1. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA INFECCIÓN POR HPV NUEVAS TECNOLOGIAS DETECCIÓN HPV Juan José Terrádez Raro Anatomía Patológica H. Arnau de Vilanova BASES MOLECULARES DEL CANCER APLICACIÓN A LA PATOLOGIA TUMORAL Hospital Luis Alcanyís XATIVA. Valencia

2. Situación de la detección precoz en EUROPA 1959 ( Ostfold County,Norway ) 1960 ( Región de Grampian. Scotland) 1963 Programas de cribado organizado en países nórdicos: Finlandia, Islandia y Suecia No se introduce en Noruega Éxito del Programa Finlandés : Cribado a mujeres de 30-60 años Pauta: Cada 5 años. Suecia: Valoración de la eficacia del cribado basado en el análisis de lesiones preinvasivas. 1965: Programa de cribado organizado en Paises Bajos (BENELUX) 1980: Programa de cribado organizado en una provincia de Dinamarca 1980/ 1989: Programa de cribado organizado en Inglaterra Austria, Alemania y Luxemburgo en año 2000. Tendencia ineficaz de sus cribados 1990: “ European commission, “ Europe Aganist cancer”. Red Europea de cribado Grupo de Epidemiología de la Red E. de cribado CC. VARIABILIDAD entre los Pr. De Cribado : Organización/Aplicación Metodología de Cribado 2008 España: Cribado oportunista Evaluación / Manejo clínico 1993: European Commision´s Quality Assurance Guidelines for CC screening 1995-2005 Numerosos Estudios multicéntricos y Planes Pilotos con N.Tecnologías Miller AB. The inefficiency of cervical screening in Europe. European J Cancer 2002;38:321-326 A.Linos, E.Ariza. Introduction Cervical Cancer Screening. European J of Cancer 36 (2000) 2175-2176

3. A pesar del cribado, el cáncer de cuello uterino sigue siendo demasiado frecuente *Grupo de edad 0->65 1- Van Ballegooijen y cols. Eur J. Cancer. 2000; 36: 2177-2188. 2- Anttila y cols. Brit. J. Cancer . 2004; 91: 935-941. 3- Luengo Matos y cols. Aten Primaria. 2004; 33(5):229-36. 4- Ferlay J y cols. GLOBOCAN 2002 3- Quinn et al. BMJ 1999; 318: 904-908 9,3 3,4 58 3 25-64 Bélgica 1 12,6 5,0 75 3 23-59 Dinamarca 2 8,2 3,1 83 3 23-60 Suecia 2 7,6 2,2 49,6 3 a 5 20-64 España 2, 3 7,3 2,3 77 5 30-60 Países Bajos 2 8,1 2,2 53-74 3 25-64 Italia 2 10,8 3,8 50 1 20-85 Alemania 2 9,8 3,1 69 3 25-65 Francia 2 4,3 1,8 93 5 30-60 Finlandia 2 8,3 3,1 83 3 a 5 20-64 Inglaterra 2 Incidencia de cáncer de cuello uterino/ 100.000 4 Mortalidad del cáncer de cuello uterino/ 100.000 4 % con detección selectiva regular Intervalo (años) Límites de edad (años) Recomendación

4. Segundo cáncer en frecuencia en mujeres jóvenes europeas UE, mujeres (edad 15–49) Casos nuevos de cáncer cada año: 106,906 1. Ferlay y cols., editores. Globocan 2000: Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide, version 1.0 IARC Cancer-Base No.5. Lyon. IARC Press, 2001

5. Impacto del VPH y SIL en España (1996-2000) (1) Estimación basada en Globocan 2000. (2) Estimación basada en estudios de población general estratificados por edad en 2 áreas urbanas de Cataluña (rango: 2-7%). (3) Estimación de un 0.1% de prevalencia de HSIL basado en (2) Cerca de 1000 muertes/ año 2008 MUJERES (1) (15 - 74 años) 15.640.000 VPH + (2) 655.000 ASCUS/LSIL (2) 497.000 HSIL (3) 16.000 Cáncer invasor (1) 2.000

