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SAÚDE-UNIFOR
DISCIPLINA: BIOLOGIA
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PROFESSORA: DANIELLE
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Toshio Hirano*
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CONCEITOS TEÓRICOS
• Clonagem molecular: Construção de uma molécula de
DNA recombinante e sua propagação em hospedeiro
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CONCEITOS TEÓRICOS
• Inserto: Fragmento de DNA que se tem interesse em
estudar ( expressar ou reproduzir). A união de um
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CLONAGEM
CLONAGEM
ARTIGO
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QUANTITATIVA UTILIZANDO PLASMÍDIO CLONADO COM
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INTRODUÇÃO
Importância do diagnóstico do CMV- Grande incidência –
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CITOMEGALOVIRUS
Genoma: 240kb,envelope de
bicamada proteica- 8 proteínas –
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LACUNAS
1. Prevalência alta- Presença do vírus ocasionando a
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2. Latente- PMN OU replicação viral ativa?
3.Detecção...
MATERIAIS E MÉTODOS
• Explicação do método Semi-
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indireta por comparação pareada da
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CLONAGEM PLASMIDIAL
1. Plasmídio bacteriano pCRII (Invitrogen-USA)
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CLONAGEM
DOS
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Kanam
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CLONAGEM
MATERIAIS E MÉTODOS
• Sequenciamento- Comparando o genoma do CMV ao
plasmidio-inserto - PCR de sequenciamneto –Thermo
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RESULTADOS
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SEQUENCIAMENTO
CÁLCULO DO NÚMERO DE PLASMÍDIOS
• Após purificado o plasmídio: 200 mcl-176 mcg
DNA/ml
• Verificação do número de plasmídio...
SENSIBILIDADE DA PCR DAS ALÍQUOTAS
CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS
• Cálculo para determinar a CV das amostras feito a
partir das densidades das...
CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS
DISCUSSÃO
1. Plasmídio clonado mostrou alta homologia com a cepa
de CMV (98%).
2. Leitura das bandas ponto-chave e manter ...
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Clonagem molecular, Método PCR semi-quantitativo, método indireto de PCR para medida de CMV em soro humano. Molecular cloning, sequencing, PCR semi- quantitative for CMV.

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  1. 1. CLONAGEM M OLECULAR M ESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE-UNIFOR DISCIPLINA: BIOLOGIA M OLECULAR PROFESSORA: DANIELLE M ALTA ALUNA: LUCIANNA AUXI COSTA
  2. 2. HISTÓRICO DA CLONAGEM: 1986- IL4, IL5 E IL6 Revisiting the 1986 molecular cloning of interleukin 6 Toshio Hirano* Osaka University, Suita, Osaka, Japan *Correspondence: hirano@molonc.med.osaka-u.ac.jp Edited by: Kendall A. Smith,Weill Medical College of Cornell University, USA Artigo original na NATURE-1986
  3. 3. CONCEITOS TEÓRICOS • Clonagem molecular: Construção de uma molécula de DNA recombinante e sua propagação em hospedeiro apropriado que possibilite a seleção deste DNA. Introdução de um gene dentro de um vetor, através das enzimas de restrição ( enzimas modificadoras do DNA- reconhecem determinados pares de base e clivam) e o propaga dentro de um organismo (célula) hospedeiro (a) para estudá-lo.
  4. 4. CONCEITOS TEÓRICOS • Inserto: Fragmento de DNA que se tem interesse em estudar ( expressar ou reproduzir). A união de um inserto e um vetor dará origem a uma molécula chamada QUIMÉRICA (DNA recombinante). • DNA Recombinante será trasnfectado para dentro de uma célula onde se reproduzirá independente ou não da reprodução do próprio material genético. Essa célula será dita CÉLULA TRANSFORMADA.
  5. 5. CLONAGEM
  6. 6. CLONAGEM
  7. 7. ARTIGO DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA SEMI- QUANTITATIVA UTILIZANDO PLASMÍDIO CLONADO COM PARTE DO GENE Gb DE CITOMEGALOVÍRUS Descrição de métodos, técnicas e instrumentais Medicina, Ribeirão Preto-2002 Lauro J Marin, Aldo A Cunha, Victor H Aquino e Luiz TM Figueredo.
