigação diagnóstica será realizada nas gestantes que apresentam história clínica característica, com perdas fetais no segundo e início do terceiro trimestre, com rotura de membranas e posterior eliminação do concepto, causadas por dilatação cervical indolor e não associada a contrações uterinas. A própria história clínica já sugere a patologia, cujo diagnóstico pode ser reforçado através dos seguintes exames complementares: teste da passagem de vela de Hegar nº. 8 pelo colo; histerossalpingografia na segunda fase do ciclo; histeroscopia; histerografia; teste de tração com cateter de Foley e 1 ml de água (pouco utilizado em nosso meio). Durante a gravidez, a ultrassonografia é o melhor método empregado no diagnóstico de incompetência istmo-cervical. Os parâmetros utilizados na ultrassonografia transvaginal são o comprimento do colo (o qual deve ser maior que 30 mm), diâmetro transverso do colo (não de ser maior que 20 mm) e largura do canal cervical (deve ser menor que 8 mm) (Amaral, 1997). Andrews e cols. (2000) realizaram a ultrassonografia transvaginal para avaliar o comprimento e aspecto anatômico do colo (presença ou não de afunilamento do colo) em mulheres que tiveram pelo menos um parto espontâneo anterior entre 16 e 30 semanas de gestação. Eles observaram que, nestas gestantes que já haviam tido um parto prematuro espontâneo anterior e apresentaram o comprimento do colo abaixo do percentil 10 (22 mm para a população estudada) (ou mesmo abaixo de 25 mm, medida relatada por Iams et al (1996) ou afunilamento do orifício interno do colo antes da 20ª semana de gestação, houve um risco aumentado de ter um subsequente parto prematuro espontâneo, antes de 35 semanas. Neste estudo, das 53 gestantes que realizaram a ultrassonografia transvaginal antes de 20 semanas e que apresentaram comprimento do colo abaixo de 25 mm ou afunilamento do colo (6 casos), todas tiveram um parto antes de 35 semanas. Outro fato relatado por eles é o de que, à medida que a idade gestacional aumentou, o comprimento médio do colo diminuiu na população estudada.
  11. 11. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 10 Um dos parâmetros utilizados para o diagnóstico da incompetência istmo-cervical é a observação da dilatação do orifício interno do colo, com a protrusão das membranas através do colo (sinal do dedo de luva)(Figura 3), antes mesmo que o orifício externo se apresente dilatado, que é um dos parâmetros clínicos para o diagnóstico da insuficiência istmo-cervical. Figura 3 - Sinal do dedo de luva ao ultrassom. 4 Tratamento O tratamento da insuficiência istmo-cervical é basicamente cirúrgico e consiste na realização de circlagem do colo uterino (Figura 4). Medidas terapêuticas, tais como a administração de progesterona, uterolíticos e repouso podem ajudar a melhorar os resultados da gestação. Figura 4 - Ponto de circlagem (setas) na região do colo.
  12. 12. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 11 O período ideal para a realização da circlagem profilática situa-se entre a 12ª e a 18ª semanas de gravidez (Salomão, 1994). Atualmente, a realização da ultrassonografia para avaliação de risco de anomalias cromossômicas (e malformações fetais) no final do 1º trimestre (avaliação de translucência nucal e doppler de ducto venoso) deve ser realizada antes da realização da circlagem. Caso tenhamos um rastreamento positivo, haverá ainda tempo hábil para a avaliação genética fetal (através da biópsia de vilosidades coriônicas ou da amniocentese) antes da realização da circlagem. Entre as técnicas de circlagem, a de McDonald (1957) tem sido a mais utilizada em nosso meio, pela facilidade técnica, tempo de duração do procedimento, menor risco de rotura de membranas e por sua facilidade em retirar o fio da sutura, quando for necessário (Salomão, 1994). Rock e Murphy (1986) relatam uma taxa de gestações bem sucedidas de 82% em seu serviço no Johns Hopkins Hospital utilizando a técnica de McDonald. Uma taxa de sucesso semelhante é observada na literatura, utilizando-se a técnica de Shirodkar (1955). Diferentes técnicas podem ser utilizadas em situações diferentes. Olatun-Bosun e Dick (1981) descreveram uma técnica indicada nos casos em que a dilatação cervical já está presente, realizando a redução das membranas através do colo dilatado, e então realizando-se a circlagem. Obtiveram, com esta técnica (não mais profilática, mas já com um quadro de dilatação cervical instalado), uma taxa de sucesso de 83% (10 em 12 mulheres pariram crianças que sobreviveram). Outra técnica que pode ser utilizada em situações especiais é a circlagem transabdominal, descrita por Benson e Durfee (1965), que pode ser realizada naquelas gestantes nas quais o colo foi diminuído ou amputado cirurgicamente, ou quando há uma laceração cervical incorrigível. Em casos onde uma alteração anatômica ou fisiológica do colo está presente fora da gravidez, podemos ainda utilizar a técnica descrita por Lash (1960), onde a circlagem profilática pode ser realizada fora do período gestacional. OUTROS FATORES ANATÔMICOS 1 Endometriose Um risco elevado de abortamento espontâneo em pacientes com endometriose foi descrito por alguns autores (Naples, 1981; Wheeler, 1983; Groll, 1984). Para estes autores, o risco de um abortamento espontâneo seria reduzido com o tratamento da endometriose destas pacientes. No entanto, estes trabalhos foram retrospectivos e não incluíam um grupo controle no estudo. Mais recentemente, alguns estudos prospectivos randomizados não mostraram uma redução nas taxas de abortamento após o tratamento cirúrgico da endometriose (Marcoux, 1997)(Gruppo Italiano, 1999).
  13. 13. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 12 2 Calcificações Endometriais. Feyles e cols. (2000) descreveram um caso onde uma paciente com duas perdas fetais de primeiro trimestre apresentou áreas hiperecogênicas endometriais, que foram diagnosticadas histologicamente como focos de calcificações endometriais. Em uma terceira gestação, antes que uma suplementação com progesterona pudesse ser iniciada, ocorreu nova perda com 8 semanas de gestação. Numa quarta gestação, onde a suplementação com progesterona ocorreu até a 12ª semana, houve um desaparecimento das imagens ecogênicas, e a gestação evoluiu até o termo. Nas pacientes que apresentam estas calcificações fora do período gestacional, a ultrassonografia transvaginal e a biópsia endometrial (por curetagem ou histeroscopia) parecem ser os melhores métodos para o diagnóstico e tratamento desta alteração endometrial.
  14. 14. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Amaral, B. B. Abortamento. In: Pastore, A. R.; Cerri, G. F. Ultra-sonografia: obstetrícia, ginecologia. São Paulo: Sarvier, 1997, pp. 65-79 (Cap. 4). Andrews, W. W.; Copper, R.; Hauth, J. C.; Goldenberg, R. L.; Neely, C.; Dubard, M. Second- trimester cervical ultrasound: associations with increased risk for recurrent early spontaneous delivery. Obstet Gynecol, February 2000, vol. 95, nº2; pp.222-226. Asplund, J. The uterine cervix and isthmus under normal and pathological conditions. Acta Radiol [Suppl], 1952;91:3. Baden, W. F.; Baden, E. E.; Cervical incompetence: current therapy. AM J Obstet Gynecol, 1960; 79:545. Ben-Rafael,Z; Seidman, D S; Recabi,K; Bider,D; Mashiach,S. Uterine anomalies, A Retrospective, Matched-Control Study. The Journal of Reproductive Medicine, vol.36,nº10/October 1991, pp.723- 727. Benson, R. C.; Durfee, R. B. Critique of obstetric surgery for threatened second trimester abortion. Fertil Steril, 1965; 10:374. Blum, M. Comparative study of serum CAP activity during pregnancy in malformed and normal uterus. J Perinat Med 6: 165,1978 Apud Ben-Rafael,Z; Seidman, D S; Recabi,K; Bider,D; Mashiach,S. Uterine anomalies… cit.p.725. Buttram,VC; Reiter, RC. Uterine leiomyomata: etiology, symptomatology and management. Fertil Steril 1981;36:433-445 apud Propst, A M., Hill III, J A. Anatomic Factors… cit. p. 348 Diamond, MP; Freeman, ML. Clinical Implications of postcirurgical adhesions. Human Reproduction Update, vol.7, nº6, 2001, pp.567-576. Feyles, V.; Moyana, T. N.; Pierson, R. A.; Recurrent pregnancy loss associated with endometrial hyperechoic areas (endometrial calcifications): a case report and review of the literature. Clin Exp Obstet Gynecol, 2000, vol. 27, nº 1, pp. 5-8. Goldstein, D. P. Incompetent cervix en offspring exposed to diethylbestrol in utero. Obstet Gynecol, 1978; 52:735. Groll, M. Endometriosis and spontaneous abortion. Fertil Steril, 1984; 44:933-935. Gruppo Italiano per lo Studio dell'Endometriosi. Ablations of lesions or no treatment in minimal- mild endometriosis in infertile women: a randomized trial. Hum Reprod, 1999;14:1332-1334. Homer, H A; Li, T-C; Cooke, I D. The septate uterus: a review of management and reproductive outcome, Fertility and Sterility, vol.73 nº1 january 2000 pp.1-14.