7. Mortalidad por Cáncer de Cérvix en España (1975-2004) Tasas ajustadas por edad ( Pobl. Europea)

8. Hitos en el Screening del Cáncer de Cérvix ThinPrep ® SurePath ® 1996 1999 1949 LBC: Citología líquida 2003 Revisión de las pautas de screening 1990s LBC 2000s Test de Papanicolau VHP– 99,7% Cánceres de Cérvix 1 1 Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado ) PCR 1980 P16 CINTec Cervatec p16 ELISA L1Ag Cytoactiv ONCOTEC mRNA E6/E7 Screening 1º basado en DNA HPV HC-2 / H Ventana Amplicor* Roche DNA Invader* WD 2008 PREVENCION PRIMARIA ESCENARIO POSTVACUNAL Prevención Secundaria Prog. Base Poblacional Finlandia 1963-2008 Meisels and Fortin 1976 Purola and Savia 1977 Coilocito / Efecto citopatico HPV Dürst et al. 1983

9. Filogenia Chan et al., J Virology, 69:3074-83 (1995) 31 16 35 45 18 39 11 6 33 VP Humanos (mucosa genital) Beta HPV VP Animales VP Humanos (cutaneos) Alfa HPV

10. HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age 15- 19 20- 24 25- 29 30- 34 35- 39 40- 44 45 - 49 50- 54 55- 59 60- 65 Age (Years) HPV Prevalence (%) HPV (HC2) Cancer 1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871. 0 5 10 15 20 25 30 Cancer incidence per 100,000 0 5 10 15 20 25 30

13. World Health Organization Classification

15. Nuestro problema: Lesión escamosa atípica

16. Metaplasia transicional

17. METAPLASIA ESCAMOSA INMADURA ATÍPICA: Grupo heterogéneo cuyo aspecto morfológico no se correlaciona con el estatus de expresión de HPV

18. Metaplasia papilar inmadura

19. ATIPIA ESCAMOSA EN POSTMENOPAUSIA Espectro de lesiones que incluye cambios psedocoilocíticos Diagnóstico diferencial con SIL

21. EL PAPILOMAVIRUS

23. REGION EARLY: Funciones proteínas Mecanismos reguladores crecimiento Membrane associated epitelial hiperplasia Activation EGFR / Inhibition Vascular ATPase Inhibition MHC-I and MHC-II E5B E1 (Factor Replicación ADN viral) E2 (Regulador de la replicación ADN y transcripción ARN) Target: CRA-UBF (Upstream Binding Factor) Domínio: 5H 216-255C E7 (Ruptura ciclo celular). Rb / P16 E6 (Degradación p53) Antiapoptotic / BAK Activ. TELOMERASA

25. REGION LATE: Funciones proteínas L1 Proteina mayor cápside 57 KDa Virion formation Interactua con L2 Interactua con receptores de la célula 72 capsómeros Capsómero de L1 5 x L1 Partícula viral Virus HPV Proteina L1 L2 Proteina menor cápside de 43-53 KDa Genome encapsidation / Membrana penetration / Entry / Traficking

27. Changes in protein expression patterns in PRODUCTIVE INFECCTION Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado J.J. Terradez )

28. Infección productiva HPV

29. Changes in expression patterns that accompany progression to cervical cancer Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado JJTerradez ) Decresing epitelial diferentation Virus producing Non productive

30. ¿Cómo se transforma una infección HPV en un carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN huésped Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46. LCR E7 E6 E1 L1 L2 E2 E4 E5 Punto de rotura e integración + – LCR E7 E6 E1 L1 L2 E2 E4 E5 ADN del VPH integrado AND huésped ADN huésped E2 ADN episomal del VPH

35. Proposed new screening algorithm Women aged 25-64 y HPV Test Normal 5 year recall CYTOLOGY HPV test and Cytology at 6-12 months Colposcopy Normal 5 Year Recall Cyto Neg HPV Neg Colposcopy Negative Positive =/> Mild Normal or Borderline Cyto=/> Mild HPV and Cytology at 6-12 months HPV+ and Cyto >mild HPV – and Cyto Borderline EUROGIN November 2008

