Dna e RNA

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Dna e RNA

  1. 1. 1 DNA e RNA Replicação – Transcrição – Tradução Introdução à Biologia Molecular Alexandre Havt Estrutura dos Ácidos Nucléicos Moléculas com informações para a síntese de proteínas DNA – armazém ou biblioteca celular Contém informações para a construção das células e tecidos Duplicação dos genes garante a perpetuação das espécies Transcrição – síntese de RNA RNA mensageiro (mRNA) RNA transportador (tRNA) RNA ribossômico (rRNA) Tradução – síntese de proteínas a partir das informações dos RNAs Descoberta da estrutura do DNA em 1953 Watson e Crick Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DNA
  2. 2. 2 Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RNA RNA mensageiro - mRNA RNA ribossômico - rRNA Ribossomos Procariotos Citoplasma Mitocôndrias Procariotos Eucariotos 3 tipos de moléculas de rRNA • 16S + 21 proteínas – 30S • 23S • 5S +34 proteínas – 50S Citoplasma de eucariotos 70S 4 tipos de moléculas de rRNA • 18S + 33 proteínas – 40S • 5S • 28S • 5,8S Mitocondriais 55S +50 proteínas – 60S 80S • Propriedades similares ao das bactérias RNA transportador - tRNA Função Transportar aminoácidos para a síntese protéica Assegurar a incorporação dos mesmos na posição correta • anticódon Células com pelo menos 20 tRNA Pequenas moléculas 80 nucleotídeos 4S Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas Formados por blocos monoméricos RNA e DNA • 5 Nucleotídeos Proteínas • 20 aminoácidos Monômeros adicionados 1 por vez Cadeia de formação tem ponto de partida específico com crescimento unidirecional para um terminal fixo Direção 5´ - 3´ Produto primário é frequentemente modificado Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas
  3. 3. 3 Replicação do DNA Replicação do DNA Duplicação do material genético para a divisão celular Replicação é semiconservativa • Uma fita parental e uma nova fita sintetizada Forquilha de replicação Helicases - Separação das duplas fitas Proteínas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximação Primase – síntese de iniciador Topoisomerase • Desenrolam supertorção Ligases – união dos fragmentos de Okasaki DNA polimerases • a - associação com primase para formação do iniciador • d - polimerização das fitas líder e lenta • g - polimerização DNA mitocondrial • b e k h z i - polimerases de reparo Replicação do DNA Eucariótico Síntese de RNA Transcrição Síntese de RNA Transcrição – Síntese de RNA RNA polimerases devem reconhecer O ponto de início da transcrição Qual das fitas deve ser usada como molde – transcrita Região promotora do DNA Controla a ligação da RNA polimerase Identifica o ponto de início da transcrição Controla a frequência da transcrição • Sequências regulatórias no promotor • Sequências perto do promotor • Reforçadores Interagem com proteínas que estabilizam a ligação RNA-polimerase ao promotor
  4. 4. 4 Transcrição Processamento do mRNA Eucariótico Síntese dos rRNAs Eucarióticos Síntese dos tRNAs Eucarióticos Síntese de proteínas Tradução Síntese Protéica - Tradução Ocorre nos ribossomos – rRNA Direcionado pela sequência dos códons de mRNA Cada tRNA traz um aminoácido específico ao seu anticódon Aminoacil-tRNA
  5. 5. 5 Código Genético Primeira base Segunda base Terceira base (5’) U C A G (3’) U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Try Cys C Leu Ser Parada Parada A Leu Ser Parada Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Formação do aminoacil-tRNA Aminoacil-tRNA tRNA ligado covalentemente a um aminoácido na terminação 3’ Cada aminoácido com seu tRNA • Alanil-tRNAala • Metionil-tRNAi met 20 Aminoacil-tRNA-sintetases Processo dependente de ATP Ocorre em 2 passos • Formação do complexo: enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato • Transferência do aminoácido ativo Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose Nucleotídeo de adenina (CCA) Processo da Tradução Envolvimento de 3 passos Iniciação Alongamento Terminação Iniciação Alongamento – Ligação Peptídica – Translocação Terminação Códons de parada Inexistência de tRNA com anticódons que possam parear com • UAA • UGA • UAG Fatores de liberação unem-se ao ribossomo Hidrólise da ligação peptidiltransferase • Cadeia peptídica • tRNA Peptídeo sintetizado é liberado Dissociação das subunidades do ribossomo • Liberação do mRNA