  15. 15. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 14 Hunter, R. G.; Henry, G. W.; Civin, W. H. The action of papain and bromelain on the uterus. III. The physiologically incompetent internal cervical os. Am J Obstet Gynecol, 1957;73:875. Iams, J. D.; Goldenberg, R. L.; Meis, P. J.; Mercer, B. M.; Moawad, A.; Das, A. et al. The length of the cervix and the risk of spontaneous premature delivery. N Engl J Med, 1996; 334:567-572. Lash, A. F. Incompetent internal os of the cervix: diagnosis and treatment. Am J Obstet Gynecol, 1960; 79:552. Liu, T. D. Y.; Melville, H. A. H.; Martin, T. Subsequent gestational morbidity after various types of abortion. Lancet, 1972; 2:431. Mann, E. C.; McLarn, D. D.; Hayt, D. B. The physiology and clinical significance of the uterine isthmus. Am J Obstet Gynecol, 1961;81:212. Marcoux, S.; Maheux, R.; Bérubé, S., and the Canadian Collaborative Group on Endometriosis. Laparoscopic surgery in infertile women with minimal or mild endometriosis. N Engl J Med, 1997; 337:217-222. McDonald, J. A. Suture of the cervix for inevitable abortion. Br J Obstet Gynaecol, 1957;64:346. Miyamoto J. Background considerations on induced abortion. Int J Fertil, 1973; 18:5. Naples, J. D.; Batt, R. E.; Sadigh, H. Spontaneous abortion rate in patients with endometriosis. Obstet Gynecol, 1981; 17;95-111. Nguyen, L; Hartford, R I O; Trott, E A. Evaluating Müllerian Anomalies as a Cause of Recurrent Pregnancy Loss. Del Med Jrl, April 1997, Vol. 69, nº 4, pp.209-212. Olatun-Bosun, O.; Dyck, F. Cervical cerclage operation for a dilated cervix. Obstet Gynecol, 1981; 57:166. Patton, P E. Anatomic Uterine Defects, Clinical Obstetrics and Gynecology, vol. 37, nº3, 1994, pp. 705-721. Picot, H.; Thompson H. G.; Murphy, C. S. Surgical treatment of the incompetent cervix in pregnancy. Obstet Gynecol, 1958; 12:269. Porcu, G; Cravello, L; D’Ercole, C; Cohen, D; Roger, V; Montgolfier, R de; Blanc, B. Hysteroscopic metroplasty for septate uterus and repetitive abortions: reproductive outcome. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 88 (2000) pp. 81-88. Portuondo,J A; Camara, M M; Echanojauregui, A D; Calonge, J. Müllerian Abnormalities in Fertile Women and Recurrent Aborters, J Reprod Med, 1986 31(7) pp 616-619. Propst, AM; Hill III, J A. Anatomic Factors Associated with Recurrent Pregnancy Loss. Seminars in Reproductive Medicine, Vol. 18, number 4, 2000, pp. 341-350.
  16. 16. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ANATÔMICO 15 Raga,F; Bauset,C; Remohi,J; Bonilla-Musoles,F; Simon,C; Pellicer,A. Reproductive impact of congenital müllerian anomalies. Hum Reprod 1997;12:2277-81. Apud Homer, H A; Li, T-C; Cooke, I D. The septate uterus… cit. p 5. Rock, J. A.; Murphy, A. A. Anatomic Abnormalities. Clin Obstet Gynecol, December 1986, Vol. 29, number 4, pp.886-911. Salomão, A. J. Abortamento espontâneo. In: Neme, B. Obstetrícia básica. São Paulo: Sarvier, 1994, pp. 363-371 (Cap. 58). Schenker, J.G; Margalioth, E.J. Intrauterine adhesions: an updated appraisal. Fertil Steril, 1982; 37: 593-610. apud Propst, A M; Hill III, J A. Anatomic Factors… cit. p. 348 Shirodkar, V. N. Progress in Gynecology. New York: Grune & Stratton, 1963:260. Silva, J L P e; Surita, F G C. Anomalias da evolução da gestação. Abortamento espontâneo. In: Neme, B. Obstetrícia Básica. São Paulo: Sarvier, 2000, pp.552-557(Cap.64). Silveira, G PG. Fator Uterino. In: Halbe, H. Tratado de Ginecologia 3 ed.. São Paulo : Roca, 2000, pp. 1234-1235 (Cap. 158). Vercammen, E. E.; D'Hooghe, T. M.; Endometriosis and recurrent pregnancy loss. Semin. Reprod Med, 2000; vol. 18, nº 4; 363-368. Wheeler, J. M.; Johnston, B. M.; Malinak, L. R. The relationship of endometriosis to spontaneous abortion. Fertil Steril, 1983;39:656-660. Woelfer,B; Salim, R; Banerjee, S; Elson, J; Regan, L; Jurkovic, D. Reproductive Outcomes in Women with Congenital Anomalies Detected by Three-Dimensional Ultrasound Screening. Obstet Gynecol, Vol.98, nº 6, December 2001, pp. 1099-1103. Wright, C. S. W.; Campbell, S.; Beazley, J. Second trimester abortion after vaginal termination of pregnancy. Lancet, 1972; 1:1278.
  17. 17. Seção 2 FATOR ENDÓCRINO Laudelino Marques Lopes  Renato Augusto Moreira de Sá  Regina Amélia Pessoa de Aguiar INTRODUÇÃO Necessário se faz a distinção entre abortamento recorrente e abortamento espontâneo esporádico. Este último se refere a perdas gestacionais não consecutivas que ocorrem de maneira aleatória durante o período reprodutivo da mulher e correspondem a 10 a 15% de todos os abortamentos clinicamente reconhecidos no primeiro trimestre ou no início do segundo1. Perdas gestacionais recorrentes ocorrem em aproximadamente 1% das mulheres em idade reprodutiva2. São definidas como duas ou mais perdas consecutivas, a maioria se dá no período embrionário ou pré-embrionário. Perdas recorrentes no período fetal são menos comuns e chega a ser infrequentes se considerarmos a idade gestacional superior a 14 semanas1. Uma causa definida só consegue ser estabelecida em aproximadamente 50% dos casais e várias destas causas são controversas, por se basearem, na maioria das vezes, em estudos com pouca evidência científica ou em teorias não comprovadas3. Fatores endócrinos têm sido associados a perdas recorrentes embora seu papel real não esteja completamente estabelecido. A hipótese de que fatores endócrinos estão envolvidos como causa destas perdas se baseia no fato de que hormônios produzidos pelo corpo lúteo são necessários para o sucesso reprodutivo em mamíferos4. De todas as causas relacionadas ao abortamento, as endócrinas são as mais controversas. A verdadeira contribuição de alterações hormonais específicas como causa primária de abortamento de repetição não está completamente estabelecida3. Causas endócrinas potenciais, como diabetes mellitus, doenças da tireoide e defeito da fase lútea serão abordadas neste capítulo. DIABETES MELLITUS Doenças metabólicas maternas têm sido atribuídas como causa de abortamento de repetição. Mulheres com diabetes tipo I (insulino-dependentes) que não apresentam controle glicêmico satisfatório tem maior risco de abortamento5 . Este aumento do risco, como também o de malformação congênita, está relacionado à hiperglicemia no primeiro trimestre6 . Mills et al (1988) relataram que gestantes diabéticas que apresentam controle glicêmico até 21 dias da concepção apresentam risco de abortamento semelhante ao de não diabéticas7 . O autocontrole da glicemia e as técnicas mais modernas de controle glicêmico resultaram em diminuição da taxa de abortamento em gestantes diabéticas de mais de 25% nas últimas décadas8 .
  18. 18. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ENDÓCRINO 17 Quando analisamos uma população de mulheres que apresentam abortamento de repetição, a incidência de diabetes subclínica não é maior do que na população em geral9 . Demais disso, não existe evidência que a intolerância à glicose seja causa de perdas repetidas1 . Mulheres diabéticas insulino-dependentes devem ser instruídas a manter controle glicêmico rigoroso no período periconcepcional. DISFUNÇÕES DA TIREÓIDE As disfunções da tireoide são por vezes citadas como causa de perda fetal, entretanto não existe nenhuma evidência direta que realmente contribua para perdas fetais de repetição10 . Toda a literatura disponível que sugere um papel substancial do hipotireoidismo como causa de abortamento recorrente data de mais de quarenta anos3 . Métodos antigos utilizados nestes estudos superestimaram a doença tireoideana nestas mulheres. Estudos mais recentes utilizando- se de técnicas radioimunológicas para avaliar a função tireoideana não detectaram evidências de doença da tireoide como causa de abortamento de repetição11 . Anticorpos antitireoideanos por sua vez, estão associados ao aumento do risco destes abortamentos se identificados em gestações iniciais ou imediatamente antes da gravidez, mas o mecanismo não está completamente elucidado12 . Algumas mulheres podem apresentar diminuição da reserva tireoideana e desenvolverem graus variados de insuficiência tireoideana durante a gestação ou seus anticorpos tireoideanos podem refletir a ativação de um processo autoimune12 . Nenhuma opção de tratamento, no entanto, tem se mostrado eficaz1 . FASE LÚTEA INSUFICIENTE A secreção insuficiente de progesterona pelo corpo lúteo ou placenta tem sido associada com o aumento da incidência de abortamento. Foi sugerido que níveis insuficientes de um ou mais hormônios poderia favorecer as perdas de repetição, entretanto a redução destes hormônios é muito mais uma consequência do que uma causa13 . A incidência de fase lútea insuficiente nas diversas publicações varia de 20 a 60%, mas não existe nenhuma uniformidade nas formas de se identificar esta patologia durante a gestação8 . A evolução da função do corpo lúteo em ciclos menstruais não pode ser extrapolada para a gravidez, uma vez que, por definição, o corpo lúteo na mulher grávida é diferente da não grávida. Curva de temperatura basal, níveis plasmáticos seriados de progesterona não conseguem refletir a adequação da fase lútea e a biópsia de endométrio é por demais invasivo. Os hormônios da fase lútea dosados na pré-implantação de gestações que resultaram em abortamento precoce não se apresentam em níveis significativamente diferentes daqueles dosados em gestações bem sucedidas8 .
