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Documento completo de patente da substância sintética fosfoetanolamina Nº de patente PI 0800463 substância essa que causou grande polêmica no Brasil em 2016 porque foi autorizada pelo congresso sem comprovação científica de que seria eficaz contra o câncer. Para mais informações acesse: http://enderecodaciencia.blogspot.com.br/2016/04/fosfoetanolamina-e-revolta-do-placebo.html

Este documento foi estraído do prório site do INPI - Instituto Nacional de Propriedade Industrial através da LAI - Lei de Acesso à Informação (Lei Nº 12.527/2011)

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Patente da substância sintética fosfoetanolamina (PI 0800463)

  1. 1. Mm República Federativa do Brasil Mmnsiévlu ou Desenvolvimento_ irldúsirla a dc Gandra/ io Exlorlor Insiiiulc Nac/ anal di¡ Progxlaczido mdusulal, (RPI 2112) (21) PI0800463-3 A2 l (22) Data de Depósito: 28/02/2008 (43) Data da Publicação: 28/06/2011 ak | || l ll (51) Int. CI. : A61K 31/661 2006.01 A61K 31/13 2006.01 A61P 25/08 2006.01 A61P 35/00 2006.01 RP I Ill ó 2 Il ic B 08004 3A (54) Título: FOSFOETANOLAMINA COMO N PRECURSOR_DE FOSFOLIPIDEO PARA CORREÇAO DE DISFUNÇOES CELULARES E METABOLICAS (73) TituIar(es): Antônio José Reimer, Gilberto Orivaldo Chierice, Marcos Vinicius de Almeida, Renato Meneguelo, Salvador Claro Neto, Sand ra Vasconcellos AI-Asfour (72) Inventor(es): Antônio José Reimer, Gilberto Orivaldo Chierice, Marcos Vinicius de Almeida, Renato Meneguelo, Salvador Claro Neto, Sand ra Vasconcellos AI-Asfour íãsiieuas mas N? (57) Resumo: FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS. Que representa uma aplicação inovadora para um composto precursor de síntese de lipídeos, denominado fosfoetanolamina, o qual possui atividade de correção de disfunção celular e metabólica, incluindo atividades antiproliferatlvas, apoptóticas, neuroprotetora e antiepiléptica. : :um aims “ Wu 26 , m i Calcutá/ meiu [midi ; lmlommmiwwix M¡
  2. 2. i0 1/30 ' illillllililtiilitllliilgllilillliliillilill ç Pill f xe. -. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS CAMPO DE APLICAÇÃO Refere-se o presente relatório descritivo de Patente de Invenção a uma aplicação inovadora para um composto precursor de síntese de lipídeos, den_ominado fosfoetanolamina, o qual possui atividade de correção de disfunção celular e inclusas as atividades metabólica, sendo antiproliferativas, apoptóticas, neuroprotetora e antiepiléptica. A fosfoetanolamina (2-aminoetanol dihidrogenofosfato) é um componente metabólico precursor de fosfolipídio e sua molécula apresenta massa molar de 141,1 g/ mol, e é um fostomonoéster com a seguinte fórmula estrutural til Cd _, _' P _ _ H . N/ o/ (l)“Ol-l. SUMÁRIO DA INVENÇÃO Sabe-se que a fosfoetanolamina está presente na membrana plasmática de células animais, e que participa da síntese de fosfatidiletanolamina no retículo endoplasmático, além de participar em várias etapas do metabolismo celular, como o metabolismo mitocondrial, síntese de acetilcolina e síntese hormonal (Corazzi L, Porcellati G, Freydz L, Binaglia L, Roberti, R. Arienti, G. J. Neurochem. V. 46, p.202- 207, 1986); Maire JCE, Wurtman RJ. (Biol. Psychiatry. V. 8, p.637-642, 1984). L A aplicação do composto nas formas sólida e líquida, proposta na presente Patente, e constituída a partir de dois estudos, onde o primeiro teve o foco de provar a eficiência do composto como função antitumoral; ou seja, ação antiproliferativa, e estimulador de apoptose, tendo sido dividido os testes em aplicação in vitro e in vivo, onde a fosofoetanolamina foi aplicada em células tumorais cultivadas e células tumorais implantadas em camundongos BaIb-c, respectivamente. Nas duas primeiras etapas, o melanoma B16F10 foi usado como modelo biológico e a atividade citotóxica do composto foi testada em linhagens tumorais pelo método colorimétrico MTT, tendo sido determinada à concentração inibitória (lC50°/ o),
  3. 3. 10 15 20 30 2/30 tendo sido a sua toxicidade também testada em linfócitos T normais, em ensaios de proliferação celular, estimulados por mitógeno. No segundo experimento o composto foi aplicado in vivo em ratos wístar, frente a modelos de epilepsia induzida com PTZ, onde coletaram-se dados de incidência e intensidade de convulsão, bem como óbitos posteriores . a aplicação, e, em uma segunda fase, se aplicou o composto frente a controle de epilepsia em ratos naturalmente epilépticos, observando as ondas registradas em eletroencefalografia, antes e depois do tratamento. Os resultados do primeiro estudo do tratamento antitumoral com a fosfoetanolamina sintética "in vitro" mostraram que o composto induz citotoxicidade seletiva para as células tumorais com IC 50% de 1.69ug/ ml, sem afetar a capacidade proliferativa de células normais. Os animais portadores de tumores dorsais de melanoma B16F10 apresentaram significativa redução da carga tumoral, mostrando inibição da capacidade de crescimento e a metastatização, e a avaliação hematológica não demonstrou alterações relevantes após a administração de uma solução de fosfoetanolamina tamponada em pH=7,4 com monoetanolamina (fosfoetanolamina líquida), pela via intraperitoneal, nos animais portadores de melanoma, concluindo-se que a fosfoetanolamina líquida diminuiu significativamente o tamanho de tumores de forma seletiva, sem alterações em células normais, com vantagem em relação aos quimioterapicos comerciais, pois não apresentou os efeitos colaterias dos mesmos, ficando evidente neste estudo a capacidade inibitória da fosfoetanolamina sintética na inibição da progressão e disseminação das células tumorais. Os resultados dos estudos frente à epilepsia apontaram efeito na diminuição da intensidade das crises e de óbitos, frente ao modelo de indução de crises epiléticas por PTZ, e efeito anticonvulsivo frente ao modelo de ratos geneticamente epiléticos, indicando provável ação neurológica da fosfoetanolamina nos eventos biológicos observados. ANTECEDENTES DA TÉCNICA Em 1936 Outhouse isolou a fosfoetanolamina de tumores malignos bovinos, fornecendo a primeira existência deste composto livre na natureza, e, após este trabalho, outros pesquisadores Outhouse EL. (Biochem J. v. 30, p.197-201, 1936) encontraram a fosfoetanolamina em intestinos de ratos e em tecidos cerebrais de
  4. 4. 10 15 20 25 30 3/30 bovinos Awapara J. (Nature. v. 14, p.65-76, 1950); Folsch G, Osterberg R. (Biol Chem. v. 234 p.2298-303. 1959). Na década de 70, Cherbuliez e colaboradores sintetizaram, caracterizaram e analisaram o comportamento químico de muitos ésteres fosfóricos, publicando trabalhos sobre o tema. A síntese descrita por eles envolvia várias etapas, com formação de subprodutos e propiciava baixo rendimento E. CherbuIiez; H. Probs't ; .J. Rabinowitz, Helv. (Chim. Acta. v.41 p. 1693, 1958); E. CherbuIiez , (Helv. Chim. Acta, v. 42 , p.2277, 1959); E. CherbuIiez . ;G. Cordahi, ; J. Rabinowitz. (Helv. Chim. Acta, v. 42, p.591, 1959); E. CherbuIiez ; H. Probst, ; J. Rabinowitz, . (Helv. Chim. Acta. v. 43 p.465, 1960); E. CherbuIiez, (Helv. Chim. Acta, v.43, p.1841, 1960); E. Cherbu| iez, G. Cordahi, ;J. Rabínowitz, (Helv. Chim. Acta. v.43, p.863, 1960); E. CherbuIiez. (Helv. Chim. Acta, v. 43, p.1159, 1960); E. CherbuIiez, (Helv. Chim. Acta, v.44 p. 1813, 1961); E. CherbuIiez; F. Hunkeler, ; J. Rabinowitz, (Helv. Chim. Acta, v. 44 p. 1803, 1961); E. Cherbuliez; A.Yazgi, ; J. Rabinowitz, (Helv. Chim. Acta, v.44, p.1165, 1961); E. Cherbuliez. (Helv. Chim. Acta, v. 45, p.2653,1962); Cherbuliez (Helv. Chim. Acta. v.45. p.2283,1962); E. CherbuIiez (Helv. Chim. Acta, v. 45, p.2651,1962); E. CherbuIiez . (Helv. Chim. Acta, v.45 p. 2657, 1962); E. CherbuIiez . ( Helv. Chim. Acta, v. 45, p.1449, 1963). Muitas publicações mostram a relação da variação da concentração da fosfoetanolamina com doenças como Mal de Alzheimer, isquemia, Epilepsia e Câncer (ELLISON, D. W. ; BEAL, M. F. ; MARTIN, J. B. (Phosphoethanolamine and ethanolamine are decreased in Alzheimer's disease and Huntington's disease. Brain Res. v.417 p.389-392, 1987); FAINGOLD C. L. ; BOERSMA ANDERSON C. A. (loss of intensity-induce inhibition in inferior colliculus neurons leads to audiogenic seizure susceptibility in behaving geneticaIIy-prone rats, exp. Neurol, v.113, p.354-363, 1991); FAINGOLD, C. L. (Locomotor behaviors in generalized convulsions are hierarchically driven from specific brain-stem nuclei in the network subserving audiogenic seizures. Ann. N. Y. Acad. Sci. v.860, p. 566-569, 1998); FAINGOLD C. L. ; RANDALL M. E. (Neurons in the deep layers of superior colliculus play a critical role in the neuronal network for audiogenic seizures: mechanisms for production of wild running behaviour, brain res. v.815, p.250-258, 1999)). A utilização do medicamento à base do éster dihidrogenofosfato com cálcio foi proposto por Hans Nieper, em documentos de Patente requeridos na França e na
  5. 5. 10 15 25 30 4/30 Inglaterra, para tratamento em doenças auto-imunes, como antialergico e anti- inflamatório onde a ação proposta é a utilização desta molécula como um transportador de cálcio no tratamento destas doenças. Apesar da literatura relatar trabalhos que utilizam diferentes fosfolipideos em vários tratamentos de doenças relacionados com disfunções celulares e metabólicas, tais como câncer, doenças neurodegenerativas, autoimunes e inflamações, não se tem notícia da proposta de uso da fosfoetanolamina como um agente precursor destes fosfolipideos para ação em tais disfunções. Assim sendo, a proposta da presente Patente é a utilização da fosfoetanolamina, nas formas sólida e líquida, como precursor de fosfolipideos atuantes em disfunções celulares e metabólicas. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Como a fosfoetanolamina é um precursor de fosfatidiletanolamina, a proposta da presente Patente é a sua utilização nas formas sólida (com calcio, magnésio e zinco) e líquida (tamponada com monoetanolamina) em disfunções celulares e metabólicas. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Para um melhor entendimento da aplicação da FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÃO CELULAR E METABÓLICA. faz-se referência aos desenhos em anexo, nos quais: Figura 1 - Determinação da atividade citotóxica da fosfoetanolamina sintética em celulas de melanoma B16F10, avaliada pelo método colorimétrico MTT, as barras do histograma representam a porcentagem relativa em cada concentração de células viáveis e mortas; Figura 2 - Curva de regressão linear e concentração inibitória 50% (| C50°/ o) da atividade citotóxica da fosfoetanolamina liquida em células de melanoma B16F10, avaliada pelo método colorimétrico MTT; Figura 3 - Avaliação da resposta Iinfoproliferativa de linfócitos T normais, após 96 horas de cultura com fosfoetanolamina sintética e com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA), onde a porcentagem da capacidade proliferativa foi calculada comparando-se a resposta basal (ausência de mitógeno) e o controle na presença de PHA à 10% e 1% de soro fetal bovino (SFB);
