Biotecnologia industrial vol. 2 valter borzani - 1ª ed. pt.

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Biotecnologia industrial vol. 2 - Completo

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Biotecnologia industrial vol. 2 valter borzani - 1ª ed. pt.

  1. 1. Coordenadores: WILLIBALDO SCHMIDELL URGEL DE ALMEIDA LIMA EUGÊNIO AQUARONE WALTER BORZANI BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL. VOLUME 11 ENGENHARIA BIOQUÍMICA ~EDITORA EDGARD BLÜCHER LTDA. ' 111 / By W. S.
  2. 2. ,W-1-1-I-1_1 1L_. ... _. ... _ a 11- .J - .. __t.__-, _1,' • • a 11- a 11 • - 1 - l 1 ----r-.J ----.l • ar-"" r-""- v Este conjunto de quatro volumes, reunidos sob o título amplo de BIOTEC- NOLOGIA INDUSTRIAL,é o resultado do trabalho de um grupo de profissionais com vistas à atualização da coleção BIOTECNOLOGIA, cuja publicação foi iniciada em 1975 e terminada em 1983. A experiência acumulada e as muitas mudanças ocorridas nestes últimos vinte anos, ao lado da indiscutível e crescente importância das aplicações da BIOTEC- NOLOGIA em diversos setores de produção de bens e serviços, justificam plena- mente - assim pensam os Coordenadores e o Editor desta nova Coleção - esta primeira atualização, principalmente pelo fato de se destinar ao ensino em cursos de graduação. Nosso primeiro objetivo, nesta Apresentação, é tomar conhecimento do que, hoje, se entende por BIOTECNOLOGIA, e do que vem a ser BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL. Ademarcação nítida do campo de atuação de qualquer ramo do conhecimento é sempre tarefa muito difícil, para não dizer impossível. Tanto isto é verdade que, com certa freqüência, tratados relativos a um dado setor do conhecimento atacam diretamente o exame de uma série de temas sem tentar esboçar, preliminarmente, um quadro que, em largos traços, indique os objetivos e as apJjcações do que vai ser estudado. Tal maneira de agir, principalmente em cursos de graduação, não nos parece aconselhável. Julgamos importante, no início dos estudos, a apresentação de um panorama que dê, aos alunos, uma idéia, ainda que não bem definida, daqueles objetivos e aplicações. Não nos parece que seja imprescindível transcrever, aqui, todas as propostas de "definição" do que se deva entender por Biotecnologia. Algumas delas serão suficientes para que seja possível alcançar nosso objetivo. Iniciaremos com a proposta que o Prof. Antonio Paes de Carvalho, em seu trabalho intitulado "Patentes para a Biotecnologia", apresentou, em dezembro de · 1993, em reunião realizada na Academia Brasileira de Ciências: "Entende-se por Biotecnologia o conjunto de conhecimentos, técnicas e métodos, de base científica ou prática, que permite a utilização de seres vivos como parte integrante eativa do processo de produção industrial de bens e serviços".
  3. 3. VI O Office ofTechnologyAssessment, por sua vez, "definiu" Biotecnologia como sendo: . "O conjunto de processos industriais que englobam processos biológicos". Por outro lado, a Union Intemationale de Chimie Pure et Appliquée, concei- tuou Biotecnologia como: "Aplicação da Bioquímica, da Biologia, da Microbiologia eda Engenharia Química aos processos eprodutos industriais (incluindo os produtos relativos à saúde, energia eagricultura) eao meio ambiente". Finalmente, o ConselhoNacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, "definiu" Biotecnologia nos seguintes termos: "A utilização de sistemas celulares para obtenção de produtos ou desenvolvimento de processos industriais". . As poucas tentativas de definição aqui transcritas mostram, nitidamente, que a Biotecnologia tem por base vários ramos do conhecimento que poderiam ser classificados de FUNDAMENTAIS (como, por exemplo, Bioquímica, Fisiologia, Genética, Microbiologia, Virologia, Botânica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros que poderiam ser agrupados sob a denominação genérica de ENGENHARIAS (prin- cipalmente a Engenharia Química). Trata-se, portanto, de um campo de trabalho tipicamente multidisciplinar, o que toma absolutamente imprescindível a efetiva colaboração de profissionais atuantes em diferentes setores do conhecimento. Destaque-se, porém, que essa atividade multidisciplinar não deve ser enten- dida como resultante de uma simples justaposição de profissionais, cada um deles com sua formação especializada e preocupado apenas com sua área específica. Importa que seja, de fato, um trabalho de vários profissionais efetivamente integrados, de modo que cada um deles tenha conhecimento, obviamente não aprofundado, dos princípios e das técnicas dos campos de atuação dos demais. Assim, apenas para citar um exemplo, caso um microbiologista participe de um grupo que estuda a otimização de um dado processo, é desejável que tenha alguns conhecimentos, mesmo que superficiais, a respeito das estratégias empregadas para a modelagem matemática. Vice-versa, o especialista em modelagem deve efetuar um esforço adicional para compreender as características do sistema microbiano em estudo, a fim de incorporá-las ao modelo. Somente desta forma a atividade multidisciplinar efetivamente existirá e poderá ser mais eficiente.
  4. 4. VIl Se é verdade, por um lado, que a Biotecnologia só passou a ser considerada altamenteprioritária há relativamente pouco tempo, também é verdade, por outro, que processos biotecnológicos vêm sendo utilizados na produção de vários bens, principalmente alimentos, desde a mais remota antigüidade. Basta, neste particu- lar, fazer referência ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na Babilônia e no Egito (8.000 a 6.000 anos a.C.), à produção de pão, utilizando · fermentos, no Egito (4.000 anos a.C.) e à produção de vinhos na Grécia (2.000 a.C.). A Biotecnologia encontra muitas aplicações importantes nas seguintes áreas de atividade: • Agricultura • Pecuária • Saúde • Preservação do meio ambiente • Indústria Suas aplicações na indústria constitutem o objetivo primordial da Biotec- nologia Industrial. A Fig. 1, adaptada de um artigo publicado pelo Prof. Rainer Jonas, é uma boa representação gráfica da "localização" da Biotecnologia Indus- trial e de sua interação com outros ramos do conhecimento. Figura I - Representação esquemática da interação da Biotecnologia Industrial com outros ramos do conhe- cimento.
  5. 5. VIII Convém, finalmente,,ressaltar que, como ocorre em outros campos de trabalho, as áreas de aplicação da Biotecnologia, anteriormente apontadas, não são "gavetas" estanques. Há entre elas, freqüentemente, fortes interações. Apenas para citar um exemplo, considere-se o caso de uma dada vacina, desenvolvida na área da Saúde. Na etapa final de produção dessa vacina em larga escala surgirão, muito provavel- mente, problemas de cunho tecnológico e de engenharia que poderão tomar impres- cindível a efetiva participação da Biotecnologia Industrial na busca das soluções mais adequadas. A presente Coleção consta de quatro volumes. No primeiro- FUNDAMEN- TOS - reúnem-se, como o próprio nome claramente indica, temas fundamentais indispensáveis ao estudo de processos biotecnológicos. O segundo-ENGENHA- RIA BIOQUÍMICA- focaliza os principais problemas de engenharia envolvidos naqueles processos, ao lado de assuntos correlatos de âmbito mais geral, mas im- portantes na produção em larga escala. Os dois últimos volumes - PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUÇÃO DE ALIMENTOS - foram dedicados à descrição e discussão de processos biotecno- lógicos de importância industrial. Todos os temas foram tratados partindo-se do pressuposto de que a obra se destina, primordialmente, a cursos de graduação. A bibliografia indicada no final de cada capítulo poderá servir como ponto de partida pára os que pretenderem um exame mais aprofundado de um ou outro tópico. Os Coordenadores, o Editor e, seguramente, também os Autores, agradecem todas as sugestões relativas à estrutura da Coleção ou de qualquer de suas partes, bem como a identificação de falhas ou incorreções, infelizmente sempre possíveis, que lhes sejam encaminhadas pelo leitor. Literatura Recomendada 1) Anciães, W. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial. CNPq, Brasília, 1985. 2) Haelm, H. Bioquímica de las fermentaciones. Aguilar S.A. de Ediciones, Madri, 1956. 3) Jonas, R. GBF -Scientific Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990. 4) Paes de Carvalho, A. Patentes para a Biotecnologia. Apresentadó à Academia Brasileira de Ciências em 6.12.1993.
