PROTOCOLO PROTEÓLISE E 
ATIVIDADE PROTEOLÍTICA
John Warnens Canuto
O LEITE
 Sua  principal  proteína  é  a  caseína,    a  caseína  é 
formada  de  quatro  compostos  proteicos  a  k­
case...
DEGRADAÇÃO DAS PROTEÍNAS
 Metaloproteases  de  psicrotróficos,  são  enzimas 
extracelulares  produzidas  por  micro­orga...
PROTEÓLISE
 É avaliada pelos métodos de Hull (1947), e o Método de 
Winzler et al (1948);
 Estes  métodos  são  baseados...
CONSTITUINTE
S DA CASEÍNA
Tyr
Phe
Trp
CONSTITUINTES DA K­
CASEÍNA
CONSTITUINTES DAS PROTEÍNAS 
DO SORO
TIROSINA
 Formula química: C9H11NO3
 Massa Molar: 181.17 g mol­1
METODOLOGIA DE HULL
AMOSTRA DE LEITE
5 ml da amostra de leite
  +
10 mL de ácido Tricloroacétco 
(Cl3COOH) 0,72N
Agitação
Repouso por 10 minut...
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO
5 ml de solução L ­tirosina concentração conhecida em 
mg/5mL
  +
10 mL de ácido Tricloroacétco...
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO
 A  partir  de  uma  solução  estoque  1  mg/5mL  fazemos 
diluições  balão  volumétrico  de  ...
CURVA DESCRITA POR M.E. HULL 
(1947)
METODOLOGIA DE WINZLEI 
LEITE:
01 mL da amostra de leite
+
2,5 mL de agua destilada
+
 04 mL da Solução desproteinizante 
(ácido perclórico 1,2 mo...
LEITE
5 mL do Solvente Alcalino (solução de carbonato de sódio 
0,85 mol.L­1) 
0,2 mL do reagente de Folin Ciocalteau 2 N
...
BRANCO
0,5 mL do Solvente Alcalino 
(solução de carbonato de sódio 
0,85 mol.L­1) 
0,2 mL do reagente de Folin 
ciocalteau...
RESULTADOS
 Os resultados se dão através do calculo:
Faria et.al (2014)
REFERÊNCIAS
 HULL,  M.  E.  Studies  on  milk  proteins:  II­
Colorimetric  determination  of  the  partial 
hydrolysis  ...
MUITO OBRIGADO!
John Warnens Canuto
 Técnico em Alimentos
Acadêmico do Bacharelado em Ciência e Tecnologia de 
Alimentos  ...
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Protocolo proteólise

  1. 1. PROTOCOLO PROTEÓLISE E  ATIVIDADE PROTEOLÍTICA John Warnens Canuto
  2. 2. O LEITE  Sua  principal  proteína  é  a  caseína,    a  caseína  é  formada  de  quatro  compostos  proteicos  a  k­ caseína, αs1­caseína e  αs2­caseína e  ­caseínaβ
  3. 3. DEGRADAÇÃO DAS PROTEÍNAS  Metaloproteases  de  psicrotróficos,  são  enzimas  extracelulares  produzidas  por  micro­organismos  mesófilos psicrotróficos com potencial de  crescimento  em temperaturas acima de 4 ºC.