  8. 8. INTRODUÇÃO Importância do diagnóstico do CMV- Grande incidência – 100% • Grande variedade de Síndromes Clínicas- Doenças agudas, transmissões verticais e sangue, imunodeficiência. Pneumonias e pneumonites,retinites,meningoencefalites,mielites, polirradiculopatia, úlceras gastrointestinais etc... • Atualmente: RN/Transplantados e HIV/AIDS
  9. 9. CITOMEGALOVIRUS Genoma: 240kb,envelope de bicamada proteica- 8 proteínas – glicoproteínas gB e gH- Sítios antigênicos para Ac neutralizantes.
  10. 10. LACUNAS 1. Prevalência alta- Presença do vírus ocasionando a doença? 2. Latente- PMN OU replicação viral ativa? 3.Detecção de doença: PCR-Tempo Real- Oneroso. 4. Assintomatologia ou baixa clínica- 90% dos casos!!!!!!!!!!!!
  11. 11. MATERIAIS E MÉTODOS • Explicação do método Semi- quantitativo-PCR: É uma medida indireta por comparação pareada da medida dos plasmídeos clonados com os teores virais da amostra obtida dos pacientes.
  12. 12. CLONAGEM PLASMIDIAL 1. Plasmídio bacteriano pCRII (Invitrogen-USA) Gene gB com 296 pb- 81874-82176, cepa 169 Dois primers- gB 1 e gB2 PCR convencional: 35 ciclos (Tecne-England) Eletroforese em gel de Agarose 2%, azul de bromofenol 0,25% em sacarose 40%. Brometo de etídio Bandas com tamanho de 100pb de peso molecular
  13. 13. CLONAGEM DOS PLASM ÍDIOS Gens que conferia resistência à Kanam icina e Am picilina. Após clonagem e escolha dos plasm ídios-lise das colônias e com paração do tem anho do genom a por Eletroforese.
  14. 14. CLONAGEM
  15. 15. MATERIAIS E MÉTODOS • Sequenciamento- Comparando o genoma do CMV ao plasmidio-inserto - PCR de sequenciamneto –Thermo sequenase (Amersham Pharmacia- USA). Armazenada em computador utilizando o programa SEQ 4x4 Basecaller (Amersham Pharmacia-Canadá) e WinDNAsis (Hitachi-Japan)- gene gB CMV 169. • Quantificação dos plasmídios- Espectofotômetro- absorbância de 290nm. Diluições decimais variadas.
  16. 16. RESULTADOS
  17. 17. RESULTADOS-
  18. 18. SEQUENCIAMENTO
  19. 19. CÁLCULO DO NÚMERO DE PLASMÍDIOS • Após purificado o plasmídio: 200 mcl-176 mcg DNA/ml • Verificação do número de plasmídios no lote: PM médio de um par de bases nitrogenadas 660 e multiplicou-se esse valor por n. de pares de bases do mesmo: 1400190. • PM do plasmídio: 1400190 g- 6,02 x 10 23 mol plasmidiais ( N. de Avogadro) • Número de plasmídio da amostra de DNA 176 mcg/ml-3,83 x 1018. • Amostras aliquotadas em 50mcl.
  20. 20. SENSIBILIDADE DA PCR DAS ALÍQUOTAS
  21. 21. CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS • Cálculo para determinar a CV das amostras feito a partir das densidades das bandas das soluções decimais. Ex. Material clínico com banda de 50991 que fica entre 30307 (8670) – 61177 (86700): 30870 • Intervalo entre banda amostral (50991) e banda plasmidial mais diluída (30307): 20684 • Regra de 3: Intervalo da banda amostral 3870-100% e 20640 x: 67%
  22. 22. CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS
  23. 23. DISCUSSÃO 1. Plasmídio clonado mostrou alta homologia com a cepa de CMV (98%). 2. Leitura das bandas ponto-chave e manter as concentrações das soluções. 3. Sequenciamneto e diluições lógicas. Diliução até 867 plasmídios por mcg de DNA mostrou-se adequada aos graus de infecções agudas.. Baixo custo e rápida.
  24. 24. OBRIGADA!

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