  6. 6. IX Cuando la colección "Biotecnologia", editada por los profesores Eugênio Aquarone, Walter Borzani y Urgel de Almeida Lima, apareció en 1975, causó un hondo impacto entre los biotecnólogos latinoamericanos. Se trató de la primera obra sobre el tema escrita y publicada en nuestra región y representá una contribución especialmente valiosa al estudio y ensefianza de esa pujante disciplina. "Biotecnologia" constó originalmente de tres volúmenes: Tecnologia das Fermentações, Tópicos de Microbiologia Industrial y Engenharia Bioquímica, a los cuales se sumó en 1981 Corrosão Microbiológica y luego Alimentos e Bebidas produzidos por Fermentação en 1983. Ahora, pasados ya más de veinte afios, losmismos editores, com la participación del profesor Willibaldo Schmidell, nos brindam la oportunidad de apreciar y disfrutar la nueva colección "Biotecnologia Industrial" como una sucesora natural de "Biotecnologia". El contenido de la nueva obra há sido totalmente renovado y actualizado en concordancia com los notables avances experimentados por el conocimiento en esta área en las últimas décadas,.incluyendo las modernas técnicas de la ingeniería genética y el uso de microorganismos recom- binantes en bioprocesos. · La nueva colección está dividida en cuatro volúmenes que abarcan los mas variados tópicos relacionados com la biotecnología industrial: Fundamentos, Ingeniería Bioquímica, Procesos Fermentativos y Enzimáticos y Biotecnología en la Produccción de Alimentos.En total son 74 capítulos escritos por distinguidos especialistasbrasileros, conteniendo información actualizada acerca tanto de los aspectos básicos como de los aplicados de la utilización de células microbianas y no microbianas para finalidades productivas. El Volumen 1, Fundamentos, entrega un completo panorama del estado del conocimiento en microbiología, genética, bioquímica y enzimología, finalizando com un panorama de las aplicaciones industriales de la biotecnología, abriendo así el camino a los próximos volúmenes. En el Volumen 2, Ingeniería Bioquímica, se exponen los principales aspectos relacionados com la cuantificación de los procesos microbianos y enzimáticos y el disefio y operación de los equipos de proceso requeridos en una instalación industrial. El Volumen 3~ Procesos Fermentativos y Enzimáticos, presenta y discute la aplicación de los microorganismos a la producción de una amplia gama de metabolitos y enzimas de interés práctico, el uso de enzimas como biocatalizadores industriales y la aplicación de los procesos microbianos a diversos sectores industriales y a la descontaminación de efluentes líquidos y resíduos sólidos. Finalmente, el Volumen 4, Biotecnología en la Producción de Alimentos,
  7. 7. X detalla la aplicación de la biotecnología a una amplia variedad de industrias de ese importante sector. Por su estructura y contenido, y por la indiscutible autoridad de sus editores y autores, estoy cierto que Biotecnologia Industrial está destinada a constituirse en una obra insustituíble para la ensefi.anza universitaria de pre y post-grado, así como también en una valiosa fuente de consulta para el biotecnólogo en la industria. Fernando Acevedo Profesor Escuela de Ingeniería Bioquímica Universidad Católica de Valparaíso Valparaíso, Chile
  8. 8. XI aU a.LJ_,_• • • • I - ..... ~ l , Adalberto Pessoa Junior Professor Doutor Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil Aberto Colli Badino Jr. Professor Adjunto I Universidade Féderal de São Carlos Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 676 13565-905, São Carlos, SP, Brasil Antonio Bonomi .Pesquisador Coordenador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química , Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Beatriz Vahan Kilikian Professora Associada Universidade de São Paulo Escola Politécnica Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 61548 05424-970, São Paulo, SP, Brasil Deise Maria Fontana Capalbo Pesquisadora Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária EMBRAPA/CNPMA Rodovia SP 340, km 127,5 Caixa Postal, 69 13820-000, Jaguariúna, SP, Brasil Haroldo Hiss Pesquisador Científico Insituto Butantã Av. Vital Brasil, 1500 05503-900, São Paulo, SP, Brasil Iracema de Oliveira Moraes Professora Titular Universidade de Guarulhos Centro de CiênCias Exatas e Tecnológicas Praça Teresa Cristina, 1 07033-070, Guarulhos, SP, Brasil ·João Carlos Monteiro de Carvalho Professor Doutor Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil José Geraldo da Cruz Pradella Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Josef Emst Thiemann Pesquisador Sênior Biobrás S.A. Avenida C, 1413- Distrito Industrial Caixa Postal, 377 39404-004, Montes Claros, MG, Brasil.
  9. 9. XII Luiz Carlos Urenha Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Manuel Filgueira Barrai Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Maria Cândida Reginato Facciotti Professora Titular Universidade de São Paulo Escola Politécnica Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 61548 05424-970, São Paulo, SP, Brasil Maria Filomena de Andrade Rodrigues Pesquisadora Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Michele Vitolo Professor Titular Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia . Bioquímico-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil Pedro Sérgio Pereiralima Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão de Mecânica e Eletricidade Agrupamento de Sistemas de Controle Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Rafael Almudi Villen Professor Associado Centro Universitário do Instituto Mauá de Tecnologia Escola de Engenharia Mauá Departamento de Engenharia Química e de Alimentos Praça Mauá, 1 09580-900, São Caetano do Sul, SP, Brasil Sunao Sato Professor Titular Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil Urgel de Almeida Lima Professor Pleno Centro Universitário do Instituto Mauá de Tecnologia Escola de Engenharia Mauá Departamento de Engenharia Química e de Alimentos Praça Mauá, 1 09580-900, São Caetano do Sul, SP, Brasil · · Vanildo Luiz Del Bianchi Professor Doutor Universidade Estadual Paulista Intituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas Rua Cristovão Colombo, 2265 15054-000, São José do Rio Preto, SP, Brasil
  10. 10. Walter Borzani Professor Pleno Centro Universitário do Instituto Mauá de Tecnologia Escola de Engenharia Mauá Departamento de Engenharia Química e de Alimentos Praça Mauá, 1 09580-900, São Caetano do Sul, SP, Brasil Willibaldo Schmidell Professor Titular Universidade de São Paulo Escola Politécnica XIII Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 61548 05424-970, São Paulo, SP, Brasil (
  11. 11. XV CDN 1 ENGENHARIA BIOQUÍMICA: UMA APLICAÇÃO SUl GENERIS DA ENGENHARIA QUÍMICA.................................................................................... 1 Literatura recomendada...........................:......................................................3 2 MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAÇÃO INDUSTRIAL..................................................................................................................... 5 2.1 Introdução .............................................................................................................. 5 2.2 Fontes de microrganismos de interesse ............................................................. 7 2.3 Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial .............................................................................:.....10 2.4 Considerações finais ........................................................................................... 18 Referências bibliográficas ··········:······································································· 18 ESTERILIZAÇÃO DO EQUIPAMENTO............................................................... 19 3.1 Introdução ............................................................................................................ l9 3.2 Terminologia e modo de atuação ..................................................................... 20 3.3 Esterilização por agentes físicos .......................................................................25 3.4 Esterilização e desinfecção por agentes químicos ......................................... 33 Referências bibliográficas .....................................................:............................38 ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE FERMENTAÇÃO POR AQUECIMENTO COM VAPOR. ...............::............................................................ 39 4.1 Introdução............................................................................................................ 39 4.2 Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido ........... 40 4.3 Cinética da destruição térmica de microrganismos ....................................... 45 4.4 Destruição de nutrientes do meio corno conseqüência da esterilização .... 51 4.5 Considerações geràis a respeito do cálculo do tempo de esterilização ...... 53 4.6 Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo ..................... 56 4.7 Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo ........................... 60 Literatura recomendada ....................................................................................62 ESTÉRILIZAÇÃO DE AR.······················································:······················~::...........63 5.1 Introdução ...............................:............................................................................ 63 5.2 Aerossóis microbianos ........................................................................................ 64 5.3 Arnostradores ...................................................................................................... 65 5.4 Métodos para a esterilização de ar ................................................................... 75 5.5 Considerações finais .....................................:.....................:...............................90 Referência.s biliográficas ....................................................................................90
  12. 12. XVI · 6 CINÉTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS.............................................. 93 6.1 Introdução .................................................;........................................................... 93 6.2 Parâmetros de transformação ··············································'···························· 95. 6.3 Cálculo das velocidades .................................................................................. 101 6.4 A curva de crescimento microbiano ...............................................................103 6.5 Classificação dos processos fermentativos ................................................... 107 6.6 Influência da concentração do substrato sobre a velocidade específica de crescimento ................................................................................ 110 Apêndice ............................................................................................................ 114 Referências bibliográficas ................................................................................ 121 7 MODELAGEM MATEMÁTICA E SIMULAÇÃO DE PROCESSOS FERMENTATIVOS. ..................................................................................................... 123 7.1 Introdução .......................................................................................................... 123 7.2 Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos ........ 124 7.3 Ajuste de parâmetros do modelo formulado ............................................... 148 7.4 Avaliação do modelo matemático .................................................................. 164 7.5 Simulação de processos fermentativos .......................................................... 172 Referências bibliográficas ...........................................,.................................... 175 8 BIORREATORES E PROCESSOS FERMENTATIVOS..................................179 8.1 Introdução ..........................................................................................................179 8.2 Classificação dos biorreatores ·····························:··········································· 180 8.3 Formas de condução de um processo fermentativo ....................................185 8.4 Exemplos de comparação de desempenho de biorreatores ....................... 189 Referências bibliográficas ................................................................................ 190 ·9 FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA. .................:....................................................193 9.1 Introdução .......................................................................................................... 193 9.2 ·Inóculo ................................................................................................................ 194 9.3 Mosto ..................................................................................................................196 9.4 Classificação ...................................................................................................... 199 9.5 Número de domas ............................................................................................200 Referências bibliográficas .........:.........................:············································ 204 10 FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA ALIMENTADA. ...................................... 205 10.1 Introdução·:···································································:....................................205 10.2 Aplicações .......................................................................................................... 207 10.3 Classificação ...................................................................................................... 210 10.4 Modelos matemáticos ....................................................................................... 212 Referências bibliográficas ................................................................................ 216 11 FERMENTAÇÃO SEMICONTÍNUA.....................................................................219 11.1 Definição ...........................................................:................................................ 219 11.2 Produtividade do processo semicontínuo ..........................................~......... 220 11.3 Comentários finais ............................................................................................ 222 Referências bibliográficas ................................................................................ 222 12 FERMENTAÇÃO CONTÍNUA. ............................................................................... 223 12.1 Conceitos básicos .............................................................................................. 223 12.2 Vantagens e desvantagens do processo contínuo em relação ao descontínuo ..................................................................................................224