  6. 6. 10 15 30 5/30 Figura - 4 Determinação da distribuição das populações de células tumorais dorsais de melanoma dos animais do grupo controle (A) e tratados com 6.6 mg de fosfoetanolamina sintética (B) nas diferentes fases do ciclo celular obtidos por citometria de fluxo; Figura 5 -Determinação da distribuição das populações de células tumorais dorsais de melanoma dos animais do grupo controle (A) e tratados com 1.65 mg de fosfoetanolamina liquida (B) nas diferentes fases do ciclo celular obtidos por citometria de fluxo; Figura 6 - Análise comparativa da distribuição das populações celulares nas fases do ciclo celular dos tumores tratados com 6.6 mg de fosfoetanolamina líquida (A) e tratados com o quimioterápico Taxol (B), obtidos por citometria de fluxo; Figura 7 - Análise comparativa da distribuição das populações celulares nas fases do ciclo celular dos tumores tratados com 1.65 mg de fosfoetanolamina líquida (A) e tratados com o quimioterápico Taxol (B), obtidos por citometria de fluxo; Figura 8 - Aspecto macroscópico dos tumores dorsais de melanoma do grupo tratado com 1.65mg de fosfoetanolamina liquida, após 20 dias, onde se observa massa tumoral não pigmentada. com raras áreas de irrigação (*) e formação de cápsula fibrótica (&); Figura 9 - Aspectos macroscópicos dos tumores dorsais de melanoma do grupo controle que recebeu solução salina, após 20 dias, onde se observa extensa massa tumoral nodular, com grandes áreas de irrigação (#), necrose (*) e ulceração (&); Figura 10 - Aspecto macroscópico dos tumores dorsais de melanoma do grupo tratado com 6.6mg de fosfoetanolamina liquida, após 20 dias, onde se observa pequena massa tumoral amorfa (&) ou pequenos pontos de aplicação no local da implantação das células tumorais (#), com ausência de irrigação vascular (* @); Figura 11 - Aspecto macroscópico dos tumores dorsais de melanoma do grupo tratado com o quimioterápico Taxol 3.7uM, após 20 dias, onde se observa volumosa massa pigmentada dorsal (&) com extensa área de irrigação, neoangiogênese (*) e metástases ganglionares satélites (# @); Figura 12 - Aspecto macroscópico das lesões metastãticas resentes nos parênquimas hepático (&) e pulmonar (*) do grupo controle e dos animais com o
  7. 7. _10 15 25 6/30 quimioterápico comercial Taxol 3.7 uM (#) após 20 dias, onde se observa acentuado grau de anemia dos animais do grupo controle em relação aos animais tratados; Figura 13 - Avaliação da área tumoral dorsal dos animais portadores de melanoma B16F10 durante o tratamento com fosfoetanolamina sintética nas concentrações de 9.9, 6.6 e 1.65 mg, durante 20 dias de tratamento, onde os animais tratados com fosfoetanolamina sintética apresentaram uma redução significativa na carga tumoral de 78%, 87% e 89%, nas respectivas doses 1.65, 6.6 e 9.9 mg. Figura 14 - Análise do número de metástases internas obtidas após a necropsia dos grupos de animais tratados com 9.9, 6.6 e 1.65mg de fosfoetanolamina líquida e grupo controle; Figura 15 - Avaliação do crescimento da massa tumoral dorsal do melanoma B16F10 combinados Taxol (Paclitaxel) nas concentrações de 3.75 e 7mg/ Kg e o Etoposideo implantado em camundongos e tratados com os quimioterápicos (Vipeside) nas concentrações de 2.5 e 5 mg/ Kg; Figura 16 - Aspectos histopatológicos dos tumores dorsais B16F10 do grupo controle, onde se observam células tumorais em divisão celular (A), pigmentos melânicos (B), vasos sanguíneos neoformados irregulares (C), células e debris celulares picnóticos (D) e áreas de hemorrágicas intratumorais (E); Figura 17 - Aspecto macroscópico de metástases pulmonar; Figura 18 - Aspectos histopatológicos das lesões metastãticas do parénquima hepático e pulmonar, onde se observa nódulo metastático hepático (A), vasos neoformados (B) e áreas hemorrágicas metastãticas do pulmão (C); Figura 19 - Aspectos histopatológicos dos tumores dorsais de melanoma tratados com 1.65 mg/ ml de fosfoetanolamina sintética, onde se observa extensa área de necrose intra-tumoral (A), infiltrado inflamatório intratumoral (B e C); Figura 20 - Aspecto histopatológico dos tumores dorsais corados pelo método citoquímico Picrosirius, evidenciando-se raras áreas com presença de fibras de colágeno deflagradas em vermelho ao redor dos vasos sanguíneos (A) e no interior do estroma tumoral (B), do grupo controle, que recebeu solução salina; Figura 21 - Aspectos histopatológicos dos tumores dorsais de melanoma tratados com 6.6mg/ ml de fosfoetanolamina liquida, onde se observa extensa área de necrose intra-tumoral (A), células apoptóticas (B) e vasos neoformados (C);
  8. 8. 10 15 20 25 30 7/30 Figura 22 - Aspecto histopatológico dos tumores dorsais corados pelo método citoquímico Picrosirius, evidenciando-se moderadas áreas com presença de fibras de colágeno (em vermelho) das lesões primárias, tratadas com 1.65mg/ ml de fosfoetanolamina sintética; Figura 23 - Aspecto histopatológico dos tumores dorsais _corados pelo método citoquímico Picrosirius, evidenciando-se extensas áreas com presença de' fibras de colágeno em vermelho das lesões primárias, tratadas com 6.6mg/ ml de fosfoetanolamina sintética; Figura 24 - Aspecto histopatológico dos tumores dorsais do grupo controle corados pelo método histoquimico de Verloff, onde se observam nas setas vasos sanguíneos neoformados irregulares e distribuidos no interior da massa tumoral; Figura 25 - Aspecto histopatológico dos tumores dorsais do grupo de animais tratados com fosfoetanolamina sintética 1.65mg/ ml (A) e 6.6mg/ ml, corados pelo método histoquimico de Verloff, onde se Observa nas setas pequena rede de vasos sanguíneos neoformados irregulares e distribuídos no interior da massa tumoral, os quais apresentam pequeno diâmetro; Figura 26 - Análise do número de glóbulos vermelhos dos animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina liquida; Figura 27 - Análise do hematócrito (Ht) dos animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina liquida; Figura 28 - Análise quantitativa da hemoglobina (Hb) dos animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina líquida; Figura 29 - Análise quantitativa do número de plaquetas dos animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina liquida; Figura 30 - Análise quantitativa do número de leucócitos dos animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina liquida; Figura 31 - Medianas e o intervalos interquartis (50% dos individuos) das intensidades das crises convulsivas dos respectivos grupos, onde o asterisco (*) indica que o resultado do grupo salina foi significativamente maior segundo o teste estatístico de Wald-Wolfowitz;
  9. 9. l0 15 20 25 30 8/30 Figura 32 - Média das latências das convulsões dos grupos e o respectivo erro padrão da média, onde o asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa, para a média do grupo CDZ comparado entre os outros grupos; Figura 33 - Tipo de ondas epiléticas encontradas nos animais antes dos respectivos tratamentos; Figura 34 - Eletroencefalografia obtida no animal número 2 antes do tratamento com FS, onde se nota a presença de vários disparos de crises epiléticas tanto no córtex frontal (linha de cima) como nos lóbulos laterais (linha de baixo); Figura 35 - Registro de disparo de crise epilética com detecção simultânea de movimentos clônicos; Figura 36 - Média de ocorrências antes e após o tratamento com FS, e os respectivos erros padrões das médias, onde o asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa para a média do grupo depois do tratamento com FS; Figura 37 - Duração, em segundos, das crises convulsivas detectadas antes e após tratamento com a FS, e seus respectivos erros padrões das médias, onde o asterisco (*) indica diferença estatisticamente significante na diminuição da duração das crises detectadas após o tratamento quando comparados com o mesmo grupo antes do tratamento da FS; Figura 38 - Registro de ocorrência de crise epilética do animal número 2, após tratamento com FS, onde se nota ainda a presença de disparos epiléticos no córtex frontal (linha superior) e lóbulos parietais (linha inferior), porém sem a detecção de crise motoras clônicas, como ocorridas antes do tratamento. FORMA DE PREPARAÇÃO PREFERIDA DA INVENÇÃO A linhagem tumoral de melanoma murino B16F10, cedida pelo Instituto de Pesquisa para o Câncer Ludwig, Genebra, Suíça. As células foram cultivadas em frascos de cultura de 75 cm* em meio de cultura (RPMI - 1640), suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado, 2 mM de L-glutamina e antibióticos. Antes das células atingirem confluência, foram subcultivadas para ampliação e congelamento (meio completo contendo 10% de dimetiI-sulfóxido), e mantidas em nitrogênio líquido. As suspensões celulares utilizadas para a implantação no flanco dorsal dos animais foram obtidas após o tratamento dos frascos de cultura com Tripsina 0,2% por 5 minutos e inativação com 10% de soro fetal bovino. As células desprendidas foram
  10. 10. 10 15 20 25 30 9/30 centrifugadas duas vezes, ressuspensas em meio de cultura e a concentração celular ajustada por contagem em câmera de Mallassez. A viabilidade celular das linhagens celulares tumorais e normais foram tratadas com as diferentes concentrações de fosfoetanolamina sintética e avaliadas MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5-diphenil tetrazolium bromide) (Mosmann T. Rapid colorimietric assay for cellular growth and pelo método colorimétrico do survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J lmmunol Methods. v.65, p.55-63, 1983). Este método é baseado na redução do MTT a Formazan pelas células vivas. A determinação da sensibilidade das diferentes doses foi otimizada de acordo com as normas estabelecidas pelo Instituto Nacional de Câncer, USA (NCI). Foi determinada a atividade citotóxica das suspensões das linhagens celulares e das células tumorais "in vivo", retiradas cirurgicamente e em condições estéreis, incubadas em placas de 96 orifícios. Foram adicionados 10 ml de MTT (5mg/ ml) às células, incubadas por 3 horas em estufa contendo 5% de CO2 a 37°C. Após este período, o meio foi removido e acrescentado 100 ml de dimetilsulfoxido (DMSO) para dissolver os cristais de Formazan formados e precipitados. A quantificação da absorbãncia foi feita em leitor de ELISA em comprimento de onda de 540 nm (TiterTek Multiskan) Curtin JA, Fridlyand . J, Kageshita T, et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. (N Engl J Med. v. 353, p. 2135- 47, 2005); Wilson AP. Cytotoxicity and Viability Assays in Animal Cell Culture: A Practical Approach, (Oxford University Press. p. 175 ~ 219, 2000) A citometria de fluxo aplicada no estudo do ciclo celular registra os parâmetros cinéticos da população celular, revelando o indice de DNA, aploidia, a fração de proliferação celular, e a porcentagem de células encontradas nas fases GO/ G1, S e G2/M, indicando parâmetros uni ou multivariáveis, prognósticos e possiveis rumos terapêuticos. A análise da porcentagem de células fornece o percentual de células que estão sintetizando DNA ("Iabeling index"), da duração da fase S (Ts) e do tempo de duplicação potencial (Tpot). Alíquotas das suspensões das células normais e tumorais tratadas e não tratadas, foram imediatamente congeladas em tampão citrato (2mM), sacarose 25 mM e 0.05% dimetil sulfóxido (DMSO), e mantidas em nitrogênio liquido até o momento de sua utilização. Após o descongelamento das amostras em banho de gelo, as células foram digeridas com 375 ml de tripsina 0,03 g/ l (Sigma) por 10
  11. 11. 10 i5 25 10/30 minutos à temperatura ambiente e neutralizada com o inibidor de tripsina 0,5 g/ I (Sigma), ribonuclease A 0,1 g/ I (Sigma) e espermina 1,2 g/ I (Sigma). As amostras foram transferidas para tubos de citometria de fluxo e a quantidade de células nas diferentes fases do ciclo, níveis de apoptose (Sub-G1) e conteúdo de DNA na fase S, foram obtidos pela análise em software Mod-fit. V As suspensões celulares (106/mI) normais dos tumores dorsais e ou metástases foram centrifugadas duas vezes a 3000 rpm com solução PBS e ressuspensas em 200 ml solução de iodeto de propidium (20 mg/ ml), contendo 20 ml Triton X-100 e 4 mg RNAse-A, por trinta minutos, à temperatura ambiente, protegidas da luz. Após este período as amostras foram transferidas para tubos de citometria, e as imagens adquiridas foram capturadas em citômetro de Fluxo (Scalibur-Becton e DicKson) e analizadas em software Cell-Quest. As fases do ciclo celular pré e pós- mitóticas (GO-G1, fase S e G2-M) foram analisadas em software Modi-fit FORMA PREFERIDA DE APLICAÇÃO DA INVENÇÃO Os camundongos foram injetados subcutaneamente no dorso com 5x104 células tumorais de melanoma murino B16F10. Após o décimo quarto dia do implante tumoral, os tumores dorsais foram medidos com o auxilio de um paquimetro. Os tumores em média apresentaram diâmetro médio de 0,5 cmz, foi iniciado o tratamento com a fosfoetanolamina sintética nas diferentes concentrações descritas anteriormente, injetados pela via intraperitoneal. Como grupo controle os animais receberam solução salina pelas mesmas vias de tratamento. Após o 20° dia do tratamento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, e em seguida, realizados a necropsia, os tumores dorsais analisados, lesões internas macroscópicas identificadas, medidas e fotodocumentadas. Amostras dos tumores dos diferentes grupos de tratamento e grupo controle, não tratado, foram processadas para as das análises do conteúdo de DNA, ciclo celular e anatomopatológico. Utilizou-se 40 camundongos da linhagem Balb c, fêmeas e machos, com aproximadamente 25g, idade aproximada de 6 a 8 semanas, dieta e água “ad libitum", dos quais serão divididos em 4 grupos distintos a seguir: Os grupos experimentais foram compostos por: Grupo A - 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 células tumorais pela via subcutânea, após o 14° dia do implante os animais foram tratados com