  6. 6. 6 Polissomos Ligação de vários ribossomos ao mRNA Cada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mRNA Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos Técnicas de Biologia Molecular Reação de Polimerase em Cadeia – PCR Função - Multiplicação de trecho específico de DNA • Problema – análise de ácidos nucleicos Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos Primers Taq – DNA polimerase (Thermus aquaticus) • Enzima termoestável em temperatura até 117 °C • Temperatura ótima 72 °C Início – vários banhos maria com diferentes temperaturas 1987 – publicação do artigo de Mulis na Methods in Enzymology 1989 – primeiro termociclador 1994 – Nobel em química para Karis Mulis Karis Mulis Técnicas de Biologia Molecular Fundamentos do PCR Desnaturação das cadeias de DNA à 94 °C Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer) Extensão – incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 °C Reagentes essenciais Taq – em solução de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM DTT, 50% glicerol Tampão – 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl Cloreto de magnésio – cofator para ação da enzima Desoxinucleotídios (ATP, TTP, CTP, GTP) – mistura de [ ]’s iguais Primers específicos à sequência que se deseja amplificar Técnicas de Biologia Molecular Vídeo da reação de PCR Técnicas de Biologia Molecular Fundamentos da Transcriptase Reversa Vírus de RNA tipo VI • Enzima transcriptase reversa • Genoma de RNA orienta a formação de uma molécula de DNA AMV - Vírus da Mieloblastose aviária M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus) Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do mRNA Síntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA) Sequências de cDNA específico podem ser amplificados por PCR CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT mRNA cDNA CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT mRNA cDNA CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT cDNA RNAse I CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT cDNA PCR
  7. 7. 7 Técnicas de Biologia Molecular Isolamento de RNA Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível – evitar RNAse Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg) Método muito utilizado Reagente TRIZOL Isolamento de RNA por TRIZOL Fenol + Isotiocianato de guanidine Membranas celulares e nucleares destruídas Manutenção da integridade do RNA Maceração da amostra com TRIZOL Clorofórmio – separação em 3 fases RNA – sobrenadante DNA – camada intermediária Protéinas – camada inferior Precipitação com Isopropanol Lavagem com Etanol 75% Leitura em espectrofotômetro 260nm – quantidade ( A260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/uL]) Razão 260nm/280nm – qualidade do RNA ( @ 2,00) Amostra 100 mg + 1 mL de TRIZOL Homogeneizar • Centrifugar 12.000 g 10 min. 2- 8 °C • Remover sobrenadante p/ novo tubo • Acrescentar 200 uL de clorofórmio Vórtex por 15 sec. Incubar RT °C p/ 2-3 min Centrifugar 12.000 g p/ 15 min • Remover sobrenadante transparente para novo tubo • Acrescentar 500 uL de isopropanol • Incubar RT °C 10 min • Centrifugar 12.000 g p/ 15 min à 2 – 8 °C • Descartar sobrenadante • Acrescentar 3x 1mL de etanol 75% • Centrifugar 3x a 7.500 g por 5 minutos à 2 – 8 °C • Descartar 3° sobrenadante • Evaporar etanol •Solubilizar pellet com ddH2O autoclavada •Leitura espectrofotômetro Análise por Eletroforese Principio básico O DNA tem carga negativa Aplicando uma voltagem as moléculas de DNA migrariam para o catodo Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separando-o por tamanho • Moléculas menores migram mais rápido • Moléculas maiores migram mais lento A distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de tamanho conhecido Análise por Eletroforese Principio básico Agarose – polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão eletrolítico • Tris-Acetato-EDTA – TAE • Tris- Borato-EDTA • Solubilização do gel por esfriamento Aumento da viscosidade da amostra com glicerol Visualizaçãoda corrida da amostra com corante – bromofenol blue Visualização do DNA no gel por brometo de etídeo Cuba de Eletroforese Horizontal
  8. 8. 8

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