  13. 13. XVII 12.3 Formas de operação no sistema contínuo .....................................................225 12.4 Formação de produtos no sistema contínuo.................................................242 Referências bibliográficas ............................................................:................... 245 13 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO. ......................................................... 247 13.1 Introdução..........................................................................................................247 13.2 História do processo da FSS ............................................................................ 248 13.3 Microrganisrhos comumente utilizados ............................,........................... 250 13.4 Substratos: características e composição ....................................................... 250 13.5 Reatores para fermentação semi-sólida ......................................................... 254 13.6 Controles do processo ......................................................................................259 13.7 Vantagens e desvantagens ............................................................................... 264 13.8 Exemplos de casos ............................................................................................266 Referências bibliográficas ................................................................................270 @ AGITAÇÃO E AERAÇÃO EM BIORREATORES. ........................................:.. 277 14.1 A importância da transferência de oxigênio .............................................;... 277 14.2 Sistemas para a transferência de oxigênio ....................................................279 14.3 Concentração de oxigênio dissolvido em solucões saturadas ................... 281 14.4 Transferência de oxigênio e respiração microbiana ..................................... 284 14.5 Transferência de oxigênio em sistemas agitados e areados ........................308 14.6 Considerações finais .........................................................................................329 ~) R:ferências bibliográficas ................................................................................ 329 L!..?/ VARIAÇAO DE ESCALA. ...................,.................................................................... 333 15.1 Introdução ..........,...........................:.................................................................... 333 15.2 Critérios para a ampliação de escala ............................................................. 336 15.3 Comparações entre critérios para a ampliação de escala ........................... 348 15.4 Redução de escala ................................................;............'................~............... 351 15.5 Considerações finais ....................................................................................:.... 352 Referências bibliográficas ...................................................:....~........................ 353 16 REATORES COM CÉLULAS IMOBILIZADAS. .........................................:.... 355 16.1 Introdução ......,................................................................................................... 355 16.2 Métodos de imobilização................................................................................. 356 16.3 Tipos de biorreatores empregados ..............................,.................................. 360 16.4 Aspectos relativos ao transporte de massa ................................................... 363 16.5 Processos que utilizam células imobilizadas ................................................ 366 . 16.6 Conclusões ......................................................................................................... 370 Referências bibliográficas ....................................................:........................... 371 17 REATORES COM ENZIMAS IMOBILIZADAS...............................................373 17.1 Introdução .....................................................................................;....................373 17.2 Reatores enzimáticos ....................................................:...................................374 17.3 Exemplos de processos enzimáticos ........................,..................................... 388 Referências bibliográficas ...........................................;..:................................. 395 18 AUTOMAÇÃO E CONTROLI;: DE PROCESSOS FERMENTATIVOS....397 18.1 Introdução.......................................................................................................... 397 18.2 Principais instrumentos para monitoração ein linha de processos fermentativos ..................................................................................................... 398
  14. 14. XVIII 18.3 Controle aplicado a processos fermentativos ............................................... 411 Referências bibliográficas ................................................................................ 423 19 OPERAÇÃO DE INSTALAÇÕES INDUSTRIAIS DE FERMENTAÇÃO. ........................................:...............................................................425 19.1 Princípios gerais para operação...................................................................... 425 19.2 Condições gerais para a execução de um processo fermentativo ............. 426 19.3 Operação de uma indústria ............................................................................. 429 19.4 Operação de um processo férmentativo asséptico ...................................... 434 19.5 Exemplo de operação de indústria de fermentação ....................................435 Bibliografia ........................................................................................................ 439 20 CONSTRUÇÃO DE EQUIPAMENTOS DE FERMENTAÇÃO. ..................441 20.1 Introdução .......................................................................................................... 441 20.2 Características básicas de reatores para cultivo de bactérias ou células animais .................................................................................................. 442 20.3 Construção do fermentador ............................................................................ 448 20.4 Cultivo de células animais .............................................................................. 468 20.5 Obtenção e manutenção das condições de esterilidade e biossegurança ....................................................................................................._470 20.6 Válvulas e purgadores de vapor .................................................................... 480 20.7 Outros tipos de reatores ................................................................................... 485 Bibliografia ........................................................................................................ 489 21 PURIFICAÇÃO DE PRODUTO~ BIOTECNOLÓGICOS. ............................493 21.1 Introdução ..............................:.........:......................................................:........... 493 21.2 Classificação .........................................:............................................................. 494 21.3 Rompimento de células microbianas ...............................,............................. 501 21.4 Precipitação .......................................................................................................504 21.5 Ultrafiltração ..................................................................................................... 507 21.6 Extração em sistemas de duas fases aquosas ............................................... 507 21.7 Cromatografia ................................................................................................... 510 21.8 Tratamentos finais ............................................................................................514 21.9 Rotinas analíticas .............................................................................................. 515 21.10 O processo integrado de purificação ............................................................. 518 Referências bibliográficas ...................................................................~.~.......... 520 22 ASPECTOS ECONÔMICOS. ..................................................................................523 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 Introdução .......................................................................................................... 523 Considerações sobre as diferentes variáveis e suas relações · existentes em todo o estudo econômico ............................:........................... 523 Análise de viabilidade econômica .........................................:....................... 528 Aspectos econômicos de processos fermentativos ...................................... 530 Métodos de avaliação de investimento ...........................;............................. 535 Bibliografia ........................................................................................................ 541 ---· ·· ---------~----------
  15. 15. ------------- -------- - ---- Walter Borzani Durante a Segunda Grande Guerra (1939-1945), os então "Aliados" concen- traram esforços consideráveis na consecução de um objetivo muito específico: transferir para escala industrial o processo de laboratório, então conhecido, de produção de penicilina por fermentação. Ao lado de profissionais já de longa ~ata envolvidos no estudo de ativida- des microbianas, passaram então a atuar engenheiros químicos, com vistas à solu- ção de questõesbastante complexás inerentes à desejada ampliação de escala. Foi nesse período que nasceu o ramo da Engenharia Química que, mais tar- de, por suas peculiaridades, receberia o nome de Engenharia Bioquímica. Neste praticamente meio século de existência, esse novo ramo da Engenha- ria Química progrediu rapidamente, conduzindo a muitos resultados de indiscutí- vel importânda-prática. O objetivo da Engenharia Bioquímica é a aplicação dos conhecimentos da Engenharia Química na solução de problemas que se apresentam na implantação de processos biotecnológicos em larga escala, e em sua otimização. Segundo AIBA, HUMPHREY e MILLIS: "Biochemical engineering is concer- ned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the links between biology and chemical engineering. The authors believe, moreover, that the heart of biochemical engineering lies in the scale-up and management of cellular processes". BAILEY e ÜLLIS, por sua vez, dizem: "Processing of biological materiais and processing using biological agents such as cells, enzymes or antibodies are the central domain of biochemical engineering. Success in biochemical engineering re- quires integrated knowledge of governing biological properties and principies and of chemical engineering methodology and strategy. (...) Reaching this objecti- ve clearly requires years of careful study and practice". Convém citar que o primeiro livro dedicado à Engenharia Bioquímica foi publicado em 1958, por STEEL.
  16. 16. 2 Engenharia bioquímica: uma aplicação sui generis da engenharia química Os problemas que se apresentam no âmbito da Engenharia Bioquímica são, com alguma freqüência, de difícil solução, dadas as peculiaridades e a complexi- dade dos sistemas em que se desenvolvem os processos biotecnológicos. O estudo de vários desses problemas constitui o principal objetivo deste vo- lume, mas parece-nos aconselhável, neste primeiro capítulo, comentar alguns de- les, com a única finalidade de dar, aos alunos, uma idéia das questões que serão examinadas. Comecemos tecendo alguns comentários a respeito dos balanços materiais em processos fermentativos. A célula microbiana responsável pela transformação que nos interessa em um dado processo realiza, além dessa transformação, um grande número de outras reações com o objetivo, para ela absolutamente primor- dial, de manter-se viva e multiplicar-se. Isso pode dificultar o estabelecimento de balanços materiais, além de afetar o rendimento do processo considerado. O co- nhecimento das prováveis vias metabólicas que se desenvolvem nas células é, nes- te particular, de grande auxílio, fornecendo muitas vezes informações que indicam a maneira mais adequada de conduzir o processo que nos interessa. O fato inevitável, apontado hápouco, de a célula ter a única "preocupação" de manter-se viva e multiplicar-se, também pode acarretar sérios problemas no es- tudo da cinética da transformação que se tem em vista, uma vez que a velocidade de formação do produto que nos interessa pode ser profundamente afetada pelas velocidades de outras reações integrantes do metabolismo do microrganismo. Isso pode dificultar o estabelecimento de modelos matemáticos, cuja importância na otimização e no controle de processos já foi constatada muitas vezes. A manutenção de um razoável grau de "homogeneidade" no reator, para que todos os agentes da transformação se encontrem, pelo menos aproximadamente, nas mesmas condições (temperatura, pH, concentrações de substâncias do meio), é outro problema a ser considerado, principalmente em reatores industriais. Consideremos, agora, a operação de esterilização de grandes volumes de meio, operação esta muito freqüente em indústrias de fermentação. Como proce- der: eliminar os microrganismos por filtração do meio ou destruí-los por aqueci- mento? Se a esterilização por aquecimento tiver sido escolhida, que processo será utilizado: o descontínuo ou o contínuo? Que temperatura de esterilização será adotada e qual o correspondente tempo do tratamento térmico? Quais serão as di- mensões dos equipamentos e os controles necessários em cada caso? O meio, uma vez esterilizado, será encaminhado ao fermentador onde será transformado pela ação das células microbianas. Aqui nos depararemos com mui- tas alternativas. Serão utilizados microrganismos em suspensão no meio ou célu- las imobilizadas em suportes inertes? Que processo de fermentação será utilizado: o descontínuo, o semicontínuo ou o contínuo? Com ou sem recirculação do mi- crorganismo? Se for escolhido o processo descontínuo, será o descontínuo simples ou o descontínuo alimentado? Se o processo adotado for o semicontínuo, que fra- ção de meio fermentado será periodicamente retirada do reator e substituída por igual volume de meio novo? No caso de se ter optado pelo processo contínuo, adotar-se-á um único reator de mistura, vários reatores de mistura ligados em sé- rie, ou um reator pistonado? Quais serão as dimensões e o form~to do reator? Como controlar as condições de fermentação? Como adicionar alguns nutrientes:
  17. 17. Engenharia bioquímica: uma aplicação sui generis da engenharia química 3 todos de uma só vez no preparo do meio, ou de maneira programada durante o andamento do processo? No caso de se tratar de um processo enzimático contínuo com enzimas imo- bilizadas, lançar-se-á mão de um reator de leito fixo, ou de leito fluidizado? Outro tópico a ser lembrado, é o da ampliação da escala de trabalho ("sca- le-up"): se bons resultado~ foram obtidos, em certas condições, em um reator de pequena capacidade, como operar um reator industrial para que os mesmos resul- tados sejam alcançados? Finalmente, para não alongarmos demasiadamente estes comentários, nunca será demais ressaltar a importância de que se reveste a escolha dos processos que serão utilizados, tanto na separação dos produtos e subprodutos, como no trata- mento, ou no aproveitamento dos resíduos. A solução adequada de muitas das questões com que se defronta a Engenha- ria Bioquímica passa, necessariamente, pelo estabelecimento de modelos matemá- ticos, como se constatará ao longo deste Volume. Parece-nos oportuno, por esse motivo, ressaltar a utilidade desses modelos, valendo-nos de um artigo publicado por FREDRICKSON e colaboradores em 1970: "1. Models serve to correlate data and so provide a concise way of thinking about a system or process. 2. Models allow one- within limits- to predict quantitatively the per- formance of a system or process.-Thus~ they can reduce the amount of experimentallábor necessary to design and/or optimize a process. 3. Models help to sharpen thinking about a system or process and can be used to guide one's reasoning in the design of experiments, to isola- te important parameters and elucidate the nature of the system ór pro- cess. That is to say,' the combinations of mathematical modelling and experilllen_ta} research often suggests new experiments that need to be done." Literatura recomendada (1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N.F. Biochemical Engineering. University of Tokyo Press, Tóquio, 1973. (2) BAILEY, J.E. & OLLIS, D.F. Biochemical Engineering Fundamentais. McGraw-Hill Book Company, Nova York, 1986. (3) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbiologie Industrielle et Génie Biochi- mique. Masson et Cie., Éditeurs, Paris, 1970.