  12. 12. 10 t5 20 11/30 fosfoetanolamina sintética pela via intraperitoneal com a concentração de 0,033g/ ml em 100u| ; Grupo B - 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 células tumorais pela via subcutânea, após o 14° dia do implante os animais foram tratados com fosfoetanolamina liquida pela via intraperitoneal com a concentração de 0,066g/ mI em 200u| ; A ' A Grupo C - 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 células tumorais pela via subcutânea, após o 14° dia do implante os animais foram tratados com fosfoetanolamina sintética pela via intraperitoneal com a concentração de 0,099g/ ml em 300uI; Grupo D - 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 células tumorais pela via intraperitoneal, após o 14° dia do implante os animais foram tratados com solução salina pela via intraperitoneal. Após a injeção de células B16F10, o crescimento tumoral foi medido e fotodocumentado, diariamente com o auxílio de um paquimetro para medições longitudinais e transversais do tumor (duas medidas). Foram calculados a área e o volume médio do tumor, através das seguintes fórmulas: A= nF e V=4nP 3 onde: r= Rmo A= Áma V= Vdume Os animais foram sacrificados a cada etapa de tratamento, necropsiados e os nódulos tumorais macroscópicos presentes nos órgãos internos foram contados e medidos. A contagem e quantificação dos glóbulos vermelhos, hemoglobina, hematócrito, leucócitos e plaquetas, apresentou os seguintes resultados: Glóbulos Vermelhos: alíquotas de 10u| do sangue de cada grupo experimental e controle foram diluídas 121000 em solução salina 0,9% e 0,01% paraformaldeido para a análise do número total de glóbulos vermelhos. A contagem foi realizada em câmera de Malassez, e o número de células será expresso em 109 / mI.
  13. 13. U¡ IO 15 20 12/30 Hematócrito: a determinação do hematócrito (Ht) foi realizada pela coleta do sangue em microcapilar de 10u| heparínizado selado em uma das extremidades com fogo no bico de Bunsen. O capilar foi colocado em microcentrifuga com a extremidade fechada voltada para o circulo externo e centrifugada a 11.000 rpm durante 5 minutos. Os resultados foram expressos após a análise comparativa da relação do sedimento rico em glóbulos vermelhos e o plasma, em tabela de referência padrão. Hemoglobina: a determinação do teor de hemoglobina foi coletada 200ul de sangue do plexo venoso retro orbital em tubos microcapilares contendo como anticoagulante o EDTA. Utilizando-se o método da cianometa-hemoglobina, com leitura em espectrofotômetro 540nm, foram analisadas as concentrações de hemoglobina. Plaquetas: a contagem de plaquetas foi realizada em câmara de Neubauer, utilizando como diluente a solução de oxalato de amônio a 1% (líquido de Brecker). Também foram realizados esfregaços sanguíneos, dos diferentes grupos de animais tratados e grupo controle para a avaliação da morfologia e do diâmetro plaquetãrio medio. Foram também avaliados aspectos citológicos, como a presença de macro ou micro plaquetas, que são mais funcionais que as plaquetas normais e indicam regeneração da medula óssea e a presença de agregados plaquetários indicativos de alterações tóxicas promovidas pelos compostos como também alguma alteração morfológica celular. Leucócitos: uma alíquota de 10u| do sangue de cada grupo experimental e controle foram diluídos em 90pI de solução de Turk (azul de metileno 0,5°/ o em 30% de ácido acético glacial) para a análise do número total de glóbulos brancos. A contagem foi realizada em câmera de Malassez, e o número de células foi expresso em 106/ml. O sangue total dos camundongos portadores de melanoma B16F10 tratados com FOS liquida durante 20 dias e grupo controle que recebeu solução salina, foram coletados pela punção do plexo venoso retro-orbital com o auxilio de um microcapilar de 10ul heparínizado. Parte desse material fo¡ utilizado para a confecção do esfregaço sanguíneo. FORMA DE EXECUÇÃO PREFERIDA DA INVENÇÃO A análise dos números globais de glóbulos vermelhos e leucócitos constitui em um importante exame de auxilio diagnóstico para doenças hematológicas, sistêmicas e ações farmacológicas ou terapêuticas. Rotineiramente indicado para avaliação de
  14. 14. 10 15 25 30 13/30 anemias, neoplasias sistêmicas, reações infecciosas e inflamatórias, acompanhamento de terapias medicamentosas e avaliação de distúrbios plaquetários. Fornecem dados para classificação das anemias de acordo com alterações na forma, tamanho, cor e estrutura das hemácias e conseqüente direcionamento diagnóstico e terapêutico, orienta na diferenciação entre infecções viróticas e bacterianas, parasitoses, inflamações, intoxicações, interações medicamentosas e neoplasias através das contagens globais e diferenciação de leucócitos e avaliação morfológica dos mesmos. As lâminas para as análises diferenciais dos leucócitos foram fixadas em metanol puro por cinco minutos, em seguida coradas em solução de Giemsa por quinze minutos, lavadas em água corrente e secas à temperatura ambiente. Após a secagem das lâminas foi realizada a contagem diferencial de glóbulos brancos em microscopia óptica com aumento de 1000x em óleo de imersão. Foram retirados pequenos fragmentos de aproximadamente O.2cm2 dos órgãos (coração, pulmão, fígado, baço, pâncreas e rins), dos animais tratados e controles, pesados e fixados por 24 horas em tampão formalina, tamponado com pH=7,4, para a realização de análises histopatológicas, também como de seus tumores e metástases, para serem corados de diversas maneiras possibilitando uma melhor visualização das manifestações ocorridas no microambiente celular, como diferenciação celular, neoformação vascular, apoptose, necrose, regeneração tecidual, hemorragias entre outros. Após periodo de fixação de 24 horas, utilizando-se lâmina histológica sobre tábua de macroscopia foram retiradas duas amostras retangulares. Todas as amostras foram acondicionadas em cápsula histológica e colocadas no autotécnico (Leica® modelo RM 2145) para processamento "overnight", sendo desidratadas em concentrações crescentes de álcool etílico a 70, 80 e 90%. Posteriormente, foram diafanizadas em xilol contendo misturas seqüencialmente concentradas de parafina durante 12 horas. Realizada inclusão em parafina quente (Leica® modelo EG 1160), os blocos foram microtomizados (Leica® modelo RM 2145) em cortes de Sum e dispostos em lâmina de vidro de 75 x 25 mm, realizando-se dois níveis de corte para cada área de estudo e a seguir as lâminas foram corados pelos métodos citoquímicos de Picrosirius red, para fibras de colágeno e Van Gienson -Verloff para as fibras elásticas e vasos. Os cortes histológicos (3um)
  15. 15. 10 15 20 25 14/30 dos tumores dos grupos tratados com fosfoetanolamina líquida e controles que receberam solução salina foram fixados em tampão contendo 3% paraformaldeido, 0,2% de glutaraldeído e 0,1% triton X-100 em tampão fosfato de sódio pH = 7,4. O colágeno, por ser uma proteina básica, provavelmente interage com os grupos sulfônicos do corante Vermelho Sírio a 0,1°/ o, e em pH baixo, com os grupos amino da lisina e da hidroxilisina e os grupos guanidina da arginina. A coloração pelo método do Picrosirius faz com que grande quantidade de moléculas do Sirius Red, de caráter ácido e alongado, disponha-se paralelamente às moléculas do colágeno, o que provoca aumento considerável da birrefringência das fibras que contêm colágeno quando observadas à luz polarizada. Assim, o método da coloração com Picrosirius associado à microscopia de polarização é um método histoquimico específico para detecção de estruturas compostas de moléculas de colágeno orientadas (Marks R. Epidemiology of melanoma. Clin Exp Dermatol. v. 25, p. 459-63, 2000); (McGill GG, Horstmann M, Widlund HR, et al. Bcl2 regulation by the melanocyte master regulator Mitf modulates lineage survival and melanoma cell viability. Cell. v.109, p.707-18, 2002); (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. v.100, p.57-70, 2000); (Howard A, Pelc SR. Synthesis of deoxyribonucleic acid in normal and irradiated cells and its relation to chromosome breakage. Heredity. v.6, p.261-273, 1953)', (Molinari M. Cell cycle checkpoints and their inactivation in human cancer. Cell Proliferation. v. 33, p.261-274, 2000). Nos experimentos da FOS frente a epilepsia, foram ratos Wistar machos (sadios e geneticamente epilépticos) com 60 dias de idade provenientes do biotério central da UNESP de Botucatu. Estes foram tratados com ração da marca Labina e água potável ad libitum. Todos os animais foram mantidos em ambiente controlado de luz (12 horas/ dia) e temperatura 20° C - 24° C. Todos os animais foram separados aleatoriamente (cinco animais por caixa e três caixas por grupo) em caixas de propil-propileno (40x32x16 cm) para adaptação. Todos os procedimentos de utilização de animais no presente trabalho foram realizados de acordo com as normas de ética divulgadas pelo COBEA (Colégio Brasileiro Experimental). Todos os individuos foram marcados de 1 a 5 na cauda com tinta, a fim de destacar os grupos e indivíduos dentro de cada caixa do grupo. Todos os animais foram pesados diariamente com balança comum e calculado o volume de cada
  16. 16. 10 15 25 30 15/30 composto a ser administrado por individuo. Todas as soluções foram administradas no periodo da manhã. O tratamento crônico foi estabelecido durante trinta dias consecutivos. Foram utilizados neste experimento, para a detecção e qualificação dos comportamentos dos indivíduos, os seguintes materiais: - Câmera filmadora digital todas as ocorrências' de para gravação de comportamentos; - Programa de avaliação e quantificação de comportamentos Etholog (OTTONl, E. B. ; EthoLog 2.2 - a tool for the transcription and timing of behavior observation sessions. Behavior Research Methods, Instruments, 8. Computers. v. 32(3), p. 446- 449, 2000), programa especifico que quantifica os eventos de comportamentos apresentados pelos animais durante análise neuroetológica. Foram utilizadas no tratamento as seguintes soluções químicas: - Fosfoetanolamina sintética na forma sólida com Cálcio, Magnésio e Zinco. - Clordiazepóxido manipulado por farmácia de manipulação e emulsionado em solução salina a 0,9% apenas durante o processo de administração da droga. - Pentilenotretrazol do fabricante laboratório Sigma-Aldrich, este foi pesado em balança analítica METTLER, modelo AE-240 com precisão de décimo de mg, e solubilizado em solução salina a 0,9 % de concentração apenas na hora da administração do composto. - Solução salina (NaCl) confeccionada com água bidestilada e esterilizada em 0,9 % de concentração. Os animais foram submetidos aos tratamentos com as seguintes doses das soluções químicas: O grupo testado fosfoetanolamina recebeu uma dose de 22g/ kg corporal de fosfoetanolamina sintética sólida com Cálcio, Magnésio e Zinco como agentes alcalinizantes. Este composto foi emulsificado em solução salina a 0,9% de concentração e foi administrado por gavagem num volume de 10ml/ Kg corporal. O Grupo controle com anti-convulsivante conhecido, clordiazepóxido (CDZ) recebeu uma dose de 10mg/ Kg corporal de clordiazepóxido em solução salina a 0,9°/ o, em um volume de administração de “IO ml/ Kg corporal administrado por gavagem.
