Apresentação do grupo de curso de medicina veterinária na disciplina de bioquimica do em 2008

1. Western blot
Componentes:
José Luiz Boaretto
Laíz Galvão e Silva de Moura
Carlos César Rodrigues de Oliveira
Cryslene Caroline R. Lameira
Gleycianne Silva dos Anjos
Luane Lopes Pinheiro
Analia Costa de Oliveira Neta

2. Western Blot é uma técnica usada
para detectar proteínas de uma
determinada amostra e serve como
teste confirmatório dos resultados
obtidos em testes imunoenzimaticos.
Pode ser usada para detectar
proteínas dos anticorpos do vírus do
HIV, doença da Vaca Louca, doença
de Lyme, Saccharomyces serevisiae e
etc.

3. •
1. Preparação do tecido; Detecção radioativa;
•
2. Detecção fluorescente;
Eletroforese em gel;
7.
3. Sondagem secundaria.
Transferência;
8.
4. Analise.
Bloqueio;
5. Detecção;
• Método de dois passos:
a) Anticorpo primário;
b) Anticorpo secundário.
• Método de um passo;
6. Detecção
• Detecção colorimétrica;
• Quimioluminescência;

4. Preparação do Eletroforese
tecido; em gel;
Bloqueio; Transferência;
Detecção; Analise.

5.  Amostra : Tecido Biológico e/ou cultura de células.
 Elas são esfriadas ou aquecidas rapidamente.
 São homogeneizadas por sonicação (quebra das células por
alta freqüência sonora) ou por força mecânica a qual
resultará em uma mistura homogênea dos componentes das
células.
 Após esse passo o tecido pode ser usado como esta ou
sujeito a uma centrifugação onde passará por uma serie de
passos para a isolar o material do citozóico (material do
interior da célula externo ao seu núcleo).
 Fervura das amostras : carentes elétricas, composto
sulfuroso e DSS*
DSS*= Dodecil sulfato de sódio.

6. Géis
A separação é feita de acordo com o peso molecular.
É feita por aplicação de cargas elétricas a qual vai fazer
com
que as proteínas caminhem em uma única direção ao
longo
do gel. As amostras são carregadas lado-a-lado em valas
feitas no gel. As proteínas são então separadas por massa
em
“bandas” dentro de cada “raia” formada a partir da vala.
Uma raia é reservada para um marcador ladder que é
uma
proteína de peso molecular conhecido.

7. As proteínas são separadas em duas
dimensões .
As proteínas são separadas na primeira
dimensão de acordo com o seu ponto
isoelétrico: pH com uma carga total igual
a zero.
 As proteínas separadas na segunda
dimensão é de acordo com seus pesos
moleculares.

8. As proteínas acessíveis à detecção dos anticorpos têm que
ser removidas do gel e posto em uma membrana de
nitrocelulose ou PVDF. Para tal mecanismo é preciso a
aplicação de uma corrente elétrica. Seu resultado é uma fina
camada da proteína para sua detecção.
Ambas as variedades de membranas são escolhidas por-
que elas tem a capacidade de ligar-se a proteínas não
especificamente.
 Interações hidrofóbicas .
 Interações de carga.
 Custo.

9. O boquei é usado para impedir as
interações não específicas entre a
membrana e os anticorpos usados para a
detecção da proteína alvo.
 Solução diluída de uma proteína-
tipicamente albina de soro bovino(BSA).
 Leite seco desnatado com uma
pequena quantidade de detergente:
Tween 20 ou carbono coloidal.

10.  Método de um passo
• Rapidez no processo;
• Menos material consumido;
• Anticorpo sonda: Marca a proteína de interesse e uma
marcação detectável(freqüências protéicas conhecidas);
• A sonda primaria é incubada com a membrana de forma
similar ao método de dois passos. Ela pode então ser
detectada de forma direta após varias lavagens.
 Método de dois passos
• A membrana será testada com os anticorpos da proteína de
interesse, ligadas por enzimas reveladoras.(muda a cor)
• Anticorpos primários: Liga-se direto à proteína.
• Anticorpos secundários: São ligados onde os anticorpos
primários não se ligaram.

11. Detecção colorimétrica;
Quimioluminescência;
Detecção radioativa;
Detecção fluorescente.

12. Após a realização de toda a técnica, as
proteínas alvo estão prontas para
serem estudadas e é na analise que isso
será feito.
A analise é feita nas partes em que as
sondas são marcadas e ligadas as
proteínas e as que não forem ligadas a
esta são retiradas.

13. A sondagem secundaria é como se fosse uma continuação
da transferência. São usados tanto a membrana de
nitrocelulose quanto o PVDF.
Esse passo é responsável pela identificação dos anticorpos e
pode também ser reutilizado para sondagens
subseqüentes.
Atualmente a mais utilizada é a M. de N. do que a PVDF.
Esta por sua vez é muito mais cara e permite uma
revelação muito mais fácil e pode ser reutilizada muito
mais vezes.

14. A técnica western blot tem sua
aplicação muito
importante em diagnósticos
médicos, o qual ajuda na
detecção dos anticorpos, produzidos
por nós, de varias
doenças, como por exemplo a AIDS, a
doença da Vaca Louca e outras.

15.  Neste trabalho explanamos sobre o tema Western
Blot, que é um exame mais especifico para a
detecção de proteínas virais.
 Esse método utiliza eletroforese em gel para obter o
resultado esperado.
 Ele é muito utilizado em testes imunoenzimáticos.
 Também exames confirmatórios de doenças, como
a doença da vaca louca e doença de Lyme.
 A técnica Western Blot foi e é para a medicina um
grande avanço, pois através deste podemos dizer
com precisão resultados de doenças como a AIDS
entre outras.