Seminário de enzimologia

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Seminário de enzimologia

  1. 1. Aproveitamento do resíduo de laranja para a produção de enzimas lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr) Universidade Federal do Ceará Departamento de Tecnologia de Alimentos Disciplina: Enzimologia e Tecnologia das Fermentações Professora: Vanesca Frota Ana Beatriz Bezerra Moraes Ana Cláudia de Morais Lima Nascimento Ana Karoline Ferreira Leite Haysa Sales Rodrigues Rayane Rodrigues Sinara Lemos de Paiva
  2. 2. 1. Introdução 2.Objetivos 3. Materiais e Métodos 4. Resultados e Discussão 5. Considerações Finais 6. Etapas Futuras 7. Referências Bibliográficas Sumário 2
  3. 3. 1. Introdução 3 • Nos últimos anos, há um interesse crescente no uso de diversos resíduos agroindustriais; • Produção de diversas moléculas: proteínas microbianas, ácidos orgânicos, etanol, enzimas e metabólitos secundários biologicamente ativos; • Economicamente viável; • Reduz os problemas ambientais.
  4. 4. 4 1. Introdução • A laranja está entre as frutas mais produzidas e consumidas no mundo; • A citricultura é uma das atividades agrícolas que mais vem se desenvolvendo na região noroeste do Paraná; • 34% da produção é transformada em suco; • Em grandes países produtores esta percentagem chega a 96%; • O resíduo equivale a 50% do peso da fruta e tem uma umidade aproximada de 82%.
  5. 5. 5 1. Introdução • O resíduo de laranja é usado principalmente como complemento para ração animal; • Estes resíduos possuem utilização restrita; • Grande quantidade de água e alto custo de secagem; • Interesse das empresas em desenvolver mercado para bagaço cítrico úmido; • Os resíduos de laranja podem ser utilizados na obtenção de fertilizantes orgânicos, pectina, óleos essenciais, compostos com atividade antioxidante e várias enzimas (pectinases e amilases).
  6. 6. 6 1. Introdução • Pleurotus spp.(Jack:Fr) Kumm. (Pleurotaceae, Basidiomicetes) é um grupo de cogumelos com alto valor nutricional; • São fungos causadores da podridão branca da madeira; • Degradam a lignina, um polímero fenólico recalcitrante encontrado nos vegetais; • Produzem enzimas lignocelulolíticas (lacases, Mn peroxidase e peroxidase versátil) .
  7. 7. 7 1. Introdução • Cultura em estado sólido; • Possibilita a obtenção de elevadas atividades de enzimas, incluindo enzimas ligninolíticas; • O crescimento do microrganismo pode ocorrer na superfície ou em todo o substrato; • A escolha do substrato específico deve está relacionado ao custo e viabilidade; • O cultivo em substratos lignocelulósicos fornece elementos à nutrição fungica.
  8. 8. 2. Objetivos 8 Neste trabalho foi proposto o uso de resíduos de laranja como substrato para a obtenção de enzimas hidrolíticas e oxidativas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos, como: lacase (EC 1.10.3.2), manganês peroxidase (EC 1.11.1.14), xilanase (EC 3.2.1.8) e endo-1,4 glucanase (EC 3.2.1.4), por Pleurotus ostreatus cultivados em estado sólido.