  4. 4. PROTEÓLISE  É avaliada pelos métodos de Hull (1947), e o Método de  Winzler et al (1948);  Estes  métodos  são  baseados  na    quantificação  do  aminoácido  tirosina  (Tir  ,  Tyr  ou  Y)  por  método  colorimétrico. L­TIROSINA TIROSINA
  5. 5. CONSTITUINTE S DA CASEÍNA Tyr Phe Trp
  6. 6. CONSTITUINTES DA K­ CASEÍNA
  7. 7. CONSTITUINTES DAS PROTEÍNAS  DO SORO
  8. 8. TIROSINA  Formula química: C9H11NO3  Massa Molar: 181.17 g mol­1
  9. 9. METODOLOGIA DE HULL
  10. 10. AMOSTRA DE LEITE 5 ml da amostra de leite   + 10 mL de ácido Tricloroacétco  (Cl3COOH) 0,72N Agitação Repouso por 10 minutos Filtração em Papel Filtro 5 mL do Filtrado + 10 mL da solução de Hexametafosfato de  sódio  e carbonato de sódio +3 mL sol Folin Ciocalteal Agitar em Vortex, e encubar por 5  minutos a 37° C Leitura em Espectrofotômetro 650 nm Leitura dos resultados pela função da  curva padrão em mg/5mL de Tirosina
  11. 11. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO 5 ml de solução L ­tirosina concentração conhecida em  mg/5mL   + 10 mL de ácido Tricloroacétco 0,72N Agitação 5 mL 10 mL da solução de Hexametafosfato de  sódio  e carbonato de sódio +3 mL sol Folin Ciocalteal Agitar em Vortex, encubar por 15  minutos a 37ºC Leitura em Espectrofotômetro 650 nm  
  12. 12. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO  A  partir  de  uma  solução  estoque  1  mg/5mL  fazemos  diluições  balão  volumétrico  de  50  mL,  devidamente  secos  e  conferidos  quanto  a  sua  exatidão.  ( curva padrão.xlsx; Curva padrão Final.xlsx) Volume ( sol L­tirosina  1mg/5ml) Concentração 2,5 0,01 5 0,02 7,5 0,03 10 0,04 12,5 0,05 15 0,06 17,5 0,07 20 0,08 22,5 0,09 25 0,1 27,5 0,11 30 0,12 32,5 0,13 35 0,14 37,5 0,15 40 0,16 42,5 0,17 45 0,18 47,5 0,19 50 0,2 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 f(x) = 1,49x ­ 0 R² = 0,99 Concentração Absorvância Linear (Absorvância) concentração de l­tirosina em mg/5mL Absorvância
  13. 13. CURVA DESCRITA POR M.E. HULL  (1947)
  14. 14. METODOLOGIA DE WINZLEI 
  15. 15. LEITE: 01 mL da amostra de leite + 2,5 mL de agua destilada +  04 mL da Solução desproteinizante  (ácido perclórico 1,2 mol.L­1) Repouso por 10 minutos Filtração em papel filtro 03 mL do filtrado + 0,5 mL da solução Precipitante(ácido 46 fosfotúngstico  8,7mmol.L­1 em ácido clorídrico 2,0 mol.L­1)  Agitação Repouso por 15 minutos Centrifugação 2.500 rpm/10minutos Descarte do sobrenadante em  papel toalha
  16. 16. LEITE 5 mL do Solvente Alcalino (solução de carbonato de sódio  0,85 mol.L­1)  0,2 mL do reagente de Folin Ciocalteau 2 N Incubação 37°C por 15 minutos Leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda  680nm Anotar o resultado
  17. 17. BRANCO 0,5 mL do Solvente Alcalino  (solução de carbonato de sódio  0,85 mol.L­1)  0,2 mL do reagente de Folin  ciocalteau 2 N Incubação 37°C por 15 minutos Leitura em espectrofotômetro  com comprimento de onda  680nm Anotar o resultado Mesmo procedimento da amostra trocando a  amostra por uma solução padrão de solução de L­ tirosina a 5 mg.5mL­1 PADRÃO
  18. 18. RESULTADOS  Os resultados se dão através do calculo: Faria et.al (2014)
  19. 19. REFERÊNCIAS  HULL,  M.  E.  Studies  on  milk  proteins:  II­ Colorimetric  determination  of  the  partial  hydrolysis  of  the  proteins  in  milk.  Journal  of  Dairy Science, v. 30, n. 11, p. 881­884, 1947.  COSTA,  J.F.  DA  Atributos  de  qualidade  associados  à  proteólise  no  leite  cru  refrigerado.  Dissertação  de  mestrado.  Universidade  Federal  de  Juiz  de  Fora.  2014.  Juiz  de Fora, Minas Gerais.  ROSA,  D.T.  Atividades  proteolíticas  e  micro­ organismos  envolvidos  na  maturação  do  queijo Serrano. Tese de doutorado. Universidade  Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre 2005
  20. 20. MUITO OBRIGADO! John Warnens Canuto  Técnico em Alimentos Acadêmico do Bacharelado em Ciência e Tecnologia de  Alimentos  ­ IF Sudeste MG – Câmpus: Rio Pomba Bolsista PET­Ciências Agrárias E­mail: johnwarnens@gmail.com

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