  18. 18. 5 -··---·----·------- --- Willibaldo Schmidell 2.1 - Introdução O objetivo central do presente capítulo reside na descrição das característi- cas gerais que microrganismos e meios de cultura devem apresentar, a fim de ser possível utilizá-los em uma operação industrial de grande porte, ou seja, executa- da em biorreatores com volumes de dezenas de milhares de litros. Apesar de se procurar mencionar, ao longo do texto, alguns exemplos, não há a preocupação em de$crever características particularmente importantes para um determinado processo fermentativo, pois isto tornaria o tema extremamente longo, além de apresentar uma importância questionável, tendo em vista o escopo geral do presente capítulo. Retomando as idéias já abordadas no Capítulo 9 (Vol. 1), na Figura 2.1 en- contra-se um esquema geral de um processo fermentativo, na qual buscou-seres- saltar alguns pontos essenciais, que permitem um início de discussão dentro do objetivo acima traçado. Conforme se pode observar na Figura 2.1, o sucesso de um dado processo fermentativo depende muito de uma correta definição de quatro pontos básicos: o miCrorganismo, o meio de cultura, a forma de condução do processo fermentativo e as etapas de reclperação do produto. Na verdade, esses quatro pilares de um processo fermentativo interagem enormemente, sendo necessário buscar defini-los de forma conjunta, levando em consideração aspectos biológicos e econômicos, o que torna bastante complexa esta adequada definição. Para tornar clara essa idéia, pode-se mencionar que sem- pre se pretende empregar meios de cultura baratos, mas deve-se lembrar que o microrganismo deve encontrar neste ineio condições adequadas para realizar a conversão pretendida. ·
  19. 19. ·.. 6 Microrganismos e meios de cu~ura para utilização industrial Em termos de formas de condução do processo fermentativo, seria difícil imaginar a produção presente de etanol no Brasil (algo como 15 bilhões de litros por ano), caso não se operasse os biorreatores em sistema descontínuo alimentado, ou mesmo contínuo, porém com o reciclo das células.Da mesma forma, o grande avanço alcançado pela digestão anaeróbia no tratamento biológico de águas resi- .duárias, deveu-se muitíssimo ao surgimento dos reatores contínuos operados com fluxo ascendente e reciclo interno de células. Prei>ãr<riiô'. :·:.' lnóculo:;eta.pa !~d~:~~triaj _-..·:. ~~e~mi!L_~pre,~) l Matérias-primas Figura 2.1 - Esquema geral de um processo fermentativo As operações finais para a recuperação do produto (operações de "downstream"), são igualmente da mais alta importância. Sabe-se'que a melhor forma presentemente para a recuperação do etanol, após uma fermentação alcoóli- ca, é a operação de destilação, mas ela incide significativamente no custo do pro- duto final, em virtude da energia necessária para a sua execução. No entanto, a importância de uma adequada definiçao das operações de recuperação do produ- to, fica mais clara quando se aborda a produção de produtos de alto valor agrega- do, como a produção de· antibióticos, enzimas, ou outras proteínas (insulina, hormônios de crescimento, vacinas etc:). Pára esses casos, as operações de recupe- ração do produto podem ser responsáveis por 50 a 70% do custo do produto final, indicando, claramente, a sua importância em termos de uma adequada definição. Os aspectos relacionados com a forma de condução de biorreatores, assim como as operações de recuperação de produtos, serão abordados em vários capí- tulos do presente volume.
  20. 20. Fontes de microrganismos de interesse 7 Cabe, portanto, conforme salientado anteriormente, abordar alguma refle- xão sobre microrganismos e meios de cultura que podem ser eventualmente em- pregados em uma operação industrial. 2.2 - Fontes de microrganismos de interesse Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos ba- sicamente das seguintes formas: isolamento apartir de recursos naturais compra em coleções de culturas obtenção de mutantes naturais obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética. O isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais, tais como solo, água, plantas etc., sempre foi uma atividade de grande importância para a obtenção de novas linhagens de interesse industrial. Trata-se de uma atividade que envolve muito trabalho experimental, signifi- cando um custo relativamente elevado, porém pode conduzir ao isolamento de li- nhagens melhor produtoras de um dado produto, mas, mais importante do que isto, pode conduzir à descoberta de novos produtos, o que confere a esta possibili- dade uma relevância inquestionável. Cumpre lembrar que as grandes eni.presas produtoras de antibióticos, ou en- zimas, mantêm programas de isolamento de linhagens de recursos naturais, justa- mente com o objetivo de incrementar a produção de certos produtos, ou com o objetivo de encontrar linhagens produtoras de novos antibióticos por exemplo. É clarq ql.!e o isolamento de linhagens deve ter início com certas premissas, definindo-se o que se pretende obter, pois o simples isolamento poderá levar à disponibilidade de um número inimaginável de culturas, o que dificulta a conver- gência para o processo ou o produto qtie se pretende produzir. A compra em coleções de culturas é presentemente bastante viável, tendo em vista a existência de muitas coleções de culturas em vários países. Nesse sentido, STANBURY et al.1 listam nada menos do que 11 coleções de culturas em vários países, podendo-se ainda acrescentar a Agricultura! Research Service Culture Collection (EUA), também conhecido como NRRL Culture Collection (http:/ /nrrl.ncaur.usda.gov) e a Coleção de Culturas Tropical {Campinas - SP; http:/ /www.cct.org.br). O contato com essas coleções é atualmente muito facilita- do, podendo-se utilizar os recursos da Internet para tal tarefa. É de se esperar que o microrganismo utilizado para a produção de um dado antibiótico não estará disponível em uma coleção de culturas, sendo, com muita freqüência, oriundo de programas de melhoramento genético. Como se sabe, quando uma dada célula prolifera, há sempre uma pequena possibilidade de surgimento de mutantes naturais, os quais podem ser isolados e ensaiados objetivando a verificação de sua potencialidade de produção. Conforme Íio;;,...______ ·-- ·- . ... ·····---·---- ·-·- ·
  21. 21. 8 Microrganismos e meios de cultura para utilização·industrial se verá adiante, essas alterações naturais não são, de forma alguma, interessantes do ponto de vista de um processo fermentativo, mas eventualmente podem gerar novas linhagens que apresentem interesse prático. No entanto, aguardar o surgimento de mutantes naturais de interesse práti- co, poderá significar o dispêndio de muito tempo, razão pela qual prefere-se, há já várias décadas, lançar mão de métodos que forcem o aparecimento de células inu- tadas, como é o caso de submeter suspensões de células ou esporos a radiações ul- travioleta ou a substâncias químicas mutagênicas, como a nitrosoguanidina. Ao se permitir essa exposição ou contato, ocorre uma drástica destruição da maioria das células, recuperando-se, a seguir, aquelas que sobreviveram, verificando-se se mutaram na direção desejada. Essa técnica para a obtenção de mutantes é obviamente aleatória, tratan- do-se de recuperar as células sobreviventes em meios ou condições específicas, de forma a dirigir este isolamento para as células que se pretende. Tais programas de mutação/seleção costumam ser bastante dispendiosos, mas levaram a várias con- dições de sucesso descritas na literatura. Um caso bem relatado foi a significativa melhora de linhagens de Penicíllium chrysogenum para a produção de penicilina. De fato, na década de 40 obtinha-se teor de penicilina no caldo fermentado da ordem de· 100 unidades/cm3 , passan- do-se a obter, já por volta de 1976, teores da ordem de 51.000 unidades/cm3 • Já acréscimos da ordem de 4 vezes foram obtidos entre 1970 e 1985 em uma determi- nada empresa,1 o que indica que este progresso costuma-~er muito estimulante, es- pecialmente quando se parte de linhagens naturais. Incrementos semelhantes foram obtidos na empresa Squibb Indústria Química S.A., no período de 1975 a 1992, conforme relatado por SCHMIDELL; FERNANDES.2 Tais progressos realmente significativos costumam ser atribuídos apenas a esses programas de mutação/seleção, mas é conveniente lembrar o necessário tra- balho de adaptação do meio de cultivo, da forma de conduzir o processo.fermen- tativo e as alterações nas etapas de recuperação do produto, a fim de propiciar o real surgimento das vantagens, em nível de produção industrial, da nova linha- gem selecionada.2 Finalmente, nas últimas décadas, as técnicas de engenharia genética (vide Vol. 1, Cap. 4), também designadas por técnicas ou tecnologia de DNA recombi- nante, sem dúvida trouxeram um imenso avanço nas possibilidades de se obter cé- lulas mais produtivas, ou células produtoras de substâncias que normalmente não produzem. Como se sabe, ao lado dessas possibilidades, igualmente trouxeram várias reflexões e inquietudes, cujo teor não será abordado no presente capítulo. A introdução de fragmentos de DNA de certas células em outras, via vetores como os plasmídeos, permite a obtenção de células alteradas geneticamente, po- rém de forma muito mais dirigida do que as metodologias convencionais anterior- mente mencionadas, sendo possível de ser executada não apenas com microrga- nismos, mas iguàlmente com células animais e vegetais. Para se ter uma idéia da potencialidade dessas técnicas, imaginemos que se _conheça a seqüência metaból~ca que leva ao acúmulo de um dado produto de inte- resse, por exemplo o produto P na seqüência genérica:
  22. 22. Fontes de microrganismos de interesse 9 A~B~C~D~ ... ~P Um estudo mais aprofundado dessa seqüência, através da determinação das concentrações dos compostos intermediários (B, C, D etc.), pode levar à determi~ nação da reação limitante da seqüência (aquela que determina a velocidade do flu- xo metabólico em estudo, por exemplo a reação C~ D) e, portanto, da enzima responsável pela reação específica (enzima c). As etapas seguintes são a identifica- ção do gene que codifica 'para a síntese dessa enzima, introduzir este gene em plasmídeos e voltá-los à célula produtora. Com esse procedimento, aumenta-se o número.de cópias do gene responsável pela síntese da enzima, o que permite au- mentar a velocidade da reação limitante, pela presença de uma maior concentra- ção da enzima responsável (no caso, a enzima c). Essa estratégia foi empregada, por exemplo, no incremento da produção de cefalosporina C por CephaZosporium acremonium.1 Ainda, uma etapa intermediária poderia ser imaginada. Uma vez identifica- da a enzima responsável pela catálise da reação limitante, esta enzima poderia ser manipulada, através do conhecimento de sua estrutura e alteração de determina- dos aminoácidos, por técnicas de engenharia de proteínas, objetivando obter uma nova proteína com atividade aumentada. O gene correspondente a essa nova enzi- ma seria, então, introduzido na célula produtora, conforme acima descrito. A potencialidade dessas técnicas é realmente enorme, pois, uma vez solucio- nado o problema de uma dada reação limitante, outra reação da seqüência meta- bólica passará a ser limitante, o que permite imaginar a realização de igual estraté- gia para esta nova reação. Claro está que tais procedimentos não são de simples execução, pois inclusive exigem um amplo conhecimento do material biológico utilizado, mas apresentam um enorme interesse prático. Conforme mencionado, as técnicas de DNA recombinante também podem ser aplicadas para tornar células produtoras de substâncias que naturalmente não são por elas produzidas, ,em virtude da ausência de codificação genética para tan- to. Nesse caso, genes de certas células são transferidos, via vetores adequados, a outras células, como é o caso de introduzir a codificação para a síntese de glicoa- milase de Aspergillus em células de Saccharomyces cerevisiae, o que passa a permitir a realização da fermenta)ão alcoólica de matérias~primas amiláceas, pela levedura alterada geneticamente.3' Com esse objetivo, a tecnologia do DNA recombinante tem sido empregada para a obtenção de proteínas heterólogas de alto valor agregado, em particular para uso em saúde humana, como é o caso da produção de hormônio de cresci- mento humano, insulina, interferons, Fator VIII (tratamento da hemofilia) etc. Como microrganismos receptores da codificação genétiCa empregam-se bactérias (Escherichia coZi, Bacillus subtilis), leveduras (Saccharomyces cerevisiae) ou fungos fi- lamentosos (Aspergillus niger). Igualmente são empregadas células animais (exem.:. plo: BHK - "Baby Hamster Kidney"), particularmente para a produção de proteí- nas mais complexas e de maior valor agregado, o que explica o crescente interesse das grandes empresas do setor no cultivo de células animais. Presentemente, é inclusive possível imaginar o emprego de um pequeno nú- mero de microrganismos, bem conhecidos em termos de necessidades nutricionais e características de crescimento, como é o caso de Escherichia coZi ou Saccharomyces cerevisiae, para a síntese de uma grande variedade de proteínas, no lugar de se ter como problema o cultivo de uma linhagem para cada composto a ser produzido.