  19. 19. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ENDÓCRINO 18 HIPERSECREÇÃO DE HORMÔNIO LUTEINIZANTE (LH) Geralmente associada ao achado ultrassonográfico de ovários micropolicísticos, à infertilidade, abortamento e perdas de repetição. Sagle et al (1988) sugeriram que a síndrome dos ovários policísticos deve estar associado a perdas de repetição em até 82% dos casos14 . Um grande número de estudos tem avaliado a hipersecreção de LH e os ovários micropolicísticos como causa de abortamento de repetição, os achados estão resumidos na Tabela 1. Altos níveis de LH no plasma são definidos como concentração igual ou superior a 10UI/l. O mecanismo responsável pelo efeito adverso da hipersecreção do LH ainda não está esclarecido. A proposta mais aceita no momento diz respeito à qualidade do endométrio no momento da implantação8 . Outros estudos, entretanto, não demonstraram evidências de que achados ultrassonográficos de ovários micropolicísticos pudessem predizer resultado desfavorável da gestação quando comparado a grupo controle15 . Existem várias razões que dificultam as comparações entre os diversos estudos: diferença entre o tipo de teste utilizado pelos diferentes investigadores, o tipo de amostra utilizada (sangue ou urina) e o período do ciclo em que foi dosado o LH16 . Clifford et al (1994) realizaram um dos maiores estudos (n=500) e a prevalência de abortamento recorrente nesta série foi de 57%, entretanto utilizou-se de um teste pouco específico e o período do ciclo avaliado não foi corretamente definido17 . Seis anos mais tarde, Li et al (2000) utilizando-se de metodologia mais precisa encontraram prevalência de apenas 8%16 . Tem sido descrito que mulheres com ovários policísticos que apresentam perdas de repetição apresentam também altos níveis de androgênios circulantes18 . Dois estudos recentes demonstraram que níveis de androgênios aumentados na fase folicular pode ser causa de perdas de repetição19 . Estas observações diferem da anterior, pois não estavam associadas à síndrome dos ovários policísticos. Os altos níveis de androgênios apresentam correlação negativa com a glicodelina A (marcador bioquímico da função endometrial)19 . Estudos in-vitro tem demonstrado que os androgênios provocam redução da atividade secretória das células e da concentração da glicodelina A, que é dose dependente. Estes estudos sugerem que o efeito adverso dos androgênios se dá ao nível da função glandular endometrial20 . Não existe até o momento nenhuma terapia capaz de reduzir as perdas em mulheres com ovários micropolicísticos1 . CONDUTA A associação entre perdas gestacionais recorrentes e doenças metabólicas ou endocrinológicas assintomáticas tais como doenças tireoideanas moderadas ou intolerância a glicose não está ainda estabelecida. Testes para rastreamento de disfunção tireoideana ou de intolerância a glicose não estão indicados para mulheres normais que apresentam perdas recorrentes1 . Associação entre anticorpos antitireoideanos e perdas repetidas tem sido relatadas por diversos autores(20-21) . Poucos pacientes nestes estudos, entretanto, apresentam hipotireoidismo clínico e menos de 20% tem resultados anormais de TSH20 . Além disso, nenhum tratamento proposto
  20. 20. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ENDÓCRINO 19 provou ter benefícios em gestações subsequentes, assim sendo não se justificam os testes para anticorpos anti-tireoide na avaliação de mulheres com perdas de repetição1 . Embora a prática clínica tenha consolidado a investigação dos níveis de progesterona na fase lútea em mulheres com abortamentos recorrentes, as evidências que suportam tal prática são frágeis. O estudo do endométrio é considerado alterado quando existe diferença do achado histológico e a data do ciclo menstrual superior a dois dias, entretanto a variabilidade inter e intra-observador destes estudos é considerável22 . Considerando-se estas variações, os frequentes achados de endométrio incompatível com a fase do ciclo em mulheres normais e a inconsistência na expressão de fase lútea insuficiente em mulheres afetadas, só consideram-se este diagnóstico após dois achados de biópsia de endométrio anormais. A avaliação dos níveis de progesterona não se mostrou adequada1 . Até o momento nenhum estudo apresentou metodologia adequada para avaliar o papel do tratamento com progesterona em mulheres com perdas de repetição. O mais recente estudo randomizado com progesterona para tratamento de mulheres com ovários micropolicísticos e três ou mais perdas sucessivas não mostrou resultados diferentes em relação à evolução da gestação quando comparado ao grupo controle que usou placebo23 . Em resumo, a relação entre fase lútea insuficiente e perdas fetais de repetição permanece controversa. Ainda não foi demonstrado de forma conclusiva que o tratamento com progesterona possa influenciar positivamente os resultados em mulheres com perdas recorrentes23 . CONSIDERAÇÕES O papel dos fatores endócrinos como causa de abortamento recorrente é controverso. Diabetes mellitus e doenças da tireoide não se apresentam como fator de risco para tal. Defeitos da fase lútea e a presença de ovários micropolicísticos permanecem questionáveis uma vez que os métodos de diagnóstico disponíveis no momento apresentam pouca acurácia, demais disso, não se demonstrou nenhuma evidência que o tratamento de reposição com progesterona fosse capaz de melhorar os resultados23 . O corpo lúteo é uma glândula endócrina diferenciada em sua função e de extrema importância para o resultado reprodutivo de mamíferos. Muita controvérsia existe ainda sobre o papel deste em humanos e qual dos seus defeitos realmente poderia alterar a reprodução23 . Os modelos de receptores de óvulos doados em programas de reprodução assistida tem demonstrado que é possível reproduzir a função do corpo lúteo através da administração de estrogênio e progesterona. O mecanismo pelo qual estes medicamentos conseguem alterar a receptividade endometrial ainda é controverso. Muitos trabalhos ainda precisam ser desenvolvidos na busca de “marcadores” de receptividade uterina que tenham correlação significativa com resultados gestacionais23 .
  21. 21. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ENDÓCRINO 20 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ACOG practice bulletin. Management of recurrent early pregnancy loss. Int J of Gynecol Obstet 78:179-90, 2002. 2. Stirrat GM. Recurent miscariage I: definition and epidemiology. Lancet 336:673-675, 1990. 3. Coulam CB & Stern JJ. Endocrine Factors Associated with Recurrent Spontaneous Abortion. Clin Obstet Gynecol 37:730-44, 1994. 4. Fanchin R; de Ziegler D; Taieb J; Hazout A; Fryman R. Premature evalution of plasma alters pregnancy rates of in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril 59:1090-94, 1993. 5. Dorman JS; burke JP; McCarthy BJ; Norris JM; Steenkiste AR; Aarons JH et al. Temporal trends in spontaneous abortion associated with type 1 diabetes. Diabetes Res Clin Pract 43:41-47, 1999. 6. Greene MF. Spontaneous abortion and major malformations in women with diabetes mellitus. S Reprod Endocrinol 17:127-31,1999. 7. Mills JL; Simpson JL; Driscoll SG; Jovanovic-Petersen L; Van Allen M; AArons JH et al. Incidence of spontaneous abortion among normal women and insulin-dependent diabetic women whose pregnancie were identified within 21 days of conception. N Eng J Med 319:1618-23, 1988. 8. Stirrat GM & Wardle PG. Recurent Miscariage. in High Risk Pregnancy Management Options, James DK; Sterr PJ; Weiner CP; Gonik B. Saunders. 2ed. cap. 7; 791-110, 1999. 9. Rosenn B; Miodovinik M, Combs CA et al. Preconception management of insulin-dependent diabetes: iprovment of pregnancy outcome. Obstetrics and Gynecology 77: 846-49, 1991. 10. ETEP Group (Berry CW et al). The Euro-team Early Pregnancy (ETEP) protocol for recurrent miscarriage. Hum Reprod 10:1516-20, 1995. 11. Harger JH, Archer DF, Marchese SG; Muracca-Clemnts M; Garver KL. Etiology of recurrent pregnancy losses and outcome of subsequent pregnancies. Obstet Gynecol 62:547-52, 1983. 12. Le B; Grun JP; de Nayer P et al. Atithyroid antibodies underlying thyroid abnormalities and miscarriage or pregnancy induced hypertension. Br J Obstet Gynaecol 100:669-72, 1993. 13. Sale HT; Ghaneimah AS; Shaaban MM; Chard T. Prognostic value of biochemical tests in the assesment of fetal outcome in threatened abortion. Br J Obstet Gynaecol 91:382-87, 1984. 14. Sagle M; Bishop K; Ridley N et al. Recurrent early miscarriage and polycystic ovaries. Br Med J 297:1027-28, 1988.