  17. 17. 10 l L 16/30 O Grupo controle salina (SAL) recebeu solução salina a 0,9% de concentração num volume de 10 mI/ Kg corporal administrado por gavagem. No trigésimo dia de tratamento e após a administração de todas as soluções os animais tiveram sua ração suspensa. Depois de transcorridas duas horas do inicio da administração das soluções, houve o inicio da administração do pentilenotetrazol o qual foi administrado por via intraperitonial (IP) na dose de 60 mg/ Kg corporal e num volume de 6 ml/ Kg corporal em solução salina a 0,9% (NODA, K. ; TAKAHASHI, K. ; HIBINO, H. pentylenetetrazol for inducing seizure Yakubutsu Seishin Kodo. Sep; v.8(3), p.417- 20, 1988). Para avaliação das crises convulsivas foi adotada uma escala de valores de acordo Influence of phosphatidylcholine on the threshold dose of com os níveis de convulsão observada nos animais, denominada escala de RACINE, que escala consiste em abrangências de áreas corporais envolvidas em cada estagio de convulsão (RACINE, R. J. Modifications of seizure activity by electrical stimulation: ii, motor seizure. Electroencephal. Clin. Neurophysiol. v. 32, p. 281- 294, 1972) e ( BECKER, A. ; GRECKSCH, G. ; RÚTHRICH, H. L. ; POHLE, W. ; MARX, B. ; MATHIES, H. Kindling and its consequences on learning in the rats. Behavioral and Neural Biology, v. 57, p. 37 -43, 1992). Tabela 1 - Escala de níveis de convulsão proposta por (RACINE, 1972) Estágio Descrição O Sem resposta aparente 1 Movimentos súbito das orelhas e da face _I _ Movimentos mioclônicos sem verticalização corporal 3 Movimentos mioclônicos em posição vertical, com tônus bilateral dos membros anteriores 4 Convulsão tônico-clônica Convulsão tônico-clônica generalizada, com perda do controle postu ral
  18. 18. 10 15 20 30 17/30 Para cada seção de aplicação de PTZ foram selecionados três animais, que, após receberem a droga ficaram isolados em gaiolas individuais de ferro. Todo processo foi cronometrado e todas as respostas produzidas pelos animais foram anotadas em formulário pré-elaborado. O tempo total de cada seção de observação foi de 40 minutos. Todos os animais tiveram acompanhamento de até 24 horas após a administração do PTZ para verificação de possiveis' ocorrências de óbitos. Na segunda etapa do experimento foram utilizados, para o implante e cirurgia, os seguintes materiais: - Plugs de conexões torneadas adaptados ao implante intracraniano, estes plugs foram cortados e soldados aos fios níquel cromo de espessura 0,03 mm, previamente raspados para retirada do esmalte isolante. Durante o procedimento de soldagem não se utilizou ácidos pra remoção de óxidos nas partes a serem soldadas. Utilizou-se deste artifício, a fim de evitar ruídos provocados pela interferência deste processo na posterior leitura do EEG. - Cabo de cobre 0,06 mm com plugs tipo "bananas" conectados em uma das pontas, e plug torneado tipo macho na outra ponta e este lado foi conectado ao implante existente na cabeça do animal. Na outra extremidade os plugs "bananas" foram conectados a caixa de eletrodos e esta ao eletroencefalogramo. - Retifica de alta rotação (1800 RPM), com broca de ponta de desbaste diamantada, na confecção dos furos da trepanação do crânio do rato, nestes locais foram conectados parafusos de aço inoxidável número 103. - Resina polimérica moldável foi utilizada no isolamento das conexões de soldas existentes nos plugs e no auxílio de fixação e isolamento elétrico do plug implantado na cabeça do rato. - Cronômetro Citizen utilizado para demarcar com segurança o início e o final da sedação de cada animal em processo cirúrgico. - Anestésico geral a base de Ketamina da marca Dopalem, como anestésico de ação central. - Anestésico local Xylestesin (Cloridrato de lidocaina com epinefrina 1:200.000 a 2% da marca Cristália) em solução injetável na sedação e inibição de sangramento excessivo. - Relaxante muscular Rumpum com Xilazina 5% da marca Veterinária, administrado intramuscularmente para evitar espasmos musculares súbitos.
  19. 19. Un 10 15 20 25 18/30 - Água oxigenada 10 vol. no auxílio da remoção de residuos de tecidos moles e sangue no processo de díafanização das camadas teciduais. - Gases e algodão hidrofóbico, esterilizados e próprios para procedimentos cirúrgicos no estancamento do sangue. - Pinça dente de rato, pinça de relojoeiro, tesou_ra cirúrgica, bisturi lamina número 10, seringa carpodérmica, seringas descartáveis de 1 mL e 5 mL. - Cabine de tela metálica (Gaiola de Faraday) contra energia estática, no interior desta foi colocada uma caixa de madeira de dimensões 20 x 15 x 15 cm, com um furo na tampa, para permitir a passagem dos cabos que interligaram o plug implantado a caixa de eletrodos. - Caixa de eletrodos para amplificação e interpolação de sinais provenientes do implante, esta caixa ficou conectada por um cabo próprio ao EEG. - Eletroencefalografia, foi realizada em um polígrafo da marca Bergh modelo TW102 nas seguintes condições de calibração: 'constante de tempo 0,03, filtragem de 35 Hz e 200 pv e velocidade do papel de 5 cm por segundo. Os tratamentos utilizaram solução de fosfoetanolamina com agentes alcalinizantes cálcio, zinco e magnésio, emulsionado em solução salina a 0,9% para tratamento. SeIecionou-se 24 ratos Wistar machos e adultos. Estes animais foram criados em cabine acústica com acionamento de sirene a 130 decibéis com freqüência de 22.000Hz, onde, apenas os animais que apresentaram crise audiogénica indicativo (FAINGOLD, C. L. Locomotor convulsions are hierarchically driven from specific brain-stem nuclei in the network subserving audiogenic seizures. Ann. N. Y. Acad. Sci. v.860, p. 566 - 569, 1998); (BROWING, R. A.; Anatomy of generalized convulsive seizures, in: A. malafosse, E. de quadro epilético behaviors in generalized Hirsch, C. Marescaux, D. Broglin, R. Bernasconi (Eds. ), ldiophatic Generalized Epilepsies: clinical, Experimental and Genetic aspect, john Libbey & Co. , p. 399 - 411, London, 1994.); (BROWING, R. A, WANG, C. , NELSON, D. K., JOBE, P. C.; Effect of precolicular transactíon on audiogenic seizures in genetically epilepsy-prone rats, Exp. Neurol. v. 155, p. 295 - 301, 1999) foram utilizados. Estes animais foram separados em numero de 12 indivíduos denominado Grupo 1 e foram tratados com fosfoetanolamina. Após tratamento estes foram submetidos à cirurgia de implante de plug intra-cortical com auxílio de aparelho
  20. 20. 10 15 20 19/30 estereotáxico, segundo a orientação do mapa estereotáxico de PAXINOS e WATSON, (PAXINOS G. , WATSON, The rat Brain in Stereotaxic Coordinate, Academic Press, Sydney, 1986). Os animais foram sedados com anestesia geral, kentamina na dose de 1,2 ml/ kg/ i.p. , e, para evitar espasmos nervosos involuntários adversos, os animais foram localmente sedados com relaxante muscular de ação central Xilasina, na dose de 1ml/ Kg/ i.m. Posteriormente, verificada a sedação total do animal através de pinçamento da pálpebra, fixou-se o crânio do mesmo no aparelho estereotáxico. Efetuou-se uma aplicação de anestésico local e de agente vasoconstritor (Epinefrina Pilocarpína, 2%) em solução salina 0,9%, para evitar sangramento excessivo e prejudicar a visualização do campo cirúrgico. Retirou-se, com auxílio de uma tesoura cirúrgica, os pelos do crânio. A porção de tecido muscular e epitelial do mesmo foi diafanizada com auxílio de bisturi e lâmina número 10. Realizou-se uma raspagem do crânio a fim de remover todo tecido mole no campo cirúrgico. Acrescentou-se água oxigenada 10 volumes durante o inicio do procedimento cirúrgico, a fim de remover todo resíduo de tecido mole ainda aderido ao tecido ósseo. Para a colocação dos animais no aparelho esterotáxico, segundo Paxinos e Watson, 1986, posicionou-se a barra incisória na medida 3,3 mm abaixo do zero horizontal, os dentes incisivos dos ratos foram presos no aparelho, fixou-se as barras horizontais do aparelho nos meatos auditivos e a linha média cranial foi alinhada centralmente, e, depois deste processo, marcou-se nas escalas das barras do aparelho estereotáxico os pontos de perfusão craniana a serem realizados. Foram marcados com tinta azul: um ponto de cada lado da sutura sagital do crânio a 1 mm (LE) (látero lateral esquerdo) e 1mm (LD) (látero lateral direito), um outro ponto a 1 mm (PB) da sutura bregma (posterior bregma), e um ponto a 1 mm da sutura lambidóide (posterior anterior). Nos locais sinalizados, com auxílio de uma broca diamantada e retifica de alta rotação (1800 rpm), foram realizados furos no crânio. Nestes, foram fixados parafusos de aço inoxidável até a confirmação do contato direto do córtex do animal. Nestes parafusos foram conectados fios esmaltados previamente raspados conectados ao plug torneado. Para evitar rompimento, isolou-se e fixou-se o plug à calota craniana com resina acrílica moldável. Realizaram-se pontos falsos com linha
  21. 21. Ui 10 15 20/30 de algodão esterilizada na pele do crânio para finalizar a cirurgia. Durante as horas seguintes o animal ficou sob observação até o seu despertar total e a verificação de possiveis acometimentos anormais no seu comportamento. Nos experimentos com uso da FOS frente o câncer, após 24 horas de cultura, fase de crescimento exponencial das células de melanoma B16F10 foram plaqueadas em microplacas de 96 orifícios e adicionadas às diferentes concentrações do composto diluído em meio de cultura. O tratamento com a fosfetanolamina sintética, em culturas celulares de melanoma murino B16F10, mostrou efeito adverso sobre a toxicidade deste composto, tempo e dose dependentes, conforme ilustra a Figura 1. A viabilidade celular após 24 horas de tratamento nas concentrações de 6 mg a 0.005 mg da fosfoetanolamina líquida mostrou que este composto apresenta alta citotoxicidade em células tumorais somente nas altas concentrações analisadas (6 a 1,5 mg/ ml), porém nas outras concentrações testadas não foram observados efeitos deletérios significantes (menor 0.75 mg/ ml). Nessas condições foi determinada a concentração inibitória 50% a partir da curva de regressão linear, nosso resultado para as células de melanoma foi de 2.3 mg/ ml, conforme ilustrado na Figura 2. A fosfoetanolamina líquida não inibe a resposta proliferativa inespecifica de linfócitos T normais mantidos em cultura por 96 horas e ativados pelo mitógeno PHA (fitohemaglutinina), conforme ilustra a Figura 3. Os animais portadores de melanoma B16F10 tratados durante 20 dias consecutivos com fosfoetanolamina líquida, apresentaram aumento significativo na taxa de sobrevida nas concentrações variando de 9.9 mg até 1.65 mg em comparação ao grupo controle. Após a necropsia destes grupos de animais portadores de tumor dorsal ou metástases pulmonares e do grupo controle que recebeu solução salina, foram avaliadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo e determinadas a porcentagem das células nas seguintes fases: sub G1 ou apoptóticas que apresentam DNA fragmentado, G0/G1 células quiescentes, Fase S em síntese de DNA e G2/M em mitose. Nossos resultados mostraram que as células tumorais B16F10 obtidas do tumor dorsal do grupo controle apresentam 69% i 3.4 em apoptose (sub-G1), 25.6% i' 4.8 células quiescente (G0/G1) e em grande proporção com capacidade proliferativa 51.3% i 3.0 na fase (G2/M). Os animais tratados com 9.9 mg apresentaram significante aumento na taxa de mortalidade e seus tumores