  23. 23. IO Microrganismos e meios de cultura para utilizaçã~ industrial . ··~ Claramente isso pode contribuir pa~a uma certa simplificação dos processos pro- dutivos, desde que se consiga obter os mutantes adequados. 2.3 - Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial Conforme já anunciado, no presente item pretende-se apresentar algumas características gerais que microrganismos e meios devem apresentar, a fim de que seja possível o estabelecimento de processo produtivo em larga escala. Buscar-se-á enunciar as características desejáveis de microrganismos e, em seguida, aquelas relacionadas aos meios de cultivo, lembrando, no entanto, que o desempenho de um dado microrganismo depende muito da composição do meio de cultura em que é colocado. Como se pretende expor características gerais, quando da análise de um dado processo fermentativo, é possível que algumas destas características não se apliquem, enquanto outras,não abordadas no presente texto, poderão ser de gran- de importância. No entanto, espera-se estabelecer certas reflexões que permitam essa análise crítica. 2.3. I - Características desejáveis de microrganismos Para uma aplicação industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes características gerais: · · • apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; • permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concen- tração do produto no caldo fermentado; • não produzir substâncias incompatíveis com o produto; • apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; • nãoser patogênico; • não exigir condições de processo muito complexas; • não exigir meios de cultura dispendiosos; • permitir a rápida liberação do produto para o meio. As duas primeiras características serão discutidas conjuntamente, pois, ape- sar de serem distintas, concorrem para o mesmo objetivo geral de extrema impor- tância. I)e fato, uma célula deve permitir elevada conversão do substrato em produto, pois, com muita freqüência, as matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final, podendo-se mencionar uma incidência de 38 a 73% do custo total de produção como sendo devido às matérias-primas, em particular a fonte orgânica de carbono.1 Por outro lado, é sempre desejável que o microrganismo permita um elevado acúmulo do produto no meio, sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo, pois isto concorre para uma redução nos custos de recuperação, os quais também podem ser muito acentuados. Tome-se como exemplo o caso da fermentação alcoólica, aqui representada simplificadamente pela equação química final (glicose em anaerobiose sendo con- vertida em etanol e gás carbônico):
  24. 24. Características desejáveis de microrganismos e meios de cuaura para aplicação industrial I I ..... C 6H12Ü 6 ~ 2C 2H 50H+ 2C02 Como se pode observar, o fator estequiométrico é igual a 0,511, ou seja, cada grama de glicose convertida gera 0,511g de etanol, sendo que o Saccharomyces cere- visiae, normalmente empregado nesta fermentação, com freqüência permite obter um rendimento da ordem de 90% deste valor estequiométrico, o que torna este mi- crorganismo o mais importante para Tealizar esta conversão, lembrando que vários outros também podem acumular etanol, a partir da glicose, porém não com este rendimento tão elevado. Obviamente, não se consegue manter um processo de fermentação alcoólica obtendo-se 100% de rendimento, pois as células têm de proliferar, o que significa a síntese de muitos outros compostos intermediários, sendo o acúmulo de etanol a via metabólica que permite a geração de energia na forma de ATP (glicólise). Cla- ro está que esse é um ponto fundamental, pois a matéria-prima incide em algo como 60% do custo do etanol e, desta forma, baixos rendimentos tornariam inviá- vel a produção deste produto de baixo valor agregado. ( Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 a 10% (em volume) em etanol no vinho fermentado, já ocorre uma clara inibição da levedura, o que faz com que a velocidade da conversão do açúcar em etanol fique prejudicada, razão pela qual procura-se não ultrapassar estes valores, pelo menos na produção de álcool com- bustível (não se está aqui comentando o caso de bebidas alcoólicas). Isso significa a necessidade de destilar um líquido que contém apenas 10% de etanol, o que - além do dispêndio de energia - ainda irá gerar 90% de resíduo na forma de vinhaça, que necessita encontrar um destino adequado. f O ideal seria encontrar leveduras mais resistentes ao etanol, porém sem que ocorra queda n.a velocidade da fermentação alcoólica (sem queda na produtivida- de), o que não é tarefa simples. De qualquer forma, fica claro que a conversão da matéria-prima em produto já é muito elevada, o que não permite visualizar grandes incrementos, lembrando, novamente, a necessidade de manter a viabilidade celular para que a fermentação não seja interrompida. Uma situação bem diversa é a que ocorre com os processos aeróbios, por exemplo, na produção de enzimas ou antibióticos. Nesse caso, a conversão do açú- car pode ser representada esquematicamente da seguinte forma: Açúcar + 0 2 ~ células + C02 + H20 + Intermediários + Produto Nesse caso, por se operar em aerobiose, a quantidade de células geradas cos- tuma ser muito intensa, em relação ao açúcar consumido, ao lado de uma quanti- dade relativamente pequena do produto alvo (antibiótico ou enzima). Se, por um lado, o custo da matéria-prima incide menos'pesadàmente no custo do produto fi- nal, as operações de recupéração do produto são necessariamente mais onerosas (chega-se a valores da ordem de 70%), mas o produto alvo é de mais alto valor agregado. Assim, ao se encontrar linhagens que cresçam relativamente menos, ou que acumulem menos compostos intermediários, é possível visualizar grandes incre- mentos na síntese do produto, conforme mencionado anteriormente para o caso da produção de penicilina.