  22. 22. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR ENDÓCRINO 21 15. Liddell HS; Sowden K; Farquhar CM. Recurrent miscarriage: screening for polycystic ovaries and subsequent pregnancy outcome. Aust N Z J Obstet Gynaecol 37:402-6, 1997. 16. Li TC, Makris M, Tomsu M, Tuckerman E, Laird S.Recurrent miscarriage: aetiology, management and prognosis.Hum Reprod Update. 8:463-81, 2002. 17. Clifford K, Rai R, Watson H, Regan L.An informative protocol for the investigation of recurrent miscarriage: preliminary experience of 500 consecutive cases.Hum Reprod. 9:1328-32, 1994. 18. Tulppala M; Stenman UH; Cacciatore B; Ylikorkala O. Polycystic ovaries and levels of gonadotropins and androgens in recurrent miscarriage: prospective study in 50 women. Br J Obstet Gynaecol 100:348-52, 1993. 19. Okon MA, Lee S, Laird SM, Li TC.A prospective randomized controlled study comparing the morphological and biochemical responses of the endometrium to two different forms of 'period-free' hormone replacement therapy. Hum Reprod. 13:2261-5, 1998. 20. Tuckerman EM, Okon MA, Li T, Laird SM. Do androgens have a direct effect on endometrial function? An in vitro study.Fertil Steril. 74:771-9, 2000Pratt D; Novotny M; Kaberlein G; Dudkiewicz A; Gleicher N. Antihyroid antibodies and the association with nonspecific antibodies and the association with nonspecific antibodies in recurrent pregnancy loss. Am J Obstet Gynecol 168:837-41, 1993. 21. Rushworth FH; Backos M; Rai R; Chicott IT; Baxter N; Regan L. Prospective pregnancy outcome in untreated recurrent miscarriages with thyroid autoantibodies. Hum Reprod 15:1637-39, 2000. 22. Scott Rt, Snyder RR, Strickland DM, Tyburski CC, Bagnall JA, Reed KR. The effect of interobserver variation in dating endometrial histology on the diagnosis of luteal phase defects. Fertil Steril;50:888-92, 1988. 23. Katz VL, Kuller JA Recurrent miscarriage.Am J Perinatol.;11:386-97, 1994
  23. 23. Seção 3 INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DAS PERDAS GESTACIONAIS E DOS CASAIS COM PERDAS REPETIDAS Sérgio D.J. Pena  Helena B.B.L. Martins da Costa  Elen R. F. Carvalho  Rosane Sturzeneker INTRODUÇÃO As perdas fetais são um dos fenômenos mais comuns da medicina e também um dos mais devastadores emocionalmente. Um casal que viu seu sonho de uma gravidez perfeita se dissolver em sangramento sente-se incompetente, inadequado e anormal. Frequentemente há sentimentos de vergonha, culpa, insegurança e depressão, que podem perdurar por meses e mesmo anos. Uma explicação científica da causa da perda fetal geralmente ajuda o casal a lidar com estas emoções e preparar-se para gravidezes futuras. Somente nos últimos vinte anos os abortos e natimortos passaram a ser estudados sistematicamente. Os resultados foram completamente inesperados: a etiologia mais frequente de perdas fetais é genética, e mais especificamente citogenética (anomalias cromossômicas). Neste capítulo, será discutida a importância da investigação cromossômica (convencional ou molecular) dos abortamentos e dos próprios casais com perdas fetais. Não tentamos fazer um estudo acadêmico com revisão completa da literatura. Pelo contrário, o nosso enfoque foi proporcionar ao obstetra um guia prático de ação, para que ele possa ajudar a paciente a lidar com a sua perda gestacional e a planejar suas gravidezes futuras com confiança. INVESTIGAÇÃO GENÉTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTÂNEOS 1 Introdução Abortamentos1 espontâneos são eventos comuns e ocorrem em 10 a 15% das gravidezes reconhecidas clinicamente1 . Sabemos hoje que mais frequentemente a sua causa é genética, e mais especificamente citogenética(revisado em 2) . Boué e Boué3 em Paris encontraram anomalias cromossômicas em 61% de 1500 abortamentos de primeiro trimestre estudados. Da mesma maneira, Hassold e cols.4 no Havaí, encontraram cromossomopatias em 50,5% de 2919 fetos abortados com menos de 500g. Estes dois estudos basearam-se em culturas a longo termo de tecidos fetais, método sabidamente complexo e sujeito a falhas de cultura em mais de 30% dos casos. 1 Neste texto utilizaremos a palavra “abortamento” como a tradução dos termos ingleses abortion ou abortus. Assim evitamos o uso da expressão “aborto”, que frequentemente tem conotações pejorativas ao ser empregada para denotar uma interrupção dolosa da gravidez ou uma monstruosidade.
  24. 24. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 23 Utilizando o exame cromossômico com cultura a curto termo de vilosidades coriônicas, Ohno e cols.5 obtiveram um cariótipo em 92,3% dos abortos e observaram uma taxa de anormalidades cromossômicas mais alta ainda: 69,4%. É possível que os espécimes que não crescem em culturas in vitro tenham maior probabilidade de ser cromossomicamente anormais6 . Em todos os estudos, a proporção de conceptos cromossomicamente anormais estava inversamente relacionada com o período gestacional. Assim, por exemplo, no segundo trimestre de gravidez o número de abortos com defeito cromossômico cai para 25-30%. Por outro lado, na maioria dos trabalhos publicados as frequências dos vários tipos de anormalidade foram mais ou menos constantes. Fritz e cols.6 fizeram uma meta-análise de 19.920 casos da literatura e observaram que as trissomias (presença de um cromossomo extra) correspondiam a aproximadamente 59% dos abortos anormais, a monossomia X (45,X) correspondia a 15% e a triploidia (três cópias de todos os cromossomos) a 15%. 1.1 Qual a importância do diagnóstico etiológico das perdas reprodutivas? O abortamento, apesar de comum, é emocionalmente devastante e o seu impacto é intensificado quando a causa não é estabelecida. Isto ocorre porque, com frequência, a perda fetal não é apropriadamente investigada. Embora esteja provado que mais de 50% dos abortamentos tem cariótipos anormais e os geneticistas há anos enfatizem a necessidade dos estudos citogenéticos das perdas reprodutivas, a verdade é que eles não se tornaram parte integral da rotina obstétrica, exceto para alguns especialistas com orientação mais acadêmica. Uma das razões é o fato de que, no passado, frequentemente havia insucesso da cultura clássica de tecidos fetais a longo termo, então essencial para o estudo cromossômico. Hoje, isto não é mais verdade, graças aos avanços significativos em culturas de curto prazo e em estudos diretos do DNA extraído dos tecidos fetais, mesmo contaminados, macerados ou fixados, garantindo um resultado conclusivo e útil na maioria dos casos, como demonstrado neste estudo. A maior indicação para o estudo cromossômico dos tecidos fetais é o abortamento de repetição7 . Nos Estados Unidos, 4% das mulheres casadas tiveram duas perdas fetais e 3% tiveram três ou mais perdas8 . Nestes casos de recorrência torna-se essencial estabelecer se o abortamento está ou não relacionado com uma cromossomopatia. Na presença de cromossomopatia, a causa da perda fetal pode ser considerada como estabelecida e não há necessidade de fazer nenhuma investigação da mãe. Por outro lado, na ausência de uma alteração do cariótipo fetal, há indicação para investigações maternas, que devem incluir uma ultrassonografia pélvica, estudos genéticos de trombofilia e anticorpos lúpicos anticoagulante e anti-cardiolipina9 . Estudos hormonais são controversos1 . Entretanto, mesmo no primeiro abortamento, acreditamos que há justificativas para o estudo cromossômico fetal. O processo de luto após uma perda fetal é associado com ansiedade e depressão10 . Nos casos em que a perda fica inexplicada, frequentemente a paciente apresenta sentimentos de culpa e questiona se a perda fetal ocorreu porque ela fez ou deixou de fazer algo.
  25. 25. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 24 Friedman e Gath11 entrevistaram 67 mulheres quatro semanas após um abortamento espontâneo e observaram a presença de depressão psiquiatricamente significativa em 32 delas (48%). Frequentemente as sequelas psicológicas também tem impacto negativo nas relações familiares, incluindo maridos e outros filhos12 esclarecimento ao casal de que o abortamento foi causado por um defeito cromossômico esporádico (“um acidente genético”) e que a continuação da gravidez seria impossível ou culminaria no nascimento de uma criança anormal, contribui significativamente para que haja aceitação da perda fetal. Devido a estas razões, acreditamos que todos os abortamentos devam ser submetidos a exames citogenéticos, assim permitindo o aconselhamento genético dos casais antes de uma nova gravidez. 1.2 Desenvolvimento das técnicas de investigação genética dos abortamentos espontâneos pelo estudo direto do DNA Pelo exposto acima fica claro que sempre que possível, todas as perdas reprodutivas devem ser investigadas citogeneticamente. Infelizmente, quando feitas com a citogenética clássica convencional, estas investigações são relativamente dispendiosas, demoradas e tem um percentual significativo de casos sem resultado. Isto acontece porque a citogenética convencional depende da disponibilidade de células humanas vivas e em processo ativo de divisão celular, o que frequentemente só é possível com a cultura dos tecidos fetais a longo termo no laboratório. As falhas de cultura são comuns porque os tecidos de abortamentos e natimortos estão frequentemente macerados, contaminados com bactérias e/ou fungos, ou foram fixados em formol ou álcool. Neste artigo nós queremos demonstrar que hoje é possível usar testes baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) para conseguir fazer o diagnóstico rápido de doenças cromossômicas humanas em DNA extraído tecidos de fetos abortados e natimortos sem necessidade de cultura de tecidos. 1.3 Citogenética molecular pela PCR usando quantificação fluorescente dos microssatélites polimórficos (QF-PCR) Em 1991, Mutter and Pomponio13 iniciaram a citogenética molecular pela PCR ao desenhar um único par de iniciadores que promovia a amplificação do gene ZFY no cromossomo Y e o seu homólogo ZFX no cromossomo X, mas gerando produtos de tamanhos diferentes para cada um deles. Eles demonstraram que, além do diagnóstico do sexo, estas condições competitivas permitiam o diagnóstico molecular de indivíduos com cariótipo alterado 47,XXY (síndrome de Klinefelter) ou 47,XYY (dissomia Y), pois as quantidades relativas de produtos de amplificação de ZFX and ZFY tinham razões 2:1 e 1:2, respectivamente, em contraste com 1:1 em controles normais (46, XY). Obviamente, este enfoque experimental tão atraente, baseado na homologia peculiar apresentada entre os cromossomos sexuais X e Y não era aplicável aos cromossomos autossômicos. Entretanto, Mansfield14 observou que em indivíduos heterozigotos para microssatélites polimórficos (ver abaixo) um alelo podia servir como controle interno competitivo para o outro.