  22. 22. 10 15 20 25 30 21/30 significativas areas de necrose. Os tumores dos animais tratados com a concentração de 6.6 mg apresentaram aumento extremamente significante na proporção de células em apoptose, sub G1 (12.8% 4_- 4.4) em comparação ao grupo controle não tratado. Também foram observadas diminuições significantes (p<0.001) na porcentagem de células em GO/ Gi (2.90 % i 0.9), e células com capacidade de síntese de DNA, fase S (1,49% i 0.28) induzida pela fosfoetanolamina sintética em comparação ao grupo controle (23.1% : r 4.6). A proporção de células com capacidade proliferativa (G2/M) teve valor significativamente menor (P<0.001) nas células tumorais tratadas com 6.6 mg de fosfoetanolamina líquida (2.1% 1 0.89) em relação ao grupo controle (51 .4% i 3.0), conforme dados apresentados na figura 4. Os tumores do grupo de animais tratados com a concentração de 1.65 mg apresentaram aumento significante na proporção de células em apoptose (175% 1 3.4). Quando comparadas às concentrações de 6.6 e 1.65 mg de fosfoetanolamina líquida os 2.3) em comparação ao grupo controle não tratado (6.8% i níveis de apoptose não tiveram diferenças significantes. As proporções de células quiescentes diminuíram significantemente (p=0.0015) no grupo de células tratadas com fosfoetanolamina líquida (12.7 % i 4.06) em relação ao controle (25.6% i 4.8). A capacidade de síntese (fase S) diminuiu significativamente (P<0.001) no grupo tratado com fosfoetanolamina liquida (4.9% i 1.2), em relação ao grupo controle (23.01% i- significativamente (p<0.001) no grupo de tumores tratados com 1.65 mg de 4.6). As células com capacidade proliferativa (G2/M) diminuíram fosfoetanolamina líquida (119% t 2.2) em relação ao grupo controle (51.4% i 3.0), conforme dados apresentados na figura 5. Análises comparativas entre os tratamentos com a fosfoetanolamina líquida nas concentrações de 6.6 e 1.65 mg com o quimioterápico Taxol na concentração de 3.7uM, específico de última geração responsável pela inibição de proteínas envolvidas na dimerização de microtúbulos durante a divisão celular, nas fases G2/M, mostraram que em todas as fases do ciclo a fosfoetanolamina líquida na concentração de 6.6 mg diminui significativamente a capacidade de proliferação celular e é um indutor importante de células em apoptose com a mesma eficácia terapêutica, porém sem apresentar catastróficos efeitos colaterais. Na concentração de 1.65 mg de fosfoetanolamina líquida a eficácia de inibição das fases quiescentes,
  23. 23. 10 '15 22/30 S e proliferativa G2/M mostrou-se dependente da dose administrada no tratamento. Os dados e as análises estatísticas estão apresentados nas figuras 6 e 7. Tabela 2 - Análises das fases do ciclo celular obtidas por citometria de fluxo das células de melanoma B16F10 dos grupos: controle, tratados com 6.6 e 1.65 mg/ mL de fosfoetanolamina liquida e com o quimioterápico Taxol. Linhagem B16F10/ G0/G1 ' (%) Tratamento 25.6 t 4.8 23.1 i 4.6 Controle Fosofoetanolamina 12.8 i 4.4 2.9 i 0.9 1.49 i 0.28 2.1 i 0.89 6.6 mg/ mL (0.0468uM) Fosofoetanolamina 17.5 1- 2.3 12.7 t 4.1 11.9 i 2.2 1.65 mg/ mL (0.0117uM) Taxol (3.75 UM) 2.6 i 1.6 0.61 i' 0.43 1.38 i 0.7 Valores expressos em média (x) e desvio padrão (i d. p.) Após o 14° dia da implantação de 5x104 células tumorais na região dorsal, 100% dos animais apresentavam tumores dorsais próximos aos locais de inoculação apresentando em média volume de 0.10 i 0.05cm3. Os animais de todos os grupos de experimentação tratados e controle foram pesados e realizados a medição (comprimento x largura), dos tumores diariamente com o auxilio do paquimetro, e fotodocumentadas. Os animais foram observados diariamente e após 20 dias de tratamento com fosfoetalonamina sintética administrada pela via intraperitoneal, com as seguintes concentrações (9.9, 6.6 e 1.65 mg), foram sacrificados por deslocamento cervical, necropsiados e os tumores dorsais e as metástases presentes nos órgãos internos, (coração, pulmão, fígado, rins, baço), pesados e fixados por 24 horas em tampão formalina, tamponado com o pH 7,4 para a realização de análises histopatológicas. Macroscopicamente os tumores dos animais tratados com 1.65 mg de FOS liquida apresentavam-se como massas nodulares dorsais não pigmentadas, não ulceradas e com raras áreas de irrigação ou neoangiogênese, também foi observada a formação de tecido encapsulado característico de fibrose, a massa não se apresentava aderida a superficie interna do animal, características de tumores benignos. Por outro lado, o grupo controle
  24. 24. 10 15 20 30 23/30 apresentava tumores dorsais pigmentados e necrose, com extensas áreas de ulceração, extremamente irrigada e ocupando um volume expressivo em relação à superficie corpórea total do animal, conforme ilustram as Figuras 8 e 9. Os tumores melanoma B16F10 dos animais tratados com 6.6 mg de fosfoetalonamina líquida apresentaram pequenas massas tumorais amorfas ou um pequeno ponto de aplicação na área onde foi inoculado ás células, ausência de metástases internas, ausência de neoangiogênese. Não foi observada perda de peso significativo ou alterações comportamentais importantes pela utilização do composto, conforme ilustra a Figura - 10. A Figura 11 ilustra o aspecto macroscópico dos tumores dorsais de melanoma do grupo tratado com o quimioterápico Taxol 3.7uM, após 20 dias, onde se observa volumosa massa pigmentada dorsal (&) com extensa área de irrigação, neoangiogênese (*) e metástases ganglionares satélites (# @), enquanto que a Figura 12 ilustra o aspecto macroscópico das lesões metastãticas resentes nos parênquimas hepático (&) e pulmonar (*) do grupo controle e dos animais com o quimioterápico comercial Taxol 3.7 uM (#) após 20 dias, onde se observa acentuado grau de anemia dos animais do grupo controle em relação aos animais tratados. A curva de crescimento tumoral foi avaliada pela medição dos seguintes parâmetros tumorais: incidência, taxa de sobrevida, área tumoral e número de metástases internas. Os animais portadores de melanoma B16F10 e tratados com a concentração de 9.9mg apresentaram redução significativa da massa tumoral de 89% em comparação ao grupo controle não tratado. Este grupo de animais apresentou pequenas massas tumorais, porém a taxa de mortalidade no curso do tratamento foi grande, possivelmente pela interação do composto com o microambiente tumoral, o que levaria possivelmente a liberação de substâncias ou produtos da degradação celular com potencial citotóxico ("horror” citotóxico), enquanto que nas concentrações de 6.6 e 1.65 mg de fosfoetanolamina sintética observou-se uma redução significativa da massa tumoral, conforme ilsutra a Figura 13, sem a ocorrência de mortalidade, como também não foram observados efeitos colaterias, como caquexia ou modificações comportamentais. Após a dissecação cirúrgica verificamos que o tumor implantado Iocalizava-se no tecido subcutãneo, apresentando coloração enegrecida decorrente da produção excessiva de liberação para o meio de melanina pelas células tumorais, em diferentes proporções e também
  25. 25. 10 15 20 30 24/30 nos diferentes grupos de tratamento com a fosfoetanolamina sintética. A necropsia revelou que os animais tratados com fosfoetanolamina sintética apresentaram redução altamente significativa (p<0.001) da formação de metástases internas. Os animais que foram tratados com fosfoetanolamina sintética na concentração de 6.6mg apresentam tumores dorsais com lesões ocupando área . e volume extremamente reduzidos com caracteristicas amorfas, sem sinais de metástases macroscópicas em órgão alvo como os gânglios Iinfáticos, pulmão e fígado e ausência significativa de neovascularização, como também não apresentaram sinais de anemia e caquexia, conforme ilustra a Figura 14. Em nenhum grupo experimental foi observada a formação em órgãos internos de modificações estruturais dignas de nota, como áreas hemorrágicas, exsudato peritoneal, infecções no parênquima pulmonar, quadros de hemorrágica pulmonar ou mesmo depressão imunológica. Por outro lado, o tratamento combinado com os quimioterápicos Taxol (Paclitaxel), nas concentrações de 3.75 e 7.0 mg/ Kg, e o Etoposideo (Vipeside), nas concentrações de 2.5 e 5.0 mg/ Kg, administrados no mesmo esquema terapêutico, mostraram uma redução importante na carga tumoral de 66.7 e 91%, respectivamente, porém foi observada alta e significativa taxa de mortalidade (>85%), além dos extremos efeitos colaterais mielossupressores causados por estes grupos de inibidores da proliferação celular em todas as concentrações avaliadas, conforme ilustra a Figura 15. Após 20 dias de tratamento dos animais portadores de melanoma B16F10 com fosfoetanolamina líquida nas diversas concentrações, os camundongos foram necropsiados, e seus tumores dorsais e lesões metastãticas, retirados fotodocumentados e realizados as análises histopatológicas. Os animais do grupo controle possuem massas tumorais dorsais volumosas, ocupando em torno de 40% a 60% de seu peso corpóreo, seus tumores macroscopicamente apresentavam-se nodulares, pigmentados, ulcerados e necróticos. Histologicamente observou-se, massa celular, pleomórfica (várias formas e tamanhos celulares), pigmento melânico intra e extracelular, células tumorais apresentando-se com figuras de divisão (mitose), vasos sanguíneos neoformados, áreas hemorrágicas proximals, raras células tumorais picnóticas e raras áreas de necrose intra-tumoral. Não foram observados infiltrados inflamatórios, intra ou per¡-tumorais, conforme ilustra a Figura 16.