  25. 25. 12 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial · Mesmo permitindo o acúmulo do produto no meio, a célula produtora deve, ainda, contar com a característica de não produzir substâncias que sejam incompatíveis com o produto, pois isto pode levar a uma situação de desinteresse pelo processo produtivo. · Esse é o caso, por exemplo, de se estar interessado na produção de uma dada enzima, ou proteína, mas se utilizar uma linhagem que também seja uma boa pro- dutora de proteases extracelulares. Assim, ao se produzir a enzima, separar as cé- lulas e armazenar o produto, pode-se ter uma redução sensível da atividade enzimática em virtude da ação das proteases. Um exemplo adicional, mais específico, é sobre a produção de glicoamilase por Aspergillus. Como se sabe, a glicoamilase é a enzima que hidrolisa o amido ge- rando glicose, sendo pois de muito interesse em várias aplicações, destacando-se o preparo de xaropes de glicose para a indústria de alimentos. Ocorre que alguns microrganismos produtores de glicoamilase também sintetizam a transglicosida- se, enzima esta que, quando na presença de glicose, volta a polimerizá-la, gerando moléculas que não são mais hidrolisadas pela glicoamilase. Na realidade, a presente característica desejável em uma célula pode ser bem mais generalizada. Um microrganismo ideal, quanto ao aspecto agora abor- dado, deve produzir o mínimo de outras substâncias, ao mesmo tempo em que sintetiza o composto pretendido. Isso leva a uma maior disponibilidade de nutri- entes para a síntese do produto (voltando-se à discussão anterior), mas também permite vislumbrar uma maior facilidade na recuperação deste produto. ' Uma outra característica, da mais alta importância, refere-se à estabilidade fi- siológica da linhagem a ser empregada industrialmente. Isso significa que não bas- ta que se tenha uma linhagem hiperprodutora de uma dada substância de interesse, mas que se conheça as técnicas mais adequadas para a sua conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substância de in- teresse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferação em nível de laboratório, germinadores e biorreator principal (Fig. 2.1). Assim sendo, o constante estudo dessas formas de conservação maiS ade- quadas das linhagens é tarefa das mais importantes, mantendo-se, na indústria, aquelas realmente de interesse, assim como o imediato descarte dos lotes que de- monstrem alguma tendência à atenuação quanto ao acúmulo do produto no meio. Para a célula há sempre a tendência em otimizar o crescimento, em detrimento da síntese do produto, motivo pelo qual não basta verificar, em termos de metodolo- gias de conservação, se a célula cresce, mas se ela continua a acumular o produto de maneira eficaz. Conforme já mencionado anteriormente, quando uma célula prolifera, há sempre alguma probabilidade de ocorrerem mutações naturais. Em um processo fermentativo típico, normalmente parte-se de uma massa muitopequena de célu- las nas etapas iniciais de preparo do inóculo (Fig. 2.1), chegando-se a biorreatores de dezenas de milhares de litros, contendo concentrações celulares com freqüên- cia acima de 10 g de matéria seca de células/L, o que significa gerar, em termos de massa de matéria seca, algo em torno de toneladas de células. Isso mostra clara- mente a necessidade de se operar com material genético que seja estável, a fim de se contar com células competentes em termos de acúmulo do produto. O emprego de linhagens relativamente instáveis, pode, inclusive, limitar o emprego de sistemas de fermentação mais eficientes, como os processos contínuos,
  26. 26. Características desejáveis de microrganismos e meios de cu~ura para aplicação industrial 13 pois poderá ocorrer, ao longo do tempo, a seleção de células que privilegiem o crescimento em detrimento do acúmulo do produto. O fenômeno da atenuação do acúmulo do produto de interesse pode ocorrer tanto com linhagens naturais como, em especial, com as linhagens mutadas. Na li- teratura1 está bem documentada a viabilidade de se produzir lisina pOr mutantes auxotróficos, em processo contínuo, apenas quando se empregam mutantes auxo- tróficos em dois aminoácidps e não em apenas um, a fim de evitar os mecanismos de controle da célula e obtér o acúmulo intenso do aminoácido de interesse. Nessa condição, é mais difícil o retorno às características da linhagem original, em virtu- de de uma maior alteração a que a célula foi submetida. Células recombinantes, por via da introdução de plasmídeos, igualmente podem ser instáveis em virtude da inexistência de replicação do plasmídeo para .as células filhas, ou mesmo devido à destruição do plasmídeo na própria célula hospedeira, ou ainda à expulsão desse plasmídeo. É necessário lembrar que a in- trodução de novas codificações genéticas pode, eventualmente, significar um ônus adicional para a célula, a qual está interessada em aprimorar o seu crescimento. Inclusive, a integração de uma codificação genética contida em um plasmídeo ao cromossomo da célula, o que poderia conferir a desejada estabilidade, pode ainda não resultar na obtenção de uma hiperprodutora, em virtude da existência de um número limitado de cópias do gene de interesse. A operação de biorreatores de grande porte, conforme mencionado anterior- mente, do ponto de vista técnico e econômico, praticamente exige o emprego de microrganismos não patogênicos, os quais possam ser manuseados sem riscos ambi- entais, particularmente nas etapas seguintes em relação ao t~rmino do processo fermentativo. Mesmo durante a fermentação, caso se manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante -aumentados, particularmente com os gases efluentes, o que incidiria em custos adicionais. O cultivo de patogêil.icos é efetuado, por exemplo, para a produção de vaci- nas, em reatores_çle pequeno porte (da ordem de centenas ou poucos milhares de litros), porém confinados em câmaras assépticas, tomando-se precauções necessá- rias para a'rião ·ocorrência de contaminação do meio ambiente. Isso, logicamente, significa custo adicional, o qual pode ser justificado no caso de produção de vaci- nas, mas tornaria inviável a produção de uma enzima ou mesmo um antibiótico. A obtenção de células recombinantes de Escherichia coZi, via a introdução de plasmídeos, é sempre algo muito atraente, pois esta é uma das bactérias mais co- nhecidas presentemente, mas encontra resistências em termos de uma utilização em instalações de grande porte, justamente por ser uma enterobactéria. Essa é uma das razões (não a única), pelas quais hoje se prefere partir de células de leveduras, ou fungos filamentosos não patogênicos, ou mesmo de células animais, a fim de se ob- ter recorri.binantes. Apesar disso, ainda existem discussões a respeito da disposição final dessas células recombinantes, conforme mencionado anteriormente. Um microrganismo também não deve exigir condições de processo muito comple- xas, por motivos claros de economicidade da produção, sendo que dentro deste tó- pico muitos aspectos podem ser abordados. Como se sabe, sempre existem valores ótimos d0 pH e da temperatura, por exemplo, em termos do acúmulo do produto. No entanto, também se sabe que o ~-----· _.____.___ -----·- - -·-·- · -- ·------- ·-- - --- ··----·· ---- - -. _j
  27. 27. 14 Microrganismos e meios de cu~ura para utilização industrial controle preciso do pH e da temperatura apenas é possível em reatores de banca- da, sendo que em reatores de grande porte (dezenas de milhares de litros), deverá ocorrer uma certa heterogeneidade ao longo da altura do reator, de forma que a célula deverá manter o seu desempenho, apesar de uma certa flutuação nos valo- res destas grandezas tomadas como exemplo. Em outras palavras, o ideal é que o microrganismo tenha uma faixa de valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais, particularmente no que se refere ao acúmulo do produto. Nessa direção, são igualmente muito interessantes os microrganismos que conseguem manter um bom desempenho, quando cultivados em baixas concentra- ções de oxigênio dissolvido. Como ficará claro no capítulo sobre transferência de oxigênio, a necessidade de manutenção de altas concentrações de oxigênio dissol- vido traz problemas bastante sérios no tocante a um maior dispêndio de energia, em virtude de uma maior agitação e aeração do meio. Nesse sentido, os microrga- nismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por exemplo), são sem- pre mais complicados, pois a ·concentração de oxigênio no meio de cultivo terá de ser mais elevada, a fim de que as células mais internas destes aglomerados tenham acesso a este oxigênio, quando comparadas às células que crescem isoladamente. Já foi abordado anteriormente a inconveniência em operar corh linhagens que excretem quantidades exageradas de proteínas para o meio, mas ainda há uma questão adicional, pois a geração de espuma freqüentemente se atribui à pre- sença de proteínas no meio de cultivo, situação ainda mais complexa para os pro- cessos aeróbios, devido à necessidade de aerar e agitar.o conteúdo do bioi:-reator. Em geral, a geração de espuma pode ocorrer no início de um processo fer- mentativo aeróbio, quando se empregam meios de cultivo contendo extratos de carne ou de levedura, ou água de maceração de milho ("com steep liquor"), e nas etapas mais avançadas de um processo em virtude da presença de proteínas. Isso causa sérios problemas, como a necessidade de empregar um menor volume útil do reator, a fim de ter condições de controlar a espuma, além da freqüente necessi- dade de empregar antiespumantes que, além de onerarem o produto final, ainda podem causar dificuldades nas etapas de recuperação do produto e uma redução na transferência de oxigênio, o que exige o aumento da agitação e da aeração, agravando a situa.ção. Assim, é.importante a seleção de microrganismos que ex- cretem poucas proteínas juntamente com o produto desejado. As características que um meio de cultivo devem apresentar serão discuti- das no próximo subitem mas, neste momento, convém mencionar que o microrga- nismo selecionado para um processo industrial não deve exigir meio de cultura extremamente oneroso, por questões claramente de economia do processo produti- vo. Essa é a razão pela qual um maior conhecimento das necessidades nutricionais de uma linhagem é estudo de vital importância, objetivando o fornecimento dos nutrientes apenas necessários. Em algumas circunstâncias esse desconhecimento leva à necessidade da adição de certas substâncias, como extrato de levedura, ex- trato de carne, peptona etc., as quais costumam ser bastante dispendiosas. Particularmente na área de produção de vacinas, costuma-se utilizar meios de cultura bastante complexos e.onerosos, assim como nos cultivos envolvendo células animais, mas aqui, novamente, os volumes de reação são relativamente pequenos e os produtos gerados podem ser considerados como de alto valor agregado. Finalmente, como com muita freqüência imagina-se a produção de produtos extracelulares, há todo o interesse em que a linhagem selecionada libere fácil e rapi-
  28. 28. Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial I 5 damente o produto para o meio, de onde ele será recuperado nas etapas seguintes ao processo fermentativo. Além do aspecto ligado a uma eventual inibição do próprio microrganismo, pela retenção de um dado produto do metabolismo, ainda cumpre lembrar que, com freqüência, a primeira etapa de recuperação do produto significa a separação do microrganismo (por centrifugação ou filtração), trabalhando, a seguir, com o lí- quido isento de células e estas descartadas. Assim, se algum produto ainda per- manece associado às células, será perdido. Sabe-se que a retenção de certos produtos pelas células depende de uma sé- rie de fatores, tais como: da linhagem empregada, da composição do meio de cul- tivo e das condições impostas (pH, temperatura etc.). Nessa direção, um exemplo interessante foi o apresentado por AGUERO et al} trabalhando no estudo da produção de glicoamilase por Aspergillus niger NRRL 337 e Aspergillus awamori NRRL 3112, sendo esta segunda linhagem, sem dúvida, melhor produtora que a primeira. Esses autores indicaram que, a pH 4, o A. niger reteve cerca de 30% da atividade associada às células, enquanto que o A. awamori apenas algo em torno de 10%, indicando que a linhagem melhor produto- ra tende a ser mais eficiente na excreção.do produto de interesse. Já a pH 6, as cé- lulas de A . niger retiveram cerca de 70% da atividade enzimática, enquanto que nas células de A. awamori esta retenção foi da ordem de 40%, em relação à ativida- de total (soma da atividade enzimática extracelular, encontrada no caldo, e a ativi- dade intracelular, ou seja, a atividade encOntrada nas células - atividades enzimáticas expressas por unidade de volume de amostra), mostrando de forma clara a influência do pH na eficiência da capacidade de excreção das células. Ain- da, indicaram que as atividades totais obtidas com cada uma .das linhagens atin- giram valores muito próximos, tanto a pH 4 como 6, indicando.que o pH interferiu na excreção, mas não na sfntese propriamente dita. Esses resultados indicam a necessidade de se verificar, com a devida aten- ção, a retenção do produto de interesse pelas células, quando se procura efetuar trabalhos de seleção de linhagens, ou se esteja estudando diferentes condições de cultivo, mesmo que o interesse resida na recuperação de produtos extracelulares. Caso contrário, corre-se o risco de descartar linhagens, ou condições de cultivo, que poderiam ser potencialmente interessantes. 2.3.2 - Características desejáveis de meios de cultivo Conforme já comentado no início do item 2.3, é sempre muito difícil mencio- nar as características de microrganismos, sem associá-los a um determinado meio de cultivo. Dessa forma, as características acima indicadas, na verdade em muitos casos, dependem do meio utilizado, de maneira que se poderia repetir, no presen- te item, características como permitir o acúmulo de produto no meio, não permitir a síntese de substâncias incompatíveis com o produto etc. Claramente isso não te- ria um maior interesse, além de tornar-se monótono, preferindo-se descrever algu- mas características mais específicas, mas que agora, obviamente, dependerão do microrganismo a ser utilizado. Igualmente, não será apresentada uma discussão item a item, mas será efetuada uma abordagem mais geral.
