O documento descreve os processos de replicação, transcrição e tradução do DNA e RNA. Primeiro, explica a estrutura do DNA e RNA e suas funções na armazenagem e transmissão de informações genéticas. Em seguida, detalha os processos de replicação do DNA, transcrição do RNA e tradução das proteínas. Por fim, apresenta técnicas comuns de biologia molecular como PCR, transcriptase reversa e eletroforese em gel de agarose.
DIGNITAS INFINITA - DIGNIDADE HUMANA -Declaração do Dicastério para a Doutrin...
Dna e RNA
1. 1
DNA e RNA
Replicação – Transcrição – Tradução
Introdução à Biologia Molecular
Alexandre Havt
Estrutura dos Ácidos Nucléicos
Moléculas com informações para a síntese
de proteínas
DNA – armazém ou biblioteca celular
Contém informações para a construção
das células e tecidos
Duplicação dos genes garante a
perpetuação das espécies
Transcrição – síntese de RNA
RNA mensageiro (mRNA)
RNA transportador (tRNA)
RNA ribossômico (rRNA)
Tradução – síntese de proteínas a partir das
informações dos RNAs
Descoberta da estrutura do DNA em 1953
Watson e Crick
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA
Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DNA
2. 2
Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RNA RNA mensageiro - mRNA
RNA ribossômico - rRNA
Ribossomos
Procariotos
Citoplasma
Mitocôndrias
Procariotos
Eucariotos
3 tipos de moléculas de rRNA
• 16S + 21 proteínas – 30S
• 23S
• 5S
+34 proteínas – 50S
Citoplasma de eucariotos
70S
4 tipos de moléculas de rRNA
• 18S + 33 proteínas – 40S
• 5S
• 28S
• 5,8S
Mitocondriais
55S
+50 proteínas – 60S
80S
• Propriedades similares ao das
bactérias
RNA transportador - tRNA
Função
Transportar aminoácidos para
a síntese protéica
Assegurar a incorporação dos
mesmos na posição correta
• anticódon
Células com pelo menos 20 tRNA
Pequenas moléculas
80 nucleotídeos
4S
Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e
Proteínas
Formados por blocos monoméricos
RNA e DNA
• 5 Nucleotídeos
Proteínas
• 20 aminoácidos
Monômeros adicionados 1 por vez
Cadeia de formação tem ponto de partida específico com
crescimento unidirecional para um terminal fixo
Direção 5´ - 3´
Produto primário é frequentemente modificado
Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e
Proteínas
3. 3
Replicação do DNA
Replicação do DNA
Duplicação do material genético para a divisão celular
Replicação é semiconservativa
• Uma fita parental e uma nova fita sintetizada
Forquilha de replicação
Helicases - Separação das duplas fitas
Proteínas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximação
Primase – síntese de iniciador
Topoisomerase
• Desenrolam supertorção
Ligases – união dos fragmentos de Okasaki
DNA polimerases
• a - associação com primase para formação do iniciador
• d - polimerização das fitas líder e lenta
• g - polimerização DNA mitocondrial
• b e k h z i - polimerases de reparo
Replicação do DNA Eucariótico
Síntese de RNA
Transcrição
Síntese de RNA Transcrição – Síntese de RNA
RNA polimerases devem reconhecer
O ponto de início da transcrição
Qual das fitas deve ser usada como molde – transcrita
Região promotora do DNA
Controla a ligação da RNA polimerase
Identifica o ponto de início da transcrição
Controla a frequência da transcrição
• Sequências regulatórias no promotor
• Sequências perto do promotor
• Reforçadores
Interagem com proteínas que estabilizam
a ligação RNA-polimerase ao promotor
4. 4
Transcrição Processamento do mRNA Eucariótico
Síntese dos rRNAs Eucarióticos Síntese dos tRNAs Eucarióticos
Síntese de proteínas
Tradução
Síntese Protéica - Tradução
Ocorre nos ribossomos – rRNA
Direcionado pela sequência dos códons
de mRNA
Cada tRNA traz um aminoácido
específico ao seu anticódon
Aminoacil-tRNA
5. 5
Código Genético
Primeira base Segunda base Terceira base
(5’) U C A G (3’)
U Phe Ser Tyr Cys U
Phe Ser Try Cys C
Leu Ser Parada Parada A
Leu Ser Parada Trp G
C Leu Pro His Arg U
Leu Pro His Arg C
Leu Pro Gln Arg A
Leu Pro Gln Arg G
A Ile Thr Asn Ser U
Ile Thr Asn Ser C
Ile Thr Lys Arg A
Met Thr Lys Arg G
G Val Ala Asp Gly U
Val Ala Asp Gly C
Val Ala Glu Gly A
Val Ala Glu Gly G
Formação do aminoacil-tRNA
Aminoacil-tRNA
tRNA ligado covalentemente a um
aminoácido na terminação 3’
Cada aminoácido com seu tRNA
• Alanil-tRNAala
• Metionil-tRNAi
met
20 Aminoacil-tRNA-sintetases
Processo dependente de ATP
Ocorre em 2 passos
• Formação do complexo:
enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato
• Transferência do aminoácido ativo
Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose
Nucleotídeo de adenina (CCA)
Processo da Tradução
Envolvimento de 3 passos
Iniciação
Alongamento
Terminação
Iniciação