  26. 26. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 25 Os microssatélites são blocos de unidades repetitivas de DNA, contendo uma a seis bases nucleotídicas, que são abundantes e altamente polimórficos em genomas eucariontes devido à variação no número de unidades repetitivas entre alelos(revisado em 15) . Os locos de microssatélites são informativos para o diagnóstico de trissomias quando mostram a presença de mais de um alelo. Os indivíduos trissômicos apresentarão, em locos de microssatélites informativos, três alelos de intensidade aproximadamente igual ou dois alelos com dosagem relativa na proporção 2:1 (Figura 1). No primeiro caso o diagnóstico é óbvio e fácil, enquanto que, no segundo caso, é quantitativo e depende de técnicas estatísticas. Figura 1 – Citogenética molecular por PCR usando quantificação fluorescente de microssatélites polimórficos (QF-PCR). Foram utilizados em multiplex o loco da amelogenina nos cromossomos X e Y e microssatélites polimórficos dos cromossomos 16, 13, 21, 22 e 18. De cima para baixo vemos os traçados obtidos com um feto cromossomicamente normal (46,XY), um feto feminino com trissomia 18 (as setas mostram o padrão de três alelos) e um feto masculino com trissomia 16 (as setas mostram dois alelos em relação de área 1:2). Vários grupos de pesquisadores tem usado a amplificação pela PCR de microssatélites do cromossomo 21 para o diagnóstico da síndrome de Down(14, 16- 19) especialmente para o diagnóstico pré- natal em DNA extraído de células fetais células do líquido amniótico ou de vilos coriônicos. No GENE - Núcleo de Genética Médica nós desenvolvemos para o exame pré-natal em líquido amniótico obtido por amniocentese um protocolo diagnóstico para a trissomia 21 que permite a amplificação simultânea de três microssatélites diferentes, D21S11, D21S1270 e IFNAR, conjuntamente com AMEL20 . Já temos sete anos de experiência com este procedimento, que permite um diagnóstico rápido (24-48 horas) e, assim, quando normal, alivia a ansiedade dos pais, já que os resultados da citogenética convencional, dependentes da cultura de células, demoram de 8-14 dias. Da mesma maneira que para o diagnóstico da trissomia 21, a citogenética molecular pode ser usada para o diagnóstico pré-natal das aneuploidias sexuais19 e das trissomias 13 e 1817,18 . Já
  27. 27. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 26 emergiram na Europa propostas de utilização da citogenética molecular pela PCR como ferramenta única no diagnóstico pré-natal de trissomias. Mann e cols.21 em Londres publicaram em 2001 a experiência com o diagnóstico pré-natal das trissomias 21, 18 e 13 exclusivamente pela PCR em 1314 casos. Nesta série não houve nenhum resultado falso-positivo nem falso-negativo21 . Esta também é a experiência do GENE. 1.4 Diagnóstico da síndrome de Turner (45,X) pelo estudo direto do DNA O grupo de pesquisa do Laboratório de Genética Bioquímica na UFMG, sob nossa coordenação, desenvolveu um procedimento PCR multiplex que permite a amplificação simultânea de cinco microssatélites de dinucleotídeos localizados em uma região do braço longo do cromossomo X (Figura 2B). Os estudos populacionais demonstraram que a diversidade haplotípica em populações do Brasil, da África e da Europa era maior que 99%22 . Assim, esperamos ver homozigosidade dos cinco locos em menos de 1% das mulheres normais. Por outro lado, esperamos ver a presença de um único pico em cada um dos cinco locos em todas pacientes não-mosaicas com o cariótipo 45,X (Figura 2B) já que há perda de heterozigosidade por ausência de um cromossomo X. Assim, começamos a usar estes microssatélites para fazer a triagem de fetos para a síndrome de Turner23 . Para confirmação deste teste baseado em microssatélites, empregamos o procedimento de PCR específica para metilação (Figura 2C), usando a metodologia descrita em detalhe previamente para diagnóstico da síndrome do X-frágil24, 25 . Figura 2 – Diagnóstico da monossomia X (45,X) por duas técnicas diferentes usadas neste trabalho: a perda de heterozigosidade diagnosticada por microssatélites do cromossomo X (B) e a análise de metilação do cromossomo X (C). Em mulheres normais, observamos um fragmento de 142 pb, que corresponde à corresponde ao cromossomo X ativo (não-metilado) e também um produto de 84 pb que corresponde ao cromossomo X inativado. Como um controle interno indispensável, nós usamos iniciadores específicos para a versão materna metilada da ilha CpG do gene SNRPN no cromossomo 15 humano. Como na síndrome de Turner (igual ao caso de homens) há apenas um cromossomo X ativo (não-metilado), há no resultado um padrão molecular tipicamente masculino, ou seja, ausência do produto de 142 pb, com a presença apenas da banda de 84 pb.
  28. 28. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 27 1.5 Proposta desta revisão Este capítulo faz a revisão da implantação no GENE - Núcleo de Genética Médica de um protocolo de estudo genético de abortamentos e outras perdas reprodutivas pela citogenética molecular pela PCR. Como mostramos acima, entre os abortamentos com cromossomopatias há três classes principais de defeitos: trissomias (Figura 1), monossomia X (Figura 2) e a triploidia (Figura 3). A nossa estratégia era fazer o diagnóstico molecular das trissomias mais frequentes, ou seja, daquelas acometendo os cromossomos 13, 16, 18, 21 e 22 (que conjuntamente perfazem aproximadamente 70% de todas as trissomias em abortamentos - Figura 1). O diagnóstico das triploidias seria feito usando a mesma ferramenta diagnóstica, ou seja, citogenética molecular por PCR com quantificação fluorescente (Figura 3). Não se constatando a presença de triploidia ou das trissomias testadas, todos os fetos do sexo feminino seriam estudados pelo procedimento de triagem da monossomia X, usando a reação multiplex de cinco microssatélites do braço longo do cromossomo X (Figura 2B). Nos casos com evidência molecular de monossomia X, seria, então, feita a confirmação do cariótipo 45,X com a PCR específica para metilação (Figura 2C). Figura 3 – (A) Cariótipo fetal masculino mostrando a presença de 69 cromossomos (triploidia). (B) Diagnóstico molecular do mesmo feto mostrando trissomia dos cromossomos 16, 13, 22, 21 e 18 e um complemento sexual XXY. Observe padrões de três picos nos cromossomos 16, 22 e 21 e padrões de dois picos com diferenças quantitativas nos cromossomos 13 e 18, além do par XY. No presente trabalho fazemos uma revisão de 1096 abortamentos estudados no GENE no período 1990-2002. Estes casos foram estudados por três protocolos diferentes: citogenética convencional, citogenética convencional + citogenética molecular, ou citogenética molecular isoladamente. A conclusão do estudo foi que o protocolo de citogenética molecular desenvolvido é simples, eficiente e de baixo custo e que a sua implantação representou um progresso considerável na investigação genética dos abortamentos. 2 Protocolos experimentais No período entre janeiro de 1990 e junho de 2002, foram estudados no GENE – Núcleo de Genética Médica 1096 abortamentos em que a idade
  29. 29. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 28 gestacional era conhecida, incluindo 1008 perdas de primeiro trimestre e 88 perdas de segundo trimestre. Estes casos foram encaminhados com finalidades diagnósticas, de praticamente todo o território brasileiro. 2.1 Citogenética convencional: cultura a curto termo Todo o trabalho é realizado assepticamente em uma capela de fluxo laminar. O material de curetagem é colocado em uma placa de Petri estéril e examinado no microscópio invertido. As vilosidades coriônicas, se presentes, são cuidadosamente dissecadas. Uma pequena parte da amostra é então congelada para possível utilização em citogenética molecular. As vilosidades coriônicas são usadas então para cultura a curto termo (48h) seguidas de preparação de metáfases e bandeamento GTG de acordo com procedimento citogenético padrão. 2.2 Citogenética convencional: cultura a longo termo Se vilosidades não são visualizadas no material fetal encaminhado ao laboratório, ou se não forem obtidas metáfases com a cultura a curto termo descrita acima, ou se for uma perda fetal mais tardia e tecidos do próprio feto (pele, fascia lata, músculo, etc.) tiverem sido encaminhados, é feita a cultura a longo termo. Quando há suficientes fibroblastos crescendo, a placa é processada para citogenética usando procedimentos rotineiros de preparação cromossômica in situ, seguido de bandeamento GTG. Caso não haja crescimento dos explantes após 3-4 semanas, é feita a extração de DNA dos mesmos para a realização dos testes de citogenética molecular. 2.3 Diagnóstico molecular das trissomias fetais Para a realização dos testes de citogenética molecular pela PCR, o DNA é extraído das células fetais. Contanto que o DNA não esteja demasiadamente degradado, esta extração pode ser feita em tecidos frescos, secos, congelados, macerados, contaminados com bactérias ou fungos, fixados em formol ou etanol ou mesmo incluídos em parafina. Utilizando pinça e tesoura esterilizadas, separam-se os tecidos fetais (vilosidades coriônicas, pele ou sangue fetal, restos placentários). Se o material fetal tiver vindo sem conservante, ou em álcool absoluto, são feitos então o lisado e a precipitação do DNA exatamente como descrito em detalhe por Pena e cols26 . Os iniciadores usados na PCR são marcados com o fluorocromo Cy5 e os produtos do sistema multiplex são resolvidos por eletroforese em um densitômetro a laser computadorizado (Sequenciador Automático ALF Express, Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). 2.4 Diagnóstico do sexo fetal e de aneuploidias do cromossomo X Nós temos usado os iniciadores desenhados por Sullivan e cols.28 para diagnosticar o sexo fetal de abortamentos. Pela incorporação do fluoróforo Cy5 durante a PCR podemos usar o sequenciador automático para quantificar os produtos de amplificação do X e do Y e verificar o sexo fetal, além de fazer o diagnóstico molecular da síndrome de Klinefelter (47, XXY) ou da dissomia Y (47, XYY).