37. Carácter ísticas de las técnicas de detección de ácidos nucleicos Pendiente de estandarizar. Tecnologías patentadas. Requieren experiencia y dotación costosa del laboratorio. Tecnología flexible (carga viral y genotipo). Sensibilidad muy alta. Análisis múltiple. Amplificación de la diana Tecnologías patentadas y costes elevados. Genotipado en grupos. Comercializada y estandarizada. Semicuantitativa. Señal amplificada Baja sensibilidad, laborioso, y el SB no puede utilizar tejido con ADN degradado. SB es el estándar y el FISH permite ver el VPH asociado con la lesión histológica. Sonda directa Inconvenientes Ventajas Método

38. Principios usados en las técnicas mas comunes de detección del HPV 1- Hibridación in situ (ISH): (Sonda directa) Hibridación de DNA Disponible en prueba coktail. ( Comercial ) 2- Hibridación seguida de “amplificación de la señal” Hybrid Capture 2 (HC2 R ,Qiagen): RNA probe Coktail. (Comercial). Invader Tecnology: Third Wave invader HPV test. ( Comercial). 3- PCR de amplio espectro : “ Amplificación de DNA con primers consenso” o formato múltiplex ( Disponibles comercialmente) Real time HR-HPV ( Aboot) AMPLICOR R ( Roche) 4- PCR tipo específicas: Linear Array / Secuenciación

39. 1- Hibridación in situ sobre tejido: sondas HPV HR Poca sensibilidad

42. M étodo de captura de híbrido (HC2) • DESNATURALIZACIÓN • HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE ALTO Y BAJO RIESGO • CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN • FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI- ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA ALCALINA • DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE

43. • Es la técnica molecular más sensible y flexible. • Puede ser utilizada para la detección, la cuantificación, la secuenciación y el análisis mutacional. • La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos). • Exige del laboratorio y del personal una normas y unas condiciones especiales. L2 L1 CGTCC M A RR GGA W ACTGATC GC M CAGGG W CATAA Y AATGG 3- Detecci ón del VPH por PCR GPMY09/11 E6 E7 E1 E2 E5 E4 1 2 3 4 5 6 7 7,9 kb primers 450 bp MY09/11 PGMY GP5+/6+ 150 bp 65 bp SPF10 165 bp AMPLICOR ROCHE ®

44. Description of main primer sets used in PCR amplification 1

45. Description of main primer sets used in PCR amplification 2

47. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real

48. Hibridaci ón reversa LIPA (INMUNOENSAYO LINEAL) • Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L1 ( primers SPF). • Detecta 25 tipos de VPH e infecciones múltiples. LINE-BLOTTING (PGMY-LB) • Amplifica la región L1 con mezclas de primers (PGMY09/PGMY11) y el gen de la betaglobina humana, ambos biotinados. • El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos de VPH fijadas a una membrana de nitrocelulosa. (Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508-17. Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020-7. Kornegay et al . J Clin Microbiol 2003; 41: 1080-6. Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122-9.) 0,79 Valor kappa 8,2 Discordancia 11,2 Compatibilidad 80,6 Concordancia LIPA Vs. LINE-BLOTTING

49. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real

50. • Método que permite combinar la sensibilidad de la PCR con el poder discriminatorio de las endonucleasas de restricción. • Es un sistema poco laborioso y menos costoso que LIPA y secuenciación. • Resulta difícil detectar infecciones mixtas. Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85. Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536-40. Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159-70. RFLP (patr ón de restricción con endonucleasas)

51. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real

52. • Tras una PCR de la región L1, que marca el producto amplificado, se hibrida con oligonucleótidos dispuestos en microarray . • Se generan sondas a cada tipo de VPH y se fijan a los pocillos de reacción. • Se amplifica la muestra con primers genéricos marcando con Cy5 el producto amplificado. • Hibridación y lectura. (An et al. Cancer 2003; 97: 1672-80. Oh et al. J Clin Microbiol 2004; 42: 3272-80. Gheit et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 2025-31.) Hibridaci ón con microarrays

53. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real

54. TESTS PARA LA DETECCIÓN DE ADN-VPH HC I HC II HC III TS.PCR; L1.PCR GP.PCR realtime -PCR Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix (Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244-65.) 1980 1990 2000 SOUTHERN FISH SENSIBILIDAD - + ADN-VPH EN CÁNCER CERVICAL 30%-60% 75% 95% 99%