Alongamento – Ligação Peptídica – Translocação Terminação
Códons de parada
Inexistência de tRNA com anticódons que possam parear com
• UAA
• UGA
• UAG
Fatores de liberação unem-se ao ribossomo
Hidrólise da ligação peptidiltransferase
• Cadeia peptídica
• tRNA
Peptídeo sintetizado é liberado
Dissociação das subunidades do ribossomo
• Liberação do mRNA
6. 6
Polissomos
Ligação de vários ribossomos ao mRNA
Cada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mRNA
Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos
Técnicas de Biologia Molecular
Reação de Polimerase em Cadeia – PCR
Função - Multiplicação de trecho específico de DNA
• Problema – análise de ácidos nucleicos
Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos
Primers
Taq – DNA polimerase (Thermus aquaticus)
• Enzima termoestável em temperatura até 117 °C
• Temperatura ótima 72 °C
Início – vários banhos maria com diferentes temperaturas
1987 – publicação do artigo de Mulis na Methods in
Enzymology
1989 – primeiro termociclador
1994 – Nobel em química para Karis Mulis
Karis Mulis
Técnicas de Biologia Molecular
Fundamentos do PCR
Desnaturação das cadeias de DNA à 94 °C
Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer)
Extensão – incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 °C
Reagentes essenciais
Taq – em solução de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM
DTT, 50% glicerol
Tampão – 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl
Cloreto de magnésio – cofator para ação da enzima
Desoxinucleotídios (ATP, TTP, CTP, GTP) – mistura de [ ]’s
iguais
Primers específicos à sequência que se deseja amplificar
Técnicas de Biologia Molecular
Vídeo da reação de PCR
Técnicas de Biologia Molecular
Fundamentos da Transcriptase Reversa
Vírus de RNA tipo VI
• Enzima transcriptase reversa
• Genoma de RNA orienta a formação de uma molécula de DNA
AMV - Vírus da Mieloblastose aviária
M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus)
Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do
mRNA
Síntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA)
Sequências de cDNA específico podem ser amplificados por PCR
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
mRNA
cDNA
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA
GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
mRNA
cDNA
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA
GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
cDNA
RNAse I
CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA
GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT
cDNA
PCR
7. 7
Técnicas de Biologia Molecular
Isolamento de RNA
Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível –
evitar RNAse
Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg)
Método muito utilizado Reagente TRIZOL
Isolamento de RNA por TRIZOL
Fenol + Isotiocianato de guanidine
Membranas celulares e nucleares destruídas
Manutenção da integridade do RNA
Maceração da amostra com TRIZOL
Clorofórmio – separação em 3 fases
RNA – sobrenadante
DNA – camada intermediária
Protéinas – camada inferior
Precipitação com Isopropanol
Lavagem com Etanol 75%
Leitura em espectrofotômetro
260nm – quantidade ( A260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/uL])
Razão 260nm/280nm – qualidade do RNA ( @ 2,00)
Amostra 100 mg
+
1 mL de TRIZOL
Homogeneizar
• Centrifugar 12.000 g
10 min. 2- 8 °C
• Remover
sobrenadante p/ novo
tubo
• Acrescentar 200 uL
de clorofórmio
Vórtex por 15 sec.
Incubar RT °C p/ 2-3
min
Centrifugar 12.000 g p/
15 min
• Remover sobrenadante
transparente para novo
tubo
• Acrescentar 500 uL de
isopropanol
• Incubar RT °C 10 min
• Centrifugar 12.000 g p/
15 min à 2 – 8 °C
• Descartar sobrenadante
• Acrescentar 3x 1mL de
etanol 75%
• Centrifugar 3x a 7.500 g
por 5 minutos à 2 – 8 °C
• Descartar 3° sobrenadante
• Evaporar etanol
•Solubilizar pellet com
ddH2O autoclavada
•Leitura espectrofotômetro
Análise por Eletroforese
Principio básico
O DNA tem carga negativa
Aplicando uma voltagem as moléculas de DNA migrariam para o
catodo
Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separando-o
por tamanho
• Moléculas menores migram mais rápido
• Moléculas maiores migram mais lento
A distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de
tamanho conhecido
Análise por Eletroforese
Principio básico
Agarose – polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão
eletrolítico
• Tris-Acetato-EDTA – TAE
• Tris- Borato-EDTA
• Solubilização do gel por esfriamento
Aumento da viscosidade da amostra com glicerol
Visualizaçãoda corrida da amostra com corante – bromofenol blue
Visualização do DNA no gel por brometo de etídeo
Cuba de Eletroforese Horizontal