  26. 26. 10 15 20 25/30 Os animais do grupo controle apresentaram uma quantidade significante de lesões metastãticas em órgãos internos, principalmente pulmão e fígado. Essas lesões apresentaram-se como massas nodulares irregulares, com alta densidade e capacidade proliferativa, alta rede neovascular, com presença de infiltrado intra ou perl-tumoral e/ ou áreas de hemorragia intersticial, como ilustram as Figuras 17 e 18. Os animais portadores de melanoma tratados com fosfoetanolamina liquida na concentração de 1.65 mg apresentaram pequenas massas tumorais nodulares, pouco pigmentadas e com extensas áreas de necrose. Histologicamente, os tumores dorsais indicam pequenas áreas tumorais, ausência de figuras de divisão celular e extensas e significativas áreas de necrose que foram substituídas por elementos fibrilares do estroma. Essa organização da matriz extracelular foi avaliada pelo método citoquímico de Picrosirius. Observa-se moderado infiltrado inflamatório per¡- tumoral, rico em células mononucleares, e, digno de nota, foram encontradas células em degeneração, núcleos celulares fragmentados e apoptóticos, conforme ilustra a Figura 19. O aspecto histopatológico dos tumores dorsais corados pelo método citoquímico Picrosirius, evidenciando-se raras áreas com presença de fibras de colágeno deflagradas em vermelho ao redor dos vasos sanguíneos (A) e no interior do estroma tumoral (B), do grupo controle, que recebeu solução salina é ilustrado na Figura 20. Os animais portadores de melanoma tratados com FOS liquida na concentração de 6.6 mg apresentaram pequenas e raras ou ausência de massas tumorais nodulares, pouco pigmentadas. Histologicamente, os tumores dorsais apresentaram-se com pequenas áreas tumorais, ausência de figuras de divisão celular e extensas e significativas áreas de necrose que foram substituídas por elementos fibrilares do estroma. Observam-se numerosas células em degeneração celular, apoptóticas e com núcleos fragmentados. A vascularização neste grupo de tumores tratados apresentava-se escassa, com vasos irregulares e ausência de áreas hemorrágicas, conforme ilustra a Figura 21. O aspecto histopatológico dos tumores dorsais corados pelo método citoquímico Picrosirius, evidenciando-se moderadas áreas com presença de fibras de colágeno (em vermelho) das lesões primárias, tratadas com 1.65mg/ ml de fosfoetanolamina sintética, é ilustrado na Figura 22
  27. 27. 10 15 20 25 30 26/30 O aspecto histopatológico dos tumores dorsais corados pelo método citoquímico Picrosirius, evidenciando-se extensas áreas com presença de fibras de colágeno em vermelho das lesões primárias, tratadas com 6.6mg/ ml de fosfoetanolamina sintética, é ilustrado na Figura 23. Os vasos sanguíneos foram corados pelo método citoquímico de Verloff, para evidenciar as fibras musculares lisas das paredes dos vasos. Os tumores do grupo controle apresentaram vasos sanguíneos neoformados distribuídos em toda a massa tumoral. Estes se mostraram com grandes diâmetros ao redor da massa tumoral e com propriedades proliferativas, conforme ilustado na Figura 24. Nos grupos de animais portadores de melanoma B16F10 e tratados com fosfoetanolamina líquida nas concentrações de 1.65 e 6.6 mg observamos uma redução significativa na rede vascular neoformada, como também no diâmetro dos vasos existentes, conforme ilustrado na Figura 25. As amostras sanguíneas de animais tratados com fosfoetanolamina líquida nas concentrações de 9.9 a 1.65mg e grupo controle na presença do anticoagulante EDTA (10%), foram obtidas do plexo venoso retro-orbital dos camundongos portadores de tumores dorsais B16F10. Os animais foram mantidos durante a experimentação e colheita em condições normais e não estressantes sem o uso de anestesia. As do tratamento sedação ou análises hematológicas com fosfoetanolamina líquida mostraram que em todas as concentrações administradas pela via intraperitoneal, nos animais portadores de tumores melanoma, submetidos ao tratamento apresentaram um aumento significativo (p<0.001) no número total de glóbulos vermelhos, sem modificações em seus aspectos morfológicos, não sendo observados: anemia, hemorragia ou estímulo de eritropoiese extramedular e sem desvio a esquerda, quando foram comparados ao grupo controle, que recebeu solução salina. Esses resultados também foram comprovados pela determinação do hematócrito e da quantidade de hemoglobina, em todas as concentrações e observamos um aumento extremamente significativo em torno de 37% no grupo de animais submetidos ao tratamento com fosfoetanolamina líquida conforme ilustra a Figura 26. A análise do hematócrito (Ht) dos animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina líquida é ilustrada na Figura 27.
  28. 28. 10 15 20 25 30 27/30 A análise quantitativa da hemoglobina (Hb) dos animais portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina liquida é ilustrada na Figura 28. Não foram observadas alterações quantitativas no número total de plaquetas após o tratamento dos animais portadores de melanoma B16F10 com o composto fosfoetanolamina líquida, conforme ilustrado na Figura 29. O tratamento com fosfoetanolamina líquida nos animais portadores de melanoma mostrou que o composto induz um aumento extremamente significativo (p<0.001), no número de leucócitos total nas concentrações de 9.9 e 6.6 mg/ ml , quando comparados aos grupos controles tratados com salina ou animais normais, conforme ilustrado na Figura 30. O grupo controle salina (SAL), após a aplicação do PTZ, apresentou comportamentos típicos de exploração e de autolimpeza. Exploração: verificação visual, olfativa e auditiva do ambiente, mais intensa nos primeiros momentos após colocação do animal na gaiola individual. Autolimpeza: lambidas e mordidas na pele, garras, pelos e/ ou órgãos genitais, ocorrendo do lado direito e esquerdo do corpo, e frontalmente nas garras e na limpeza de cabeça. O grupo clordiazepóxido (CDZ) apresentou comportamentos similares ao grupo salina nos primeiro momentos de exposição ao novo ambiente da gaiola metálica, sendo relatados comportamentos de exploração e auto limpeza. (FS) exploratórios e de auto limpeza nos momentos seguidos ao da aplicação de PTZ, O grupo fosfoetanolamina exibiu os mesmos comportamentos porém, estes animais se mostraram mais agitados, apresentando maiores freqüências destes comportamentos. A intensidade das crises de cada grupo, medida pela escala de Racine, é ilustrada na figura 31. Frente aos resultados, encontrou-se diferença estatisticamente significativa na intensidade das convulsões entre os grupos, segundo o teste de KruskaI-Wallis [H(gl=2, n= 45)=27,22; p<0,05]. Os animais dos grupos FS e CDZ tiveram convulsões com intensidades significativamente menores que os animais do grupo SAL (teste de Wald-Wolfowitz ; p<0,001). A incidência das Crises convulsivas induzidas por PTZ está sumarizada na Tabela 3. O grupo CDZ apresentou redução estatisticamente significativa de
  29. 29. 10 15 28/30 incidência de crises com relação ao grupo SAL [Qui-quadrado (gl = 3, p = 5,98) 22,18]. Já o grupo tratado com FS apresentou incidência de crises semelhante ao grupo SAL (Qui-quadrado: gl = 1, p = 0.1432). Tabela 3 - Porcentagem de indivíduos que apresentaram crises convulsivas. O asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa para o grupo CDZ em relação a salina. l Total de animais Porcentagem de ratos que apresentaram cñses 100 °/ o 60 % * Salina Os dados de latência são ilustrados na Figura 32, que mostra a média, mais o erro-padrão da média, para cada grupo. A análise de variância revelou diferença estatisticamente significativa entre os tratamentos [F(2,34)=5,47;p<0,0087]. O grupo tratado com CDZ apresentou maior latência de convulsões quando comparado ao grupo FS e SAL (p<0,05). Os grupos tratados com salina e fosfoetanolamina não diferiram entre si. A porcentagem de óbitos para o grupo tratado com FS foi significativamente menor em relação ao SAL (Qui-quadrado gl = 1, p = 0,0143), sendo que não houve diferença para o grupo tratado com CDZ. A tabela 4, abaixo mostra os valores de mortalidade em cada grupo. Tabela 4 - Porcentagem de ratos que vieram a óbito em cada grupo no periodo de 24 horas. O asterisco (*) indica redução de mortalidade estatisticamente significante para o grupo FS. Total de animais Porcentagem de ratos que vieram a óbito 15 33 % 'i5 13,3 %* 0 °/ o * 15 i Através da avaliação dos registros do encefalograma, foi possivel detectar que o padrão de ondas cerebrais encontradas em todos os animais antes do tratamento correspondia aos de animais epiléticos, pois todos possuíam ondas cerebrais com
  30. 30. Ui 10 15 25 29/30 eventos de disparos assincrônicos com ondas de espícula longa seguida de ondas lentas, conforme ilustrado na Figura 33, características de eventos epiléticos (RACINE, R. J. Modifications of seizure activity by electrical stimulation: ii, motor seizure. Electroencephal. Clin. Neurophysiol. v. 32, p. 281- 294, 1972). Este teste confirmou e validou o modelo de corrida selvagem _adotado na seleção prévia dos animais. Em observação realizada por quinze minutos de análise, a média foi de 29.2 ocorrências com uma duração média de 118,75 cm. Dividindo pela velocidade do papel a 5 cm/ seg, o tempo total de crise foi de 23,75 segundos de duração antes do tratamento. A detecção de padrões de ondas hipersincronizadas antes das crises propriamente ditas, também foi bem caracterizada, conforme ilustra a Figura 34. Outra evidência que sustenta esta confirmação foi a detecção simultânea de mioclônias faciais e de membros superiores com o registro concomitante de crise epiléticas no EEG. Este evento de crise ficou mais evidente pela alta freqüência do registro acima da normalmente detectada, nas crises de outros animais, conforme ilustrado na Figura 35. Após tratamento o número de ocorrências registradas foi de 0,91 segundos de duração, estes dados estão demonstrados na Figura 36 para ocorrências, e na Figura 37 para a duração das crises dadas em segundos. Na presença dos resultados, encontrou-se diferença estatisticamente significativa nas comparações de ocorrências de crises antes e após o tratamento com FS segundo o teste T estatístico (T (n = 12; df = 11) = 18,9; p= <0,01), para análise da duração encontrou- se diferença significativa segundo o teste T (T (n = 12; df = 11) = 22,09; p<0,01). Após o tratamento, ainda foi possível notar uma hipersincronização de ondas cerebrais, características de início de disparos epiléticos, conforme ilustrado na Figura 38, (TISSER et al. , 2005), porém, sem o desencadeamento de crises epiléticas, propriamente ditas, como as encontradas anteriormente (Figura 34 e 35). As vantagens do produto ora proposto nos tratamentos biológicos realizados é a sua baixa toxicidade, comprovado pela DL 50, o baixo custo de síntese, a facilidade de manuseio e aplicação bem como a dose efetiva ser relativamente baixa a dose letal, o que dá ao composto fosfoetanolamina uma margem de segurança clara na possível auto-administração em humanos. A ausência de efeitos colaterais, uma vez
  31. 31. 30/30 que o produto é similar a compostos naturalmente encontrados nos organismos de mamíferos é outra característica relevante do produto.