55. - + SENSIBILIDAD Hibridación in situ Southern blot HC II PCR real time PCR Sonda directa Señal amplificada Amplificación de la diana

57. • No se correlaciona bien con el nivel de lesión histológica. • Hay que distinguir la alta carga vírica previa al aclaramiento del virus y la que es consecuencia de la persistencia del virus. • Únicamente se ha demostrado que tiene valor en las infecciones simples por HPV 16. Gravitt et al., Int J Cancer, 2007,121,2787. Briolat et al., Int J Cancer, 2007,121,2198. Determinaci ón de la carga vírica

58. Carga viral total / Carga viral relativa 1- Celularidad de la toma 2- Distribución superficial de la lesión 3- Tasa de infección por célula 4- Conservación de la muestra ( DNA, Inhibidores) CVR= CVT : nº cel.

59. Estrategia para el genotipado del VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real

61. • La integración del ADN vírico conduce a la sobreexpresión de E6 y E7 • Utiliza técnicas de hibridación in situ (FISH) con sensibilidad incrementada (HPV-CARD) • El ADN integrado ó episómico presenta diferentes patrones de visualización chimnich et al., Cancer Cytopath,2007,111,330. Integraci ón del ADN vírico en el cromosoma celular Algeciras-S

62. Tests de detección de RNA Métodos de amplificación de RNA isotérmicos PreTec HPV-Proofer ( Norchip): 5 genotipos HR-HPV APTIMA GenProbe: 13 Genotipos HR-HPV. Detección mRNA sin destrucción celular: ONCOTEC Hibridación in situ con fluoresceina ( FISH)+ citometría de flujo

64. Detecci ón de ARNm de E6/E7 del VPH • La expresión de E6 y E7 puede medirse por sus niveles de ARNm. • Es un marcador indirecto de integración vírica. (Lie et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908-15.) • Tiene mayor valor predictivo positivo que otras técnicas moleculares en lesiones de bajo grado. • Existen comercializadas en formato de NASBA y FISH.

65. • Amplificación de diana ARN (NASBA) • Utiliza sondas específicas ( molecular beacons ) • Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45 • Correlaciona con otros marcadores de progresión histológicos (p16INK) pero no con la carga vírica. Molden et al., J Virol Meth, 2007,142,204. Andersson et al., Int J Oncol, 2006,29,705 Detecci ón de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- Proofer

67. XVIII Congreso Nacional de la SEC. XVI Reunión de la SPC. XIII Reunión Iberoamericana de citología. Mayo del 2008 .

68. Método HPV OncoTect CÉLULAS exocervicales con secuencia diana Etiqueta anticuerpos CITÓMETRO DE FLUJO HPV E6, E7 ARNm+ Cels (%) HPV E6, E7 ARNm - Cels FIJAR/ PERMEABILIZAR (R1, R2, R3) + CALOR/LAVADO (R6/R7) OLIGONUCLEÓTIDOS marcados con fluorocromo (R5) ARNm E6/E7 Fluorocromo unido a sonda de ADN complementaria a ARNm ATTAGAAT PMNs Células endocervicales Células exocervicales Debris

69. Distribución de poblaciones celulares según expresión de E6/E7 Narimatsu R, Patterson BK. High-throughput cervical cancer screening using intracellular human papillomavirus E6 and E7 mRNA quantification by flow cytometry. Am J Clin Pathol. 2005 May;123(5):716-23. Sobrexpresión E6/E7 presente (doble pico) No expresión E6/E7detectada

73. Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA en fluido vaginal P16 en citología / Tejido parafinado

79. Expresión de P16 Infección HPV Infección HPV Persistente Desregulación Celular CIN Alto grado Cancer Invasivo HPV test (HC2 o PCR) Nuevo biomarcador (p16 INK4a ) Pap test Individuos en riesgo Pacientes con Enfermedad

81. Utilidad del estudio de patrones de expresión de p16

84. SCORE 1 SCORE 2 p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7

85. SCORE 3 SCORE 4 p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7

86. Muchas Gracias