  30. 30. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 29 2.5 Diagnóstico molecular da monossomia X (síndrome de Turner) Quando os testes para trissomias e triplodia são normais e o sexo fetal é feminino, são sempre realizados estudos moleculares adicionais para o diagnóstico de uma possível monossomia X (45,X), uma das causas mais comuns de abortamento. Inicialmente é utilizada a reação multiplex de cinco microssatélites do braço longo do cromossomo X, exatamente como descrito em Pereira e cols.23 . Nos casos em que um único pico é visto em cada um dos microssatélites é feita então a confirmação do cariótipo 45,X com a PCR específica para metilação, utilizando a metodologia descrita por Pena e Sturzeneker24, 25 . 2.6 Definição dos protocolos Neste trabalho fazemos uma revisão da análise de 1096 abortamentos estudados por três protocolos diferentes que foram adotados sequencialmente. O Protocolo 1, que vigorou de 1990 a 1996, era baseado no uso exclusivo da citogenética convencional. O Protocolo 2, passou a vigorar a partir de 1997, estendendo-se até o presente era baseado no uso combinado da citogenética convencional e da citogenética molecular. Finalmente, o Protocolo 3, que era constituído pela citogenética molecular isoladamente, passou a ser usado a partir de 1999. 3 Resultados e Discussão 3.1 Protocolo 1 O Protocolo 1 vigorou de 1990 a 1996 e efetivamente representa a era pré-molecular. Neste período foram estudados 500 casos de abortamento por cultura de curto termo de vilosidades coriônicas e/ou cultura a longo termo de explantes de outros tecidos fetais, seguidos, quando viável, de processamento para citogenética convencional. Quando a cultura de curto termo de vilosidades coriônicas não produzia metáfases, era então feita a cultura a longo termo dos tecidos fetais disponíveis, após cuidadosa dissecação. Os resultados obtidos com este protocolo estão mostrados em detalhe na Tabela 1. Como já esperado pelas estatísticas internacionais, não foram obtidos resultados em 28,4% dos casos (142 exames). Nos exames que permitiram um resultado, observamos 63 conceptos masculinos cromossomicamente normais (28,1%) e 161 conceptos femininos cromossomicamente normais (71,2%). Esta diferença é altamente significativa pelo teste exato de Fisher (Z = 4,7; P = 0,000002). A razão para esta diferença fica clara quando separamos os resultados das culturas a curto termo de vilosidades coriônicas (coluna “Vilos” na Tabela 1), com uma razão feminino/masculino de 1,02 e das culturas a longo termo (coluna “Cultura” na Tabela 1) com uma razão feminino/masculino de 0,13. Provavelmente, nas culturas a longo termo estava havendo crescimento de células maternas femininas e citogeneticamente normais. Com base nesta observação, todos os laudos dos exames com resultado 46,XX eram acompanhados de uma explicação específica e também de sugestões relativas a necessidade de outros exames dos pais.
  31. 31. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 30 Tabela 1 – Estudo genético de abortamentos feito exclusivamente por citogenética convencional. Período: janeiro 1990 – dezembro 1996. Vilos Cultura Total Total de casos 216 284 500 100,0% Falha de cultura 0 142 142 28,4% Sem resultado 0 142 142 28,4% Cariótipo Normal 95 129 224 224/358 = 62,6% 46, XY 48 15 63 46, XX 47 114 161 Cariótipo anormal 121 13 134 121/216 = 56,0%a 134/358 = 37,4% Trissomia 83 7 90 68,6%a Trissomia 13 10 0 10 Trissomia 16 25 4 29 Trissomia 18 3 1 4 Trissomia 21 14 0 14 Trissomia 22 6 1 7 47, XXY 2 0 2 (60) 49,6% Outras trissomiasb 23 1 24 19,0%c 45, X 12 4 16 9,9% Triploidia 21 1 22 17,3% Tetraploidia 1 1 2 0,8% Outros 4 0 4 3,3% a Estas percentagens referem-se exclusivamente aos resultados em vilosidades coriônicas (vilos). b Inclui trissomias duplas. c Em negrito e itálico estão as anormalidades cromossômicas não detectáveis pelo protocolo molecular. Focalizando a nossa atenção somente nos resultados obtidos de vilosidades coriônicas, que apresentam menos vieses potenciais, podemos constatar a presença de anormalidades cromossômicas em 56,0% dos abortamentos, o que é completamente concordante com a literatura. Entre os conceptos cromossomicamente anormais encontramos 68,6% trissômicos, 9,9% com cariótipo 45,X e 17,3% triploides. 3.2 Protocolo 2 O Protocolo 2, que inclui os estudos de citogenética molecular pela PCR, passou a vigorar a partir de 1997 e foi usado no estudo de 298 perdas reprodutivas. Houve falhas de cultura em 94 casos (31,5%), conforme esperado pelos dados da literatura e este percentual, inclusive, não difere significativamente dos 28,4% com o Protocolo 1 (Z = 0,9; P > 0.30). Entretanto, neste protocolo todos os casos em que houve falha de cultura foram ademais estudados pela citogenética molecular, com a consequência de que foi possível obter resultados em 296 das 298 perdas reprodutivas (>99%), um aumento espetacular em comparação com o Protocolo 1. Com a
  32. 32. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 31 citogenética convencional no Protocolo 2 foram encontrados anormalidades cariotípicas em 49,5% dos conceptos, em concordância com os resultados do Protocolo 1. Tabela 2 – Estudo genético de abortamentos feito exclusivamente por citogenética convencional com utilização suplementar de metodologia molecular (PCR - Reação em Cadeia da Polimerase). Período: janeiro 1997 – junho 2002. Total de casos 298 100,0% Falha de cultura 94 31,5% Sem resultado 2 0,7% Cariótipo Normal 173 173/296 = 58,4% Convencional Molecular Total Cariótipo anormal 100/202 = 49,5% 23/94 = 24,5% 123 100,0% 123/296 = 41,6% Trissomia 70 19 89 72,3% Trissomia 13 8 4 12 Trissomia 16 23 2 25 Trissomia 18 5 6 11 Trissomia 21 10 4 14 Trissomia 22 5 1 6 47, XXY 2 2 4 (72) 58,5% Outras trissomias* 17 0 17 (17,0%a ) 15,4% 45, X 10 1 11 8,9% Triploidia 7 3 10 8,1% Tetraploidia 5 0 5 (5,0%) 4,1% Outros 8 0 8 (8,0%) 6,5% * Inclui trissomias duplas. a Em negrito e itálico estão as anormalidades cromossômicas não detectáveis pelo protocolo molecular. Por outro lado, com a citogenética molecular observamos anormalidades em apenas 24,5% dos casos. Entretanto temos de considerar que a citogenética molecular tem foco exclusivo nos cromossomos 13, 16, 18, 21, 22, X e Y e, além disso, não é capaz de diagnosticar casos de tetraploidia nem translocações balanceadas. Dos 100 casos anormais detectados pela citogenética convencional, 30 não seriam passíveis de detecção pelo protocolo de citogenética molecular utilizado neste estudo (ver em negrito e itálico na Tabela 2), porque envolviam anomalias infrequentes. O protocolo adotado no GENE leva em conta a relação custo/benefício do exame e privilegia as cromossomopatias mais comuns nos abortamentos. Se omitirmos estes casos, indetectáveis pela citogenética molecular, de consideração, teríamos cariótipos anormais pela citogenética convencional em 70 de 202 conceptos, ou seja, 34,7%, que não é significantemente diferente dos 24,5% vistos com a citogenética molecular (Z = 1,7; P > 0,14). Além disso, como a citogenética molecular foi feita nos casos em que houve falha de cultura apenas, os dois grupos não são facilmente comparáveis.