  32. 32. 10 15 20 25 30 1/17 REIVINDICAÇÕES 1. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE D| SFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, caracterizada por prever a aplicação da 2-aminodihidrogenofosfato nas formas sólida e líquida, sendo que a forma sólida é composta de sais de cálcio, magnésio e zinco, e a forma liquida como uma solução tamponada com monoetanolamina em pH 7,4 como precursor de fosfolipideo em disfunções celulares e metabólicas, em cuja etapa de preparação a linhagem tumoral cultivada em cultura de melanoma murino B16F10, foi suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado, 2 mM de L-glutamina e antibióticos, sendo que antes das células atingirem confluência, foram subcultivadas para ampliação e congelamento, em meio completo contendo 10% de dimetil- sulfoxido, e mantidas em nitrogênio líquido, sendo que as suspensões celulares utilizadas para a implantação no flanco dorsal dos animais foram obtidas após tratamento com Tripsina 0,2%, por 5 minutos, e inativação com 10% de soro fetal bovino, sendo as células desprendidas centrifugadas duas vezes, ressuspensas em meio de cultura, e a concentração celular ajustada por contagem em câmera de Mallassez. sendo que a viabilidade celular das linhagens celulares tumorais e normais foram tratadas com diferentes concentrações de fosfoetanolamina sintética e avaliadas, e onde a determinação da sensibilidade das diferentes doses foi otimizada, para determinação da atividade citotóxica das suspensões das linhagens celulares e das células tumorais "in vivo", e retiradas cirurgicamente em condições estéreis e adicionados 10 ml de MTT (5mg/ ml), incubadas por 3 horas em estufa contendo 5% de C02 a 37°C, e, após este período, o meio foi removido e acrescentado 100 mI de dimetilsulfoxido (DMSO) para dissolver os cristais formados e precipitados, sendo quantificada a absorbância; a citometria de fluxo aplicada no estudo do ciclo celular registrou os parâmetros cinéticos da população celular, revelando o indice de DNA, aploidia, a fração de proliferação celular, e a porcentagem de células encontradas nas fases G0/G1, S e G2/M, indicando parâmetros uni ou multivariáveis, prognósticos e possíveis rumos terapêuticos, sendo que a análise forneceu o porcentual de células que estão sintetizando DNA, na duração da fase S (Ts) e do tempo de duplicação potencial (Tpot), sendo que as alíquotas das suspensões das células normais e tumorais tratadas e não tratadas foram congeladas em tampão citrato (2mM), sacarose 25 mM e 0,05% dimetil
  33. 33. 10 15 25 30 2/17 sulfóxido (DMSO), e mantidas em nitrogênio líquido até o momento de sua utilização, sendo que, após descongelamento das amostras em banho de gelo, as células foram digeridas com 375 ml de tripsina 0,03 g/ I (Sigma), por 10 minutos à temperatura ambiente, e neutralizada com o inibidor de tripsina 0,5 g/ I (Sigma), ribonuclease A 0,1 g/ l (Sigma) e espermina 1.2 g/ l (Sigma), e transferidas para tubos de citometria de fluxo, sendo que a quantidade de células nas diferentes fases do ciclo, niveis de apoptose (Sub-G1) e conteúdo de DNA na fase S, foram obtidos pela análise em software Mod-fit, as suspensões celulares (106/mI) normais dos tumores dorsais e ou metástases foram centrifugadas duas vezes a 3000 rpm com solução PBS e ressuspensas em 200 ml solução de iodeto de propidium (20 mg/ ml), contendo 20 ml Triton X-100 e 4 mg RNAse-A, por trinta minutos, à temperatura ambiente, protegidas da luz, e, após este período, as amostras foram transferidas para tubos de citometria, e as imagens adquiridas foram capturadas em citômetro de fluxo e analizadas em software Cell-Quest, e as fases do ciclo celular pré e pós-mitóticas (GO-G1. fase S e G2-M) foram analisadas em software Modi-fit. 2. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, caracterizada pelo fato das células obtidas de acordo com a reivindicação 1 serem injetada subcutaneamente no dorso de camundongos, com 5x104 células tumorais de melanoma murino B16F10, e, após o décimo quarto dia do implante tumoral os tumores dorsais apresentavam diâmetro médio de 0,5 cmz, iniciando-se o tratamento com fosfoetanolamina sintética, nas mais diferentes concentrações, que foi injetada por via intraperitoneal, sendo que, como grupo controle, os animais receberam solução salina, pelas mesmas vias de tratamento, e, após o 20° dia do tratamento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo, em seguida, realizados a necropsia, os tumores dorsais analisados, as lesões internas macroscópicas identificadas, medidas e fotodocumentadas, e onde a amostras dos tumores dos diferentes grupos de tratamento e grupo controle, não tratado, foram processadas para as análises do conteúdo de DNA, ciclo celular e anatomopatológico, sendo utilizado no experimento 40 camundongos da linhagem Balb c, fêmeas e machos, com aproximadamente 25g, idade aproximada de 6 a 8 semanas, dieta e água "aid libitum", os quais foram divididos em 4 grupos de 10 camundongos cada, onde os animais do Grupo A foram tratados com fosfoetanolamina sintética pela via
  34. 34. 10 15 20 lx) UI 3/17 intraperitoneal com a concentração de 0,033g/ ml em 100u| ; os animais do Grupo B foram tratados com fosfoetanolamina líquida pela via intraperitoneal com a concentração de 0,066g/ ml em 200ul; os animais do Grupo C foram tratados com fosfoetanolamina sintética pela via intraperitoneal com a concentração de 0,099g/ ml em 300ul, e os animais do Grupo D foram tratados com solução salina pela via intraperitoneal, sendo que, após a injeção de células, o crescimento tumoral foi medido e fotodocumentado, com medições longitudinais e transversais, sendo calculadas a area e o volume médio do tumor, e sendo os animais sacrificados a cada etapa de tratamento, necropsiados e os nódulos tumorais macroscópicos presentes nos órgãos internos contados e medidos, sendo que a contagem e a quantificação dos glóbulos vermelhos revelou alíquotas de 10ul do sangue de cada grupo experimental e controle que foram diluídas 121000 em solução salina 0,9% e 0,01°/ o paraformaldeido para a análise do número total de glóbulos vermelhos, sendo o número de células expresso em 109 lml; a determinação do hematócrito (Ht) foi realizada pela coleta do sangue em microcapilar de 10u| heparínizado selado em uma das extremidades, e colocado em microcentrifuga com sua extremidade fechada voltada para o círculo externo e centrifugada a 11.000 rpm, durante 5 minutos, e os resultados foram expressos, após análise comparativa da relação do sedimento rico em glóbulos vermelhos e plasma, em tabela de referência padrão, sendo que para determinação do teor de hemoglobina foi coletada 200ul de sangue do plexo venoso retro orbital em microcapilares contendo como anticoagulante o EDTA, e, utilizando o metodo da cianometa-hemoglobina com leitura em espectrofotômetro 540nm, foram analisadas as concentrações de hemoglobina, sendo a contagem de plaquetas realizada em câmara de Neubauer, utilizando como diluente a solução de oxalato de amônio a 1% (líquido de Brecker), sendo realizados também esfregaços sanguíneos dos diferentes grupos de animais tratados e grupo controle, para a avaliação da morfologia e do diâmetro plaquetário médio, sendo avaliados ainda aspectos citológicos, como presença de macro ou micro plaquetas, que são mais funcionais que as plaquetas normais e que indicam regeneração da medula óssea, bem como a presença de agregados plaquetários indicativos de alterações tóxicas promovidas pelos compostos, assim como alguma alteração morfológica celular; uma alíquota de 10u| do sangue de cada grupo experimental e controle foram diluídos em 90pl de solução de Turk (azul de metileno 0,5% em 30% de ácido acético glacial) para
  35. 35. 10 15 20 30 4/17 análise do número total de glóbulos brancos, e o número de células foi expresso em 106/mI, sendo o sangue total dos camundongos tratados com FOS liquida durante 20 dias e grupo controle que recebeu solução salina foram coletados por punção do plexo venoso retro-orbital com o auxílio de um microcapilar de 10u| heparínizado, e parte desse material foi utilizado para a confecção do esfregaço sanguíneo. 3. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECUVRSOREDE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato das lâminas para as análises diferenciais dos leucócitos terem sido fixas em metanol puro, por cinco minutos, e, em seguida coradas em solução de Giemsa, por quinze minutos, lavadas em água corrente e secas à temperatura ambiente, e, após a sua secagem, foi realizada a contagem diferencial de glóbulos brancos em microscopia óptica com aumento de 1000x em óleo de imersão, e retirados pequenos fragmentos de aproximadamente 0.2cm2 dos órgãos dos animais tratados e controle, pesados e fixados, por 24 horas, em tampão formalina, tamponado com pH = 7,4, para a realização de análises histopatológicas, bem como de seus tumores e metástases, sendo corados de diversas maneiras, melhor ocorridas no possibilitando uma visualização das manifestações microambiente celular, como diferenciação celular, neoformação vascular, apoptose, necrose, regeneração tecidual, hemorragias entre outros, e, após o período de fixação de 24 horas, utilizando-se a lâmina histológica sobre tábua de macroscopia, foram retiradas duas amostras retangulares, que foram acondicionadas em cápsula histológica e colocadas no autotécnico para processamento, sendo desidratadas em concentrações crescentes de álcool etílico a 70, 80 e 90%, e, posteriormente, diafanizadas em xilol contendo misturas seqüencialmente concentradas de parafina, durante 12 horas, e, realizada inclusão em parafina quente e os blocos microtomizados em cortes de õpm, e dispostos em lâmina de vidro de 75 x 25 mm, realizando-se dois niveis de corte para cada área de estudo, e, a seguir, as lâminas foram corados pelos métodos citoquímicos para fibras de colágeno e para fibras elásticas e vasos, sendo que os cortes histológicos (3pm) dos tumores dos grupos tratados com fosfoetanolamina liquida e controle que receberam solução salina foram fixos em tampão contendo 3% paraformaldeido, 0,2% de glutaraldeído e 0,1% triton X-100 em tampão fosfato de sódio pH = 7,4, onde colágeno, por ser uma proteina básica, interage com os grupos sulfônicos do corante Vermelho Sírio a
  36. 36. 10 15 20 25 30 5/17 0,1%, e em pH baixo, com os grupos amino da lisina e da hidroxilisina e os grupos guanidina da arginina, e a coloração pelo método do Picrosirius faz com que grande quantidade de moléculas do corante, de caráter ácido e alongado, fiquem dispostas paralelamente às moléculas do colágeno, o que provoca aumento considerável da birrefringência das fibras que contêm colágeno, quando vistas à luz polarizada, e, dessa forma, o método de coloração associado à microscopia de polarização é um método histoquimico específico de detecção de estruturas compostas de moléculas de colágeno orientadas. 4. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE D| SFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que em ambos os experimentos os sujeitos foram ratos Wistar machos, sadios e geneticamente epilépticos, com 60 dias de idade, tratados com ração da marca Labina e água potável ad libitum, sendo que todos os animais foram mantidos em ambiente controlado de luz e temperatura 20° C a 24° C, e foram separados aleatoriamente, com cinco animais por caixa e três caixas por grupo, para adaptação, sendo todos os indivíduos marcados na cauda, afim de destacar os grupos e individuos dentro de cada caixa do grupo, e foram pesados diariamente e calculado o volume de cada composto administrado por individuo, sendo que todas as soluções foram administradas no periodo da manhã, e o tratamento crônico foi estabelecido durante trinta dias consecutivos, tendo sido utilizados, além dos meios materiais “ para a detecção e qualificação dos comportamentos dos indivíduos, soluções químicas de fosfoetanolamina sintética, na forma sólida complexada com Cálcio, Magnésio e Zinco; clordiazepóxido manipulado por farmacia de manipulação e emulsionado em solução salina a 0,9% apenas durante o processo de administração da droga; pentilenotretrazol do fabricante laboratório Sigma-Aldrich, pesado em balança analítica, com precisão de décimo de mg, e solubilizado em solução salina a 0,9 % de concentração apenas na hora da administração do composto, sendo a solução salina (NaCl) confeccionada com água bidestilada e esterilizada em 0,9 % de concentração, sendo que o grupo testado fosfoetanolamina recebeu uma dose de 22g/ kg corporal de fosfoetanolamina sintética sólida com Cálcio. Magnésio e Zinco como agentes alcalinizantes, emulsificado em solução salina a 0,9% de concentração, e foi administrado por gavagem em um volume de 10ml/ Kg corporal; o Grupo controle com anti-convulsivante conhecido,