  29. 29. 16 Microrganismose meios de cultura para utilização industrial Algumas características gerais, que devem ser consideradas, são: • ser o mais barato possível; • atender às necessidades nutricionais do microrganismo; ' • auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser ligeiramente tampo- nado, o que evita variações drásticas de pH, ou evitar uma excessiva for- mação de espuma; • não provocar problemas na recuperação do produto; • os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponíveis todo o tempo; • ter composição razoavelmente fixa; • não causar dificuldades no tratamento final do efluente. Todas essas são características importantes, destacando-se o custo do meio de cultura, que deve ser o menor possível, desde que atenda às necessidades do microrganismo selecionado. Justamente essa combinação de atender às necessidades nutricionais do mi- crorganismo, a fim de que o produto possa ser sintetizado, e ser minimamente oneroso, é que, com freqüência, acaba por causar certas complicações, que mere- cem ser mais detidamente discutidas. Como se sabe, os microrganismos utilizam como fonte de carbono, e fre- { qüentemente de energia, diversos açúcares, tais como:.glicose, sacarose, frutose, ou ainda polissacarídeos, como o amido e a celulose. Como fonte de nitrogênio são freqüentemente utilizados sais, como o (NH4hS04 (o qual costuma provocar reduções significativas do pH e, em alguns casos, fenômenos de inibição pelo sul- fato), o (NH4) 2HP04, ou aminoácidos, ou a uréia (a qual permite reduzjr os proble- mas de controle do pH). Como fonte de fósforo utilizam-se os fosfatos solúveis, como o monoamônio fosfato (MAP), ou o diamônio fosfato (DAP), os quais pas- sam a ser fontes de nitrogênio e fósforo simultaneamente. Ainda, necessita-se adi- cionar outros elementos, como: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co etc., em concentrações freqüentemente muito reduzidas, na forma de seus sais solúveis. Meios de cultura constituídos apenas por essas substâncias costumam ser chamados de meios definidos, ou meios sintéticos, cuja composição química é sempre muito bem conhecida e pode ser reproduzida a qualquer instante. Por essa razão, para as células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, es- pera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de, em geral, não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação do produto final. Esses meios, mesmo sendo mais onerosos, podem ser preferidos, caso realmente permitam uma maior economia nas etapas de recuperação do produto. No entanto, para uma grande variedade de linhagens, há a necessidade da adição de certos "fatores de crescimento", ou seja, alguns aminoácidos específicos ou vitaminas (como biotina, tiamina, riboflavina etc.). Claro está que, quando se conhecem essas necessidades específicas, o que nem sempre é o caso, é possível adicionar essas substâncias puras, a fim de manter o meio em sua forma mais defi- nida, mas o custo destes meios pode tornar-se inviável, particularmente para ins- , talações de grande porte, a menos que isto signifique um enorme ganho
  30. 30. Características desejáveisde microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial 17 econômico na recuperação do produto, ou preserve alguma característica funda- mental deste produto, necessariamente de alto valor agregado. Alternativamente, para suprir as necessidades de linhagens mais exigentes e, em geral, com características nutricionais mal conhecidas, pode-se adicionar certos materiais complexos como: extrato de levedura (autolisado de leveduras), extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de proteínas) etc. Esses materiais (individualmente ou adicionados .conjuntamente) permitem introduzir no meio de cultura os fatores faltantes em um meio definido, mas, além de onero- sas, são complexas e de composição variável ao longo do tempo de armazenagem e na dependência do fabricante e do lote empregado. Assim, pode-se imaginar a ocorrência de oscilações no processo fermentativo, além de possíveis dificuldades nas operações de recuperação do produto final, dependendo das características deste produto e das operações de recuperação. É freqüente observar-se, n~s trabalhos básicos de isolamento ou seleção de linhagens, o emprego de meios contendo quantidades muito grandes desses extra- tos ou hidrolisados (vários gramas por litro, ou mesmo dezenas de gramas por li- tro). Dessa forma, no desenvolvimento do processo produtivo, uma das tarefas iniciais é verificar a possibilidade da obtenção de iguais desempenhos, porém em meios isentos desses materiais, ou com a adição de quantidades mínimas, tendo em vista o custo envolvido. Na direção dos meios mais complexos e, igualmente, menos onerosos, razão pela qual são empregados na maioria dos processos fermentativos em grande es- cala, cumpre mencionar o uso de matérias-primas naturais, tais como caldo de ca- na-de-açúcar, melaços, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), água de maceração de milho ("corn steep liquor") etc. · Essas matérias-primas são de composição química desconhecida, poden- do-se conhecer os teores dos açúcares disponíveis, nitrogênio, fósforo, mas não se conhecem os teores dos sais minerais, pois certamente há sempre um número mui- to grande de constituintes. Meios de cultura contendo esses materiais naturais com freqüência são completados com alguns sais (particularmente contendo nitro- gênio e fósforo). Claro está qu~ a composição química estará na dependência de uma série de fatores, tais como solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante a colheita e estocagem etc. Esses fatos indicam já a expectativa de que possam ocorrer oscilações no processo fermentativo que emprega essas matérias-primas, além de obrigarem as empresas produtoras de antibiótico$, ou enzimas a mante- rem instalações piloto para o ajuste da composição do meio a cada novo lote de matéria-prima que a empresa recebe (particularmente aquelas que usam a água de maceração de milho), a fim de evitar maiores surpresas nos biorreatores de grande porte. Inclusive essas matérias-primas naturais podem causar problemas adicionais na recuperação e purificação do produto final, assim como problemas nos trata- mentos das águas residuárias. No entanto, ainda continuam a ser as matérias-primas preferidas em grande número de casos, pela simples razão de serem as mais baratas.
  31. 31. 18 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial 2.4 - Considerações finais A definição adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do meio de cultura para este microrganismo, é etapa fundamental para o sucesso de um processo fermentativo. No entanto, é sempre importante lembrar que a defini- ção de um processo fermentativo. mais adequado, assim como as preocupações com a recuperação do produto, são etapas da mais alta importância. Em alguns casos, o emprego de microrganismos disponíveis em coleções de cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraen- tes. É necessário lembrar, no entanto, que presentemente se dispõe de muitos re- cursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos fermentativos cada vez mais promissores. Essas considerações trazem também um importante alerta sobre a constante necessidade de desenvolvimento do processo produtivo já instalado, justamente por essa grande variedade de desenvolvimentos possíveis. Presentemente é bas- tante difícil imaginar que uma dada empresa disponha do microrganismo "óti- mo", ou do meio de cultura "otimizado". É da mais alta importância que essa empresa continue a busca por melhores condições, em termos de microrganismo e meio; caso contrário, poderá ser ultrapassada por outras com ofertas de produtos de menor custo, ou melhor qualidade. Referências bibliográficas · (1) STANBURY, P.F.; WHÍTAKER, A.; HALL, S.J. Principies of fermentati- on Technology. 2.ed. Reino Unido, Elsevier Science Ltd., 1995. (2) SCHMIDELL, W.; FERNANDES, O.L. O aspecto evolutivo dos processos industriais biotecnológicos. Revista Politécnica, n. 209, p. 31-3, 1993. (3) SANTOS, M.G.G.R.; ABOUTBOUL, H.; FARIA, J.B.; SCHMIDELL, W.; SCHENBERG, A.C.G. Genetic improvement of Saccharomyces for et.hanol producti- on from starch. Yeast, v. 5 (Spec. Iss.}, p. 11-15, 1989. (4) ABUD, A.K.S.; TAVARES, L.B.B.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W.; FARIA, J.B.; SCHENBERG, A.C.G. Avaliação do comportamento cinético da leve- dura Saccharomyces cerevisiae recombinante L36 em biorreator: influência do méto- do de preparo do inóculo. In: XI Simpósio Nacional de Fermentações, São Carlos (SP), 1996. Anais, v.1, p. 1-6, 1996. (5) AGUERO, J.M.Z.; MACEDO, G.R.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W. Influência do pH na síntese eliberação de glicoamilase por Aspergillus awamori NRRL 3112 e Aspergillus niger NRRL 337. Revista de Microbiologia, v. 21, n. 4, p. 355-60, 1990.
  32. 32. 19 -··---. --E~~:[~~:~G~ --- ---· ----~ ----=D~=-~a-..:•la··~'2N'-ft - ---.------- '-V ·--5_, I~V~ -r.~111s;. · -1-V -- · --------------- 3.1 - Introdução --------·-~ Luiz Carlos Urenha José Geraldo da Cruz Pradella Maria Filomena de Andrade Rodrigues Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de seu interior ou superfície. Em alguns processos biotecnológicos industriais, a eli- minação parcial da população microbiana dos equipamentos é suficiente para ga- rantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde inibidores de crescimento são produzidos (fermentação alcoólica, produção de vi- nagre/ácido acético, ácido láctico ou antibióticos e outros biocidas, etc.) o teor de inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vários microrganis- mos. Na indústria de laticínios, os processos de pasteurização destroem a maior parte, mas não todos os microrganismos presentes.1 ' 2 A pasteurização é emprega- da quando uma assepsia mais rigorosa destruiria propriedades importantes do alimento e seus subprodutos. · Assim, desenvolveram-se processos de desinfecção que não esterilizam, mas garantem a assepsia adequada. Essa situação é comum na indústria de alimentos, onde a eliminação de microrganismos patogênicos é levada a efeito por processos não esterilizantes. Nesses casos, a população de microrganismos que não é elimi- nada é mantida sob controle pela imposição de condições que impedem seu de- senvolvimento, como refrigeração ou aplicação de inibidores de crescimento (sais, açúcares em altas concentrações, condimentos, preservantes químicos, biocidas, biostáticos, etc.). Os processos de produção de bens destinados à saúde humana ou animal e os de alimentos enlatados estão entre os mais restritivos com respeito à presença de contaminantes. Nesses casos, a simples presença de uma única célula de conta- minante pode pôr a perder todo um lote do produto. Para lidar com essas situações, desenvolveu-se uina série de técnicas para al- cançar o tipo adequado de assepsia. Esse assunto será abordado no item 3.2.