  33. 33. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 32 3.3 Protocolo 3 O Protocolo 3, que inclui apenas estudos de citogenética molecular pela PCR, passou a vigorar a partir de 1999. De janeiro daquele ano a junho de 2002, foram estudadas 298 abortamentos por este protocolo. Vários destes casos eram de espécimes que haviam sido fixados em formol ou álcool, ou mesmo incluídos em parafina para estudos anátomo-patológicos ao microscópico. Foram observados 105 conceptos com cariótipos anormais, ou seja, uma taxa de anormalidade cariotípica de 35,2% (Tabela 3). Tabela 3 – Estudo genético de abortamentos feito pelo Protocolo 3, empregando or metodologia molecular (PCR - Reação em Cadeia da Polimerase). Período: janeiro 1999 a junho 2002. Total de casos 298 100,0% Sem resultado 0 Cariótipo Normal 193 203/298 = 64,8% Cariótipo anormal 105 100,0% 105/298 = 35,2% Trissomia 46 44,2% Trissomia 13 6 Trissomia 16 17 Trissomia 18 8 Trissomia 21 13 Trissomia 22 1 47,XXY 1 45, X 23 22,1% Triploidia 36 34,6% 3.4 Eficiência da citogenética molecular Este foi um estudo com controles sequenciais, ou seja, o nosso objetivo era comparar resultados obtidos após a implantação dos estudos moleculares (Protocolos 2 e 3) com os resultados anteriores (Protocolo 1). Dois parâmetros básicos, determinantes da sensibilidade diagnóstica do procedimento, foram inicialmente analisados: proporção de casos com resultado definitivo e proporção de casos com anormalidade cromossômica. O Protocolo 1, baseado na citogenética tradicional após cultura a curto ou longo prazo, representa o procedimento clássico de estudo de abortamentos e estabeleceu a nossa linha de base. A proporção de casos sem resultado, 28,4%, foi significativa, mas dentro do esperado, já descrito na literatura especializada. Na maioria dos casos isto se deveu a amostras inadequadas, com contaminação bacteriana, maceração pronunciada, ou mesmo ausência de tecidos fetais reconhecíveis. Em parte, este problema é relacionado com a falta de experiência dos médicos
  34. 34. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 33 fazendo a coleta, que não haviam recebido informações adequadas, ou que não haviam seguido os procedimentos de coleta recomendados. Sem dúvida, esta proporção de exames sem resultado, mesmo se esperada, era causa de frustração para os médicos, os pais e a própria equipe do GENE. Um outro problema com este protocolo é que a inadequação das amostras dificultava também a dissecação dos conceptos, de tal maneira que nas culturas a longo prazo havia o risco de crescimento de células maternas, como sinalizado pelo excesso de resultados femininos normais (Tabela 1). Como a contaminação com células maternas é sabidamente uma causa de resultados falso-negativos, em todos os resultados de cariótipo feminino normal em culturas a longo termo de abortamentos era incluído no laudo uma observação indicando esta possibilidade. Se concentrarmos a nossa atenção somente nos casos examinados pela cultura a curto prazo de vilosidades coriônicas, onde a contaminação materna não constitui uma fonte de erro, observamos anormalidades citogenéticas em 56% dos casos, o que é bem concordante com a literatura já citada. O Protocolo 2 incluiu a utilização inicial da citogenética convencional, suplementada pela citogenética molecular quando não havia resultado com a primeira (Tabela 2). Os resultados da citogenética convencional com este protocolo podem ser juntados com os de vilosidades coriônicas da Tabela 1 para aumentar a casuística e torná-la mais confiável. Passamos assim a ter 221 casos anormais em 418 abortamentos estudados (52,9%), distribuídos da seguinte maneira: 69% trissomias, 12,7% triploidias e 10% monossomia X, o que se harmoniza muito bem com a literatura. Para avaliarmos a eficiência e a sensibilidade dos estudos de abortamentos apenas pelo exame direto do DNA, precisamos então comparar os resultados da citogenética convencional conjuntamente das Tabelas 2 e 3 com os obtidos pelo Protocolo 3 (Tabela 3), que faz uso exclusivo de metodologia molecular e que tem as enormes vantagens de ser mais rápido, ter um custo muito menor (ver discussão abaixo) e de permitir resultado em virtualmente 100% dos casos, mesmo naqueles em que os tecidos fetais foram fixados em formol, álcool ou incluídos em parafina. A principal limitação da sensibilidade diagnóstica deste protocolo é o fato de que metodologicamente só é viável o diagnóstico das anormalidades cromossômicas mais comuns. Nós desenvolvemos técnicas moleculares para o diagnóstico de todas as triploidias, da monossomia X e das trissomias dos autossomos 13, 16, 18, 21 e 22 e dos cromossomos sexuais X e Y. Assim, entre os 221 casos anormais observados com a citogenética convencional (Tabelas 2 e 3), 58 (26,2%) são trissomias de outros autossomos, tetraploidias e arranjos estruturais, ou seja, apresentam anomalias não detectáveis pelo protocolo molecular em discussão (Protocolo 3). Isto estabelece um máximo teórico de sensibilidade ao redor de 74% para o protocolo molecular implantado no GENE. Efetivamente observamos 35,2% de anormalidades (Tabela 3) que, se corrigido para a sensibilidade teórica de 74%, fornece uma taxa total estimada de anormalidades de 47,6%, que não é estatisticamente diferente dos 52,9% observados pela citogenética convencional (Z = 1,47; P > 0,14). Assim, concluímos que o protocolo de citogenética molecular está funcionando bem próximo de sua expectativa teórica.
  35. 35. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 34 3.5 Qual dos nossos protocolos é o ideal para estudo de abortamentos? Em termos de sensibilidade diagnóstica não há dúvida que o Protocolo 2 é o melhor, pois combina a alta sensibilidade metodológica da citogenética convencional, que permite o diagnóstico de todas as cromossomopatias, com a robustez da citogenética molecular, garantindo um resultado em virtualmente todos os espécimes. Entretanto, na prática clínica temos de levar em conta considerações de custo e benefício. Os exames de citogenética convencional são tecnicamente complexos e intensivos em trabalho manual e análise especializada ao microscópio, o que os torna muito mais dispendiosos que os exames moleculares. Para os pacientes, os exames moleculares isolados baseados na PCR (Protocolo 3) custam aproximadamente 50% dos exames de citogenética convencional (Protocolo 2), que incluem uma segunda etapa molecular na eventualidade de não se obter um diagnóstico pelo primeiro método. Assim, ao decidir qual estudo fazer, temos de primariamente levar em consideração a situação econômica da família e as indicações para o exame. Em casos de abortamento de repetição, sempre que financeiramente possível, deve ser empregado o Protocolo 2, pois é imperativo trabalhar com sensibilidade diagnóstica elevada para maximizar a probabilidade de obter um resultado anormal conclusivo que possa orientar a conduta médica. No abortamento de repetição é especialmente importante usar metodologia capaz de diagnosticar rearranjos cromossômicos não-balanceados, que poderiam revelar a presença de translocação balanceada em um dos pais e assim elucidar a causa das perdas repetidas. Por outro lado, em casos de primeiro abortamento o Protocolo 3 é o método de escolha quando uma economia financeira for importante. Outros elementos a serem levados em conta na escolha do exame são as condições de coleta dos tecidos fetais e a facilidade e rapidez do transporte deste material ao laboratório. Para citogenética molecular os tecidos têm de ser coletados de maneira rigorosamente estéril e encaminhados com urgência ao laboratório sem nenhum conservante, para garantir a viabilidade dos tecidos. Por outro lado, para utilização exclusiva das técnicas moleculares, a esterilidade não é tão fundamental e é perfeitamente aceitável a fixação dos tecidos fetais em etanol, o que elimina a urgência e permite o envio do material pelo correio mesmo em localidades nas quais o serviço SEDEX não está disponível. Qualquer que seja o protocolo usado, o nosso estudo demonstra claramente que a metodologia molecular desenvolvida pelo GENE e já implantada em sua rotina diagnóstica, representa uma ferramenta de extraordinária utilidade clínica, que fez muito para tornar a investigação genética de abortamentos um exame perfeitamente adaptável à rotina clínica do obstetra moderno, independente de sua localização geográfica. TESTES GENÉTICOS PARA CASAIS COM PERDAS GESTACIONAIS REPETIDAS 1 Introdução O acontecimento de um abortamento na história reprodutiva de um casal deve ser encarado com tranquilidade e não deve ser causa para alarme. Em geral, casais que tiveram um único aborto não tem um risco suficientemente elevado do nascimento de uma criança anormal no futuro para