  9. 9. 3.1- Microorganismo ● Pleurotus ostreatus CCB2; ● Em laboratório, a espécie é mantida por repiques periódicos em ágar batata dextrose (BDA); ● Placas totalmente colonizadas, com até 2 semanas de idade; ● Discos com 10 mm de diâmetro; 3. Materiais e Métodos 9
  10. 10. 3.2 - Preparo dos resíduos de laranja ● Indústrias de suco da região de Maringá – PR; ● Secagem (estufa de ventilação forçada 35° C – peso constante) e moagem; ● Após a Secagem: os resíduos foram triturados em partículas com diâmetro médio de 4 mm; 10 3. Materiais e Métodos
  11. 11. 3.3 - Condições de cultivo 4g resíduo de laranja seco – (Erlenmeyer 250 mL); Foi adicionado Solução mineral ao substrato – (umidades iniciais variando de 50 a 90%); Os meios foram esterilizados em autoclave por 15 min. a 121 °C; 4 discos de 10 mm de diâmetro das culturas de P. ostreatus em BDA foram assepticamente transferidos para os frascos; 11 3. Materiais e Métodos
  12. 12. 3.3 - Condições de cultivo As culturas foram mantidas em Temperaturas variáveis (20 – 35°C até 30 dias) na presença/ausência de luz; As culturas interrompidas a cada cinco dias; As massas miceliais foram retiradas com auxílio de uma espátula, lavadas com água destilada 2 vezes e secas em estufa a 60 °C até peso constante para determinação da biomassa. 12 3. Materiais e Métodos
  13. 13. 3.4 - Extração das enzimas  Retirada da biomassa enzimas foram extraídas adicionada 20 mL de água destilada substrato culturas remanescentes;  Mantidos a 8°C sob agitação/30min.;  Materiais sólidos separados por filtração (gaze); 13 3. Materiais e Métodos
  14. 14. 3.4 - Extração das enzimas  Filtrados foram centrifugados/10min;  Os sobrenadantes límpidos foram utilizados como fontes das enzimas. 14 3. Materiais e Métodos
  15. 15. 3.5 - Determinação das atividades enzimáticas Lacase - Substrato sirigaldazina - Mistura: 1,5mL tampão fosfato (100 mM; pH 6,5) 0,2mL de sirigaldazina (0,5 mM em solução etanólica) 0,1mL de filtrado da cultura Oxidação após 5min e a 30ºC absorve em 525nm 15 3. Materiais e Métodos
  16. 16. 3.5 - Determinação das atividades enzimáticas • Manganês peroxidase - Oxidação: 10mM MnSO4 (30ºC) 50mM malonato de sódio Presença de 0,5 mM H2O2 e pH 4,5  O íon mangânico forma complexo com o malonato, o qual absorve 270nm 16 3. Materiais e Métodos
  17. 17. 3.5 - Determinação das atividades enzimáticas • Xilanase, amilase, pectinase e endoglucanase - Açúcares redutores - Hidrólise dos substratos: Xilano Amido Pectina Carboximetilcelulose • β-glicosidase e β-xilosidase - substratos sintéticos: p-nitrofenil-β-glicopiranosídeo p-nitrofenil-β-xilopiranosídeo 17 3. Materiais e Métodos
  18. 18. 3.6 - Outros métodos analíticos  Carboidratos solúveis totais - Método fenol sulfúrico (glicose) Açúcares redutores - Método ácido 3,5 dinitrosalicílico (glicose) 18 3. Materiais e Métodos
  19. 19. 19 3.7- Análises estatísticas • Teste ANOVA • Teste Tukey (p<0,05) 3. Materiais e Métodos
  20. 20. Resultados e discussão 20
  21. 21. 4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e na produção de enzimas por P. ostreatus 20 a 35 °C nenhuma diferença foi observada no crescimento do fungo Fungo cresceu melhor entre 25 e 30 °C cultivos foram mantidos a 28 °C e no escuro 21
  22. 22. ● O desenvolvimento da biomassa fúngica foi fortemente afetada pela umidade do substrato. Analises visuais das culturas mostraram que o crescimento e desenvolvimento foram mais precoces quando Ui > 75% . ● Umidade adequada: Ui que permitiram completa colonização dos substratos até o 10º dia de cultivo, a 28 º C. 22 4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e na produção de enzimas por P. ostreatus
  23. 23. ● 75% < Ui < 80% da cultura O fungo cresceu de forma homogênea nas partículas do substrato sólido. ● Ui > 80% O crescimento deu-se pela formação de uma massa micelial espessa, acima do substrato. Tal massa micelial foi removida do substrato residual, permitindo a determinação da biomassa fúngica produzida. 23 4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e na produção de enzimas por P. ostreatus
  24. 24. A produção de diversas enzimas oxidativas e hidrolíticas por P. ostreatus foi determinada após 10 dias de cultivo em cinco umidades iniciais distintas. 24 4.1 - Efeito da umidade inicial no crescimento e na produção de enzimas por P. ostreatus
  25. 25. Figura 1 - Efeito da umidade inicial na produção de enzimas oxidativas por P. ostreatus cultivado em resíduo de laranja. Os cultivos foram desenvolvidos a 28 °C por 10 dias 56,0 ± 4,3 U.g -1 6,50 ± 0,43 U.g -1 25
  26. 26. Figura 4.2 - Efeito da umidade inicial na produção enzimas hidrolíticas por P. ostreatus cultivado em resíduo de laranja. Os cultivos foram desenvolvidos a 28 °C por 10 dias 26
  27. 27. 27 4.2 - Produção de biomassa e enzimas em cultivos com 85% de umidade inicial A característica de crescimento micelial superficial em substrato com umidade inicial de 85% possibilitou a separação da biomassa do resíduo de laranja remanescente. Valores de umidade superiores a 80%, o fungo se desenvolveu nas camadas mais superficiais do substrato. Desta forma, tal cultivo é mais propriamente considerado como cultura de superfície. A concentração de biomassa fúngica na superfície das culturas permitiu que as mesmas fossem separadas do substrato, e o crescimento pode ser avaliado pela determinação direta da biomassa fúngica produzida (Figura 4.3).