  33. 33. 20 Esterilização do equipamento A esterilização de equipamentos é feita pela aplicação de métodos físicos ou químicos. Os métodos físicos mais freqüentes são o calor seco, calor úmido, radia- ção ultravioleta, radiação com partículas ionizantes (gama) e ultra-som. Os méto- dos químicos consistem na limpeza do equipamento com líquidos ou gases que matam os microrganismos oudanificam irreversivelmente sua capacidade repro- dutiva (hipoclorito, fenóis, formaldeído, óxido de etileno, ozônio, dióxido de en- xofre, etc.). Reatores bioquímicas e tubulações são, geralmente, esterilizados pela apliw cação de calor úmido (vapor saturado). Equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentação (bombas, filtros, centrífugas, misturadores, separadores, colunas cromatográficas, homogeneizadores, etc.) são preferencialmente esterilizados por calor úmido. Nos casos em que isto não é possível, empregam-se agentes químicos adequados. Material de laboratório utilizado durante o processo é esterilizado por calor úmido (autoclaves), seco (fornos) e mais raramente por radiação ultravioleta. Meios de cultura são esterilizados por calor úmido. Nos casos em que a ina- tivação térmica de nutrientes do meio é significativa (cultura de células animais, vegetais ou de insetos, por exemplo) emprega-se a filtração em membranas ou car- tuchos esterilizantes para remover fisicamente os microrganismos. O ar para o processo fermentativo é esterilizado por filtração em cartuchos esterilizantes. Embalagens são em geral esterilizadas por radiação gama, calor úmido, ou por lavagem com produtos químicos adequados. Os métodos de esterilização agem destruindo ou comprometendo estruturas microbianas, como paredes celulares, ácidos nucléicos, etc., ou iriativando enzi- mas, proteínas, etc. O número de microrganismos que sobrevive em qualquer estágio de uma es- terilização depende diretamente do número inicialmente presente. Portanto, onde for necessário aplicar esterilização, a limpeza e uma baixa carga inicial de micror- ganismos interferem fortemente na severidade do processo a ser aplicado.3 3.2 - Terminologia e modo de atuação 3.2.1 - Esterilização Esterilização é o processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrga- nismos incluindo bactérias, fungos - tanto em suas formas vegetativas corno es- poruladas - e vírus. O termo esterilização possui um significado absoluto e não relativo, ou seja, urna substância ou material não pode ser parcialmente estéril. Um material estéril é totalmente isento de qualquer organismo ativo. Essa condi- ção deve semanter indefinidamente.3'4'5'6
  34. 34. Terminologia e modo de atuação 2 I 3.2.2 - Desinfecção Desinfecção é um processo menos rigoroso de eliminação de microrganis- mos, envolvendo usualmente o uso de um agente químico, denominado desinfe- tante ou germicida, geralmente líquido e à temperatura ambiente ou moderada. A desinfecção não implica necessariamente na eliminação de todos os microrganis- mos, sendo direcionada aos mais prejudiciais, principalmente em sua forma vege- tativa, que é menos resistente que a forma esporulada. Antisséptico é um desinfetante, aplicável em seres animados (humanos e animais) para eliminar microrganismos patogênicos.3 A Tabela 3.1 apresenta uma relação dos principais termos técnicos relaciona- dos a processos de desinfecção, com seus significados. 3.2.3 - Modo de ação dos agentes esterilizantes Agentes esterilizantes podem ser classificados como agentes físicos oU quí- micos. Esses agentes podem induzir, por diferentes mecanismos, a formação de substâncias químicas letais no interior das células e/ou alterações em moléculas essenciais para a manutenção e sobrevivência celular, levando à morte do micror- ganismo. A morte celular pode ser causada por uma ou mais lesões. Na célula viva normal existem inúmeros alvos possíveis de lesão celular, tais como: (a) enzimas, responsáveis pelos processos metabólicos; (b) membrana citoplasmática, que man- tém a integridade do conteúdo celular, controlando o transporte de substâncias entre a célula e seu meio externo, além de ser também o local de algumas reações enzimáticas; (c) parede celular, que proporciona rigidez e resistência mecânica aos microrganismos e participa de alguns processos fisiológicos. Uma lesão em qual- quer um desses níveis pode desencadear alterações que levam à morte celular. Alternativamente, um dano irreversível a um gene, responsável pela codificação de alguma éniima essencial, também pode levar à morte celular. A seguir descreveremos como agem os principais agentes esterilizantes.3 A 6 Calor úmido A temperatura elevada, associada ao alto grau de umidade, representa um dos métodos mais efetivos para a destruição dos microrganismos. O calor úmido mata os microrganismos, principalmente pela desnaturação irreversível de suas proteínas, destruindo portanto elementos essenciais para a sobrevivência e multi- plicação celular, como enzimas·e membranas celulares. A resistência das proteínas ao calor é uma função da hidratação da célula. Quanto maior a quantidade de água, mais facilmente esta entrará nos domínios internos das moléculas de proteína, causando mudanças conformacionais irrever- síveis. Além das proteínas, os carboidratos também sofrem alterações sob o trata- mento de calor, sendo muitas vezes caramelizados e gerando produtos tóxicos. Essa degradação exerce, portanto, um papel importante na esterilização.
  35. 35. 22 Esterilização do equipamento Tabela 3.1 - Principais termos técnicos utilizados em processos de assepsia e seus significados TERMO SIGNIFICADO l'ff, l~-------------------------------4---------------------------------i-~ Esterilização Remoção de todas as formas de vida ti] de um objeto ou material. ~~ll---------------+-----=--------,----------1~.:, . "·Remoção ou destruição dos organis- ~~ "i mos vivos capazes de causar·danos ~ .Desinfecção ou infecções. ""· 1~--------------------~---------------------;~- ·~ ~-··> Desinfectante ou germicida Agente químico capaz de promover desinfecção. 11-----------------+--------------~< Antisséptico Agente químico aplicável em pessoas ou animais, com capacidade de elimi- nar microrganismos patogênicos. Assepsia Remoção de microrganismos patogê- nicos ou indesejados. 1~------------------------+---------~------------~· ~ Pasteurização Tratamento térmico (geralmente 62°C 1 Í' por 30 min, seguido de resfriamento ~· brusco) para redução drástica no nú- mero de microrganismos - presentes ·:-r. em alimentos, normalmente leite, i- seus derivados, e bebidas enlatadas .~.-~: ou engarrafadas. :~· l~-------------------------------4----~~-------------------------i~ Tindalização . Biocidas Biostáticos Processo de esterilização capaz de eliminar esporos altamente resisten- tes ao calor. Consiste em manter, o material a 100°C por vários minutos, resfriá-lo a temperatura ambiente e incubá-lo por cerca de 24 h. O proce- dimento é repetido várias vezes. Du- rante a incubação, os esporos passam à forma vegetativa, onde são suscep- tíveis à destruição durante o aqueci- mento seguinte. Agentes capazes de causar a morte de ·microrganismos. Agentes capazes de impedir a repro- •[! dução de microrganismos, sem neces- -~ ~i Na esterilização por vapor sob pressão (por exemplo, nas autoclaves), esta tem duas funções principais: uma delas está relacionada com a transferência de calor, que é favorecida pela condensação ocorrida no material, levando a um rápi- do aumento de temperatura (difusão de calor) e a outra é a manutenção ou au-
  36. 36. Terminologia e modo de atuação 23 menta do nível de hidratação no interior das células, favorecendo portanto a coagulação das proteínas. Calor seco ·O calor seco destrói os microrganismos através da oxidação de seus consti- tuintes químicos. A esterilização por calor seco é muito mais lenta e menos eficaz que por calor úmido. Ao contrário do calor úmido, nesse tipo de esterilização o ca- lor é transferido muito lentamente e o nível de hidratação das células tende a di- minuir, conferindo urna certa proteção às proteínas. Apesar de a esterilização pelo calor seco ser principalmente um processo de oxidação, não se pode afirmar que a ação do calor seco seja restrita a isto, pois nem sempre o que ocorre é uma esterilização apenas por calor seco. Dependendo do conteúdo de água na célula, pode oçorrer também a coagulaÇão de proteínas. Irradiação por luz ultravioleta (UV) A radiação UV é absorvida por muitas substâncias celulares, mas de modo mais significativo pelos ácidos nucléicos, onde geralmente ocorrem as lesões. O seu efeito letal é proporcional à dose de radiação aplicada. A região do espectro de UV com ação esterilizante é de 220 a 300 nrn, muitas vezes chamada de região "abiótica". Existe urna relação entre os comprimentos de onda germicidas e aqueles ab- sorvidos por ácidos nucléicos ou seus constituintes. Compostos corno as purinas e pirirnidinas, absorvem UV a aproximadamente 260 nm, bem próximo da radiação mais efetiva que é 253,7 nrn. Os aminoácidos aromáticos, corno o triptofano, feni- lalanina e tirosina, absorvem UV a 280 nrn. ·. Dentre os componentes dos ácidos nucléicos, os fosfatos de açúcares não ab- sorvem significativamente UV acima de 220 nrn. As pirirnidinas são muito mais sensíveis ao UV do que as purinas, por isto os efeitos letais e de rnutagênese nos sis- temas biológicos são atribuídos a transformações fotoquímicas das bases de pirirni- dina. A ação esterilizanté do UV ocorre primeiramente pela produção de ligações cruzadas entre pirirnidinas adjacentes na mesma fita de DNA (ácido desoxirribonu- cléico), formando dírneros. Essa reação ocorre principalmente entre resíduos de ti- mina, formando dírneros de tirnina, levando à ·perda da integridade do DNA bacteriano (Fig. 3.1). Essas ligações podem causar erro de leitura do código genéti- co, resultando em mutações que prejudicam funções vitais do organismo e conse- qüentemente causando a morte celular. Existem mecanismos de reparo, pelos quais a integridade do DNA pode ser recuperada, dependendo do nível de lesão. · uv Timinas Dímero de.timinas Figura 3.1 - Formação do dímero de timina

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