  36. 36. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 35 justificar investigações genéticas deles mesmos, embora, como já discutido acima, valha a pena, do ponto de vista psicológico, fazer os estudos do material fetal. Quando ocorre um segundo aborto a situação muda, pois levanta-se a suspeita de que um fator sistemático possa estar levando o casal a perdas fetais repetidas. Se o casal tem três abortos consecutivos, sem nenhum nativivo, caracteriza-se o chamado "aborto habitual". Com base em argumentos de custo- benefício, é prática comum entre obstetras pedir o aconselhamento genético ou solicitar testes genéticos do casal apenas após o terceiro aborto. Entretanto, como veremos abaixo, do ponto de vista genético, os casais devem ser sempre investigados após o segundo aborto, inclusive quando há nativivos e os abortos não são consecutivos. O ACOG - American College of Obstetrics and Gynecology9 declara que há indicação para investigação rotineira com relação a apenas três possíveis causas de aborto de repetição no primeiro trimestre: anomalia cromossômica do casal, malformações uterinas maternas e anticorpos anticoagulantes de lupus e anticorpos anti-cardiolipina. Segundo o ACOG não há indicação para testes de toxoplasmose, brucelose, hipotireoidismo, hipertensão e diabetes melito materna nos casais com abortamentos de repetição no primeiro trimestre. Dentre todos os casais com perdas fetais repetidas, uma proporção apresenta anomalias cromossômicas, geralmente translocações balanceadas ou aneuploidias. Estes casos devem ser identificados porque não só eles envolvem uma alta taxa de recorrência de perdas fetais como também um risco aumentado de nascimento de nativivos com aberrações cromossômicas. Isto é devido ao fato de que indivíduos portadores e translocações balanceadas podem produzir diferentes gametas anormais, sendo que em alguns casos a cromossomopatia vai ser compatível com a sobrevida a termo. Tharapel e cols.29 fizeram uma revisão de 79 estudos publicados sobre investigação cromossômica de casais com duas ou mais perdas (um total de perto de 8.000 casais) e obtiveram uma taxa geral de 5,7% de translocações cromossômicas nos casais (3,9% entre as esposas e 1,8% entre os maridos). Esta taxa parecia ser a mesma em casais com duas perdas fetais e com três ou mais perdas. A experiência do Laboratório GENE sobre a proporção de translocações cromossômicas balanceadas em casais com perdas repetidas é similar. Em 2002, revisamos 526 casais com história de mais de uma perda fetal e investigados do ponto de vista cromossômico (cariótipo em sangue). Em 26 destes casais encontramos translocações cromossômicas (4,9%), sendo que 3,6% em mães e 1,6% em pais. Além disso, encontramos mosaicismo cromossômico de um dos pais, geralmente de baixo grau, em 12,7% dos 526 casais estudados. Vamos discutir os casos de translocação e mosaicismo separadamente. 2 Translocações cromossômicas e perdas fetais repetidas - Experiência do Laboratório GENE Como vimos acima, os exames cromossômicos do GENE em casais com perdas fetais repetidas mostram uma frequência de 4,9% de translocações cromossômicas balanceadas, o que é muito similar à literatura mundial. Para verificar se podemos identificar nestes casais fatores indicativos
  37. 37. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 36 de maior risco, fizemos a análise dos casos de acordo com o número de perdas fetais (Tabela 4) e da presença, ou não, de nativivos (Tabela 5). A Tabela 4 mostra claramente que não há diferença significativa entre a frequência de translocações cromossômicas em casais com duas (4,4%), três ou mais perdas gestacionais (5,2%). Já a Tabela 5 evidencia que a frequência gestacional é em maior em casais com história de nativivos, embora a diferença não seja estatisticamente significativa. Assim, os nossos achados, confirmam os dados da literatura: os casais devem ser investigados com estudos cromossômicos (cariótipo) a partir da segunda perda fetal, mesmo que já tenham tido nativivos normais! Tabela 4 - Número de abortos e prevalência de anomalias cromossômicas em casais com duas ou mais perdas fetais No. Perdas Fetais No. Pacientes No. Translocações Cromossômicas % 2 274 12 4,4% 210 11 5,2% Tabela 5 - Número de nativivos e prevalência de anomalias cromossômicas em casais com duas ou mais perdas fetais No. Nativivos No. Pacientes No. Translocações Cromossômicas % 0 364 13 3,6% 132 11 8,3% 3 Mosaicismo cromossômico e perdas fetais repetidas O mosaicismo cromossômico consiste na coexistência de duas linhagens celulares de diferentes constituições cromossômicas no mesmo indivíduo. Como indicado acima, encontramos mosaicismo cromossômico de baixo grau em 12,7% dos casais com duas ou mais perdas fetais estudados. Este número parece bem maior que o esperado. Por exemplo, Sonntag et al.30 encontraram uma prevalência de apenas 3,2% em mulheres que se apresentaram para ICSI por indicações andrológicas, um grupo que se assemelha à população geral. No GENE o mosaicismo foi encontrado na esposa em 93% dos casais e em apenas 11% no marido. Esta diferença é altamente significativa. Em todos os casos o mosaicismo era de baixo grau, ou seja, envolvia menos de 10% de células anormais entre uma maioria de células normais e, na vasta maioria, envolvia apenas os cromossomos sexuais. O fato dos mosaicismos serem de baixo grau e em sua maioria envolverem cromossomos sexuais sugere que eles possam não estar causalmente relacionados com as perdas fetais. Realmente, alguns estudos não confirmaram que a associação entre mosaicismo e perdas fetais repetidas fosse estatisticamente significante32, 33 . Além disso, Sonntag et al.30 não observaram nenhuma diferença nas taxas de fertilizações bem sucedidas, implantações de embriões ou perdas gestacionais de pacientes com mosaicismo de baixo grau em comparação com o grupo de cariótipo normal. Por outro lado, outros autores levantaram a possibilidade de que os
  38. 38. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 37 mosaicismos de baixo grau representem uma manifestação de um aumento de eventos mutacionais cromossômicos (não-disjunções) no sangue da paciente31 . Desta maneira, os mosaicismos poderiam ser indicadores de uma predisposição à produção de ovócitos (ou espermatozoides) com anormalidades cromossômicas e a sua presença então seria uma indicação para estudos pré-natais em gravidezes subsequentes do casal. Assim, o ponto de vista científico, o significado clínico do mosaicismo de baixo grau permanece incerto. Entretanto, considerando que hoje em dia a amniocentese genética é um procedimento simples, confiável e praticamente desprovido de riscos fetais, parece-nos prudente oferecer o diagnóstico pré-natal por amniocentese na 16a semana de gravidez a casais nos quais foi diagnosticada a presença de mosaicismo cromossômico no exame do cariótipo em sangue. 4 Conduta Sugerida para Investigação Genética dos Casais com Perdas Gestacionais Repetidas Vimos acima que anomalias cromossômicas são as causas mais frequentes de perdas fetais, e que cerca de 20% dos casais com perdas fetais repetidas apresentam, eles mesmos, alterações cromossômicas. Ao fazermos exames cromossômicos dos pais e dos fetos em casos de perdas fetais repetidas, podemos, então, encontrar três tipos de combinações possíveis, ou seja: casais com cromossomopatias e fetos com cromossomopatia; casais cromossomicamente normais e fetos com cromossomopatia; e casais cromossomicamente normais e fetos cromossomicamente normais. O primeiro grupo, constituído principalmente por pais com translocações cromossômicas balanceadas, representa o grupo de alto risco genético de repetição da perda fetal, e também de nativivos anormais, sendo este último o acontecimento que deve ser evitado a todo custo. Estes casais podem tentar novas gravidezes, contanto que elas sejam monitorizadas por técnicas citogenéticas de diagnóstico pré-natal (coleta de vilosidades coriônicas ou amniocentese). Recentemente emergiu também a possibilidade de fazer o diagnóstico citogenético pré- implantacional para estes casais. No segundo grupo há uma explicação do motivo das perdas fetais, mas não sabemos o motivo das cromossomopatias fetais repetidas. Alguns estudos têm sugerido que estes casos são predominantemente devidos a efeitos relacionados com a idade materna e que, ademais, pode haver na população considerável variabilidade de risco para aneuploidia fetal34 . Assim, para estes casais há também a indicação de diagnóstico pré-natal em futuras gravidezes. Nós, em geral, recomendamos a amniocentese, que é feita no segundo trimestre, após o período em que as perdas gestacionais são mais comuns. O terceiro grupo não apresenta risco aumentado de nativivos cromossomicamente anormais e, assim, não há indicação clara para o diagnóstico pré-natal. Dentro deste grupo estão os casais com causas maternas de perdas fetais, tais como malformações uterinas, anticorpos anti-cardiolipina etc. e também casais cujos fetos sofrem de doenças genéticas não-cromossômicas tais como os defeitos de fechamento do tubo neural ou doenças autossômicas recessivas.
  39. 39. PERDAS FETAIS DE REPETIÇÃO – FATOR GENÉTICO 38 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Simpson JL. Fetal wastage. In: Gabbe SG, Niebyl Jr, Simpson JL, eds. Gabbe obstetrics - normal and problem pregnancies. 4th ed. Edinburgh; Churchill Livingstone; 2002; 729-749. 2. Pena, SDJ, Martins-da-Costa, HBBL, and Tiritilli, SF. Investigação genética das perdas fetais. In: Isfer, EV, Sanches, RC and Saito, M eds. Medicina fetal São Paulo; Editora Revinter; 1996; 14- 21. 3. Boué A, Boué J. Evaluation des erreurs chromossomiques au moment de la conception. Biomedicine 1973; 18:372-377. 4. Hassold T. Chromosome abnormalities in human reproductive wastage. Trends Genet 1986; 2: 105-110. 5. Ohno M, Maeda T, Matsunobu A A cytogenetic study of spontaneous abortions with direct analysis of chorionic villi. Obstet Gynecol 1991; 77: 394-398. 6. Fritz B, Hallermann C, Olert J, et al.. Cytogenetic analyses of culture failures by comparative genomic hybridisation CGH;-Re-evaluation of chromosome aberration rates in early spontaneous abortions. Eur J Hum Genet 2001; 9:539-547. 7. Wolf GC, Horger EO 3rd . Indications for examination of spontaneous abortion specimens: a reassessment. Am J Obstet Gynecol 1995; 73:1364-1368. 8. U.S. Department of Health and Human Services Reproductive impairments among married couples. In: U.S. Vital and Health Statistics Series 23, No. 11. Hyattsville, MD, National Center for Health Statistics, 1982; 5. 9. American College of Obstetricians and Gynecologists. Recommendations for Management of Recurrent Miscarriage. 2001. http://www.acog.org/from_home/publications/press_releases/nr02-01-01-1.cfm 10. Neugebauer R, Kline J, Shrout P, et al. Major depressive disorder in the 6 months after miscarriage. J Am Med Assn 1997; 277:383-388. 11. Friedman T, Gath D. The psychiatric consequences of spontaneous abortion. Br J Psychiatry 1989; 155:810-813. 12. Frost M, Condon JT. The psychological sequelae of miscarriage: a critical review of the literature. Aust N Z J Psychiatry 1996; 30:54-62. 13. Mutter GL, Pomponio RJ. Molecular diagnosis of sex chromosome aneuploidy using quantitative PCR Nucleic Acids Res 1991; 19: 4203-4207
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