  28. 28. . 28 Figura 4.3 - Produção de enzimas e crescimento de P. ostreatus em cultivos utilizando resíduo de laranja com umidade inicial de 85%. 75 U.g -1 6,8 U.g -1 (?)
  29. 29. Máxima biomassa fúngica foi obtida após 20 dias de cultivo (90 ± 5,7 mg.g-1 de substrato seco), com um valor médio de 74 ± 5,6 mg.g-1 de substrato seco. O fungo utiliza os açúcares redutores como fonte de carbono nos primeiros 5 dias. Após este período, quantidade desses açúcares permanece constante (hidrólise dos polissacarídeos no resíduo). Máxima atividade de lacase (75 U.g-1 de substrato seco) foi obtida após 15 dias de cultivo, já o máximo de atividade Mn peroxidase (6,8 U.g-1 substrato seco) foi alcançado no 30º dia de cultivo. 29 4.2 - Produção de biomassa e enzimas em cultivos com 85% de umidade inicial
  30. 30. 30 4.2 - Produção de biomassa e enzimas em cultivos com 85% de umidade inicial A produção das enzimas xilanase e endoglucanase pelo fungo, foi maior no 5º dia de cultivo, 0,65 ± 0,07 e 0,43 ± 0,05 U.mg-1 de substrato, respectivamente. A produção de outras enzimas hidrolíticas, tais como: amilase e pectinase, foi baixa (valores inferiores a 0,2 U.g-1 de substrato seco). A redução na quantidade de carboidratos totais solúveis nos meios de cultura (Figura 3), sugere que a pectina esteja sendo degradada. Apesar dos resultados não mostrarem uma efetiva produção de pectinases.
  31. 31. 31 O meio à base de resíduo de laranja proporcionou a obtenção de elevadas atividades de enzimas com grande potencial de uso industrial, especialmente lacase e manganês peroxidase. 4.2 - Produção de biomassa e enzimas em cultivos com 85% de umidade inicial
  32. 32. 5. Considerações finais Os resíduos de laranja gerados pela indústria de sucos apresentam umidade superior a 80%; O uso de resíduo de laranja serviu como um substrato adequado para o cultivo de P. ostreatus e produção das enzimas lacase e Mn peroxidase; Altas atividades das enzimas foram produzidas em períodos relativamente curtos; Níveis mais altos da Mn peroxidase foram detectados nos cultivos mais longos. 32
  33. 33. 6. Etapas futuras Novos experimentos devem ser realizados para verificar se uma maior produção poderia ser obtida em cultivos com tempos de incubação superiores a 30 dias; O aproveitamento dos resíduos de laranja com umidade inicial alta e sem a necessidade de secagem prévia, reduziriam ainda mais os custos de produção destas importantes enzimas. 33
  34. 34. 7. Referências bibliográficas Aproveitamento do resíduo de laranja para a produção de enzimas lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr) Ana Maria ALEXANDRINO, Haroldo Garcia de FARIA, Cristina Giatti Marques de SOUZA, Rosane Marina PERALTA Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos Recebido para publicação em 1/8/2006  Aceito para publicação em 23/4/2007  Campinas, 27(2): 364-368, abr.-jun. 2007 34
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