  37. 37. 10 15 20 6/17 clordiazepóxido (CDZ) recebeu uma dose de 10mg/ Kg corporal de clordiazepóxido em solução salina a 0,9%, em um volume de administração de 10 ml/ Kg corporal administrado por gavagem; o Grupo controle salina (SAL) recebeu solução salina a 0,9% de concentração em um volume de 10 mI/ Kg corporal administrado por. gavagem, e, no trigésimo dia de tratamento e após a administração de todas as soluções, os animais tiveram sua ração suspensa, e, transcorridas duas horas do ' início da administração das soluções, houve o início da administração do pentilenotetrazol, administrado por via intraperitonial (IP) na dose de 60 mg/ Kg corporal em um volume de 6 mI/ Kg corporal em solução salina a 0,9%, e, para avaliação das crises convulsivas foi adotada a escala RACINE dos niveis de convulsão observada nos animais, e que apresentaram os seguintes resultados: Estágio Descrição O Sem resposta aparente 1 Movimentos súbito das orelhas e da face 2 Movimentos mioclônicos sem verticalização corporal 3 Movimentos mioclônicos em posição vertical, com tônus bilateral dos membros anteriores : L 4 Convulsão tônico-clônica Convulsão tônico-clônica generalizada, com perda do controle postural sendo que, para cada aplicação de PTZ, foram selecionados três animais, que, após receberem a droga ficaram isolados em gaiolas individuais, tendo sido todo processo cronometrado e todas as respostas produzidas pelos animais anotadas, e onde o tempo total de cada seção de observação fo¡ de 40 minutos, sendo que todos os animais foram acompanhamento 24 horas após a administração do PTZ para verificação de possiveis ocorrências de óbitos. 5. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE D| SFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que na segunda etapa do experimento,
  38. 38. U1 10 20 lx) Ui 30 7/17 de implante e cirurgia, foram usados plugs de conexões torneadas para o implante intracraniano, cortados e soldados aos fios níquel cromo de espessura 0,03 mm, previamente raspados para retirada do esmalte isolante, e, durante o procedimento de soldagem, não se utilizou ácidos para remoção de óxidos nas partes a serem soldadas, para se evitar ruídos provocados pela interferência deste processo na posterior leitura do EEG; cabo de cobre 0,06 mm com plugs tipo "bananas" conectados em uma das pontas, com plug torneado tipo macho na outra ponta, a qual se conecta ao implante existente na cabeça do animal, sendo as extremidades opostas dos plugs "bananas" conectados à caixa de eletrodos, e esta ao eletroencefalogramo; retifica de alta rotação com broca de ponta diamantada, para a confecção dos furos da trepanação do crânio do rato, onde foram conectados parafusos de aço inoxidável; resina polimérica moldável para o isolamento das conexões de soldas existentes nos plugs e auxilio na fixação e no isolamento elétrico do plug implantado na cabeça do rato; Cronômetro para demarcar com segurança o inicio e fim da sedação de cada animal em processo cirúrgico; anestésico geral, a base de Ketamina, como anestésico de ação central; anestésico local Xylestesin (Cloridrato de lidocaina com epinefrina 1:200.000 a 2%) em solução injetável, na sedação e inibição de sangramento excessivo; relaxante muscular com Xilazina 5°/ o, administrado intramuscularmente para evitar espasmos musculares súbitos; água oxigenada 10 volumes para remoção de resíduos de tecidos moles e sangue no processo de díafanização das camadas teciduais; gases e algodão hidrofóbico, esterilizados e próprios para estancamento do sangue; pinça dente de rato, pinça de relojoeiro, tesoura cirúrgica, bisturi lamina número 10, seringa carpodérmica, seringas descartáveis de 1 mL e 5 mL; gaiola de Faraday, contra energia estática, no interior da qual está prevista caixa de madeira com um furo na tampa, para permitir a passagem dos cabos que interligaram o plug implantado à caixa de eletrodos; caixa de eletrodos para amplificação e interpolação de sinais provenientes do implante, e que fica conectada, por um cabo próprio, ao EEG; eletroencefalografia, com constante de tempo 0,03, filtragem de 35 Hz e 200 uV e velocidade do papel de 5 cm por segundo. 6. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLlPÍDEO PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que nos tratamentos que utilizaram
  39. 39. 10 i5 20 25 8/17 solução de fosfoetanolamina com agentes alcalinizantes cálcio, zinco e magnésio, emulsionado em solução salina a 0,9%, foram selecionados 24 ratos Wistar machos e adultos, que foram criados em cabine acústica com acionamento de sirene a 130 decibéis com freqüência de 22.000Hz, sendo que apenas os animais que apresentaram crise audiogénica indicativo de quadro epilético foram utilizados, sendo que estes animais foram separados em numero de 12 individuos, denominado Grupo ' 1, e foram tratados com fosfoetanolamina, e, após tratamento, foram submetidos à cirurgia de implante de plug intra-cortical com auxílio de aparelho estereotáxico, segundo a orientação do mapa estereotáxico de PAXINOS e WATSON, sendo os animais sedados com anestesia geral, kentamina na dose de 1,2 ml/ kg/ i.p. , além de serem localmente sedados com relaxante muscular na dose de 1ml/ Kg/ i.m, e, posteriormente a verificação de sedação total do animal, através de pinçamento da pálpebra, fixou-se o crânio do mesmo no aparelho estereotáxico, efetuando-se uma aplicação de anestésico local e de agente vasoconstritor em solução salina 0,9%, para evitar sangramento excessivo, e retirou-se, com auxilio de uma tesoura cirúrgica, os pelos do crânio, sendo a porção de tecido muscular e epitelial do mesmo diafanizada com auxílio de bisturi e lâmina número 10, realizando-se uma raspagem do crânio a fim de remover todo tecido mole no campo cirúrgico, acrescentou-se água oxigenada 10 volumes durante o inicio do procedimento cirúrgico, a fim de remover todo resíduo de tecido mole ainda aderido ao tecido ósseo, sendo que, para a colocação dos animais no aparelho esterotáxico, posicionou-se a barra incisória na medida 3,3 mm abaixo do zero horizontal, os dentes incisivos dos ratos foram presos no aparelho, fixou-se as barras horizontais do aparelho nos meatos auditivos e a linha média cranial foi alinhada centralmente, e, depois deste processo, marcou-se nas escalas das barras do aparelho estereotáxico os pontos de perfusão craniana a serem realizados, tendo sido marcados um ponto de cada lado da sutura sagital do crânio a 1 mm (LE) (látero lateral esquerdo) e 1mm (LD) (látero lateral direito), um outro ponto a 1 mm (PB) da sutura bregma (posterior bregma), e um ponto a 1 mm da sutura lambidóide (posterior anterior), e, nos locais sinalizados, com auxilio de broca diamantada e retifica de alta rotação, foram realizados furos no crânio, e nestes fixados parafusos de aço inoxidável até a confirmação do contato direto do córtex do animal, tendo sido conectados nos parafusos fios esmaltados previamente raspados conectados ao plug torneado, e, para evitar rompimento, isolou-se e fixou-
  40. 40. i0 15 20 25 30 9/17 se o plug à calota craniana com resina acrílica moldável, realizaram-se ainda pontos falsos com linha de algodão esterilizada na pele do crânio para finalizar a cirurgia, e, durante as horas seguintes o animal ficou sob observação até o seu despertar total e a verificação de possiveis acometimentos anormais no seu comportamento. 7. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE D| SFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que, após 24 horas de cultura, fase de crescimento exponencial das células de melanoma B16F10 foram plaqueadas em microplacas de 96 orifícios e adicionadas às diferentes concentrações do composto diluído em meio de cultura, e o tratamento com a fosfetanolamina sintética, em culturas celulares de melanoma murino B16F10, mostrou efeito adverso sobre a toxicidade deste composto, tempo e dose dependentes, sendo que a viabilidade celular, após 24 horas, nas concentrações de 6 mg à 0.005 mg da fosfoetanolamina liquida, mostrou que este composto apresenta alta citotoxicidade em células tumorais somente nas altas concentrações analisadas (6 - 1,5mg/ ml), enquanto que nas outras concentrações testadas não foram observados efeitos deletérios significantes (>O.75 mg/ ml), e, nessas condições foi determinada a concentração inibitória 50% a partir da curva de regressão linear, onde o resultado para as células de melanoma foi de 2.3 mg/ ml, e a fosfoetanolamina líquida não inibe resposta proliferativa inespecifica de linfócitos T normais mantidos em cultura por 96 horas e ativados pelo mitógeno PHA (fitohemaglutinina), os animais portadores de melanoma B16F10 tratados durante 20 dias consecutivos com fosfoetanolamina liquida, apresentaram aumento significativo na taxa de sobrevida nas concentrações variando de 9.9 mg até 1.65 mg em comparação ao grupo controle, sendo que, após necrópsia dos grupos de animais portadores de tumor dorsal ou metástases pulmonares e do grupo controle que recebeu solução salina, foram avaliadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo e determinadas a porcentagem das células nas seguintes fases: sub G1 quiescentes, Fase S em síntese de DNA e G2/M em mitose. onde os resultados ou apoptóticas que apresentam DNA fragmentado, GO/ G1 células mostraram que as células tumorais B16F10 obtidas do tumor dorsal do grupo controle apresentam 6,9% i 3.4 em apoptose (sub-Gl), 25.6% i 4.8 células quiescente (G0/G1) e em grande proporção com capacidade proliferativa 51 .3% : r 3.0 na fase (G2/M), sendo que os animais tratados com 9.9 mg apresentaram
  41. 41. V¡ i0 i5 20 30 10/17 significante aumento na taxa de mortalidade e seus tumores significativas áreas de necrose, enquanto que os tumores dos animais tratados com a concentração de 6.6 mg apresentaram aumento extremamente significante na proporção de células em apoptose, sub G1 (12.8% i 4.4) em comparação ao grupo controle não tratado, tendo sido ainda obsen/ adas diminuições significantes (p<0.001) na porcentagem de células em GO/ G1 (2.90 % i 0.9), e células com capacidadelde síntese de DNA, fase S (1,49% t 0.28) induzida pela fosfoetanolamina sintética em comparação ao grupo controle (23.1% i 4.6), sendo que a proporção de células com capacidade proliferativa (G2/M) teve valor significativamente menor (P<0.001) nas células tumorais tratadas com 6.6 mg de fosfoetanolamina líquida (2.1% : r 0.89) em relação ao grupo controle (51 .4% i 3.0), sendo que os tumores do grupo de animais tratados com a concentração de 1.65 mg apresentaram aumento significante na proporção de células em apoptose (176% i 2.3) em comparação ao grupo controle não tratado (68% i 3.4), e, quando comparadas às concentrações de 6.6 e 1.65 mg de fosfoetanolamina líquida os niveis de apoptose não tiveram diferenças significantes, sendo que as proporções de células quiescentes diminuíram significantemente (p=0.0015) no grupo de células tratadas com fosfoetanolamina líquida (12.7 % i 4.06) em relação ao controle (25.6% i 4.8), e a capacidade de síntese (fase S) diminuiu significativamente (P<0.001) no grupo tratado com fosfoetanolamina liquida (4.9% i 1.2), em relação ao grupo controle (23.01°/ o i 4.6), sendo que as células com capacidade proliferativa (G2/M) diminuíram significativamente (p<0.001) no grupo de tumores tratados com 1.65 mg de fosfoetanolamina líquida (11.9% i 2.2) em relação ao grupo controle (51.4% i 3.0). 8. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPÍDEO PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que análises comparativas entre os tratamentos com a fosfoetanolamina liquida nas concentrações de 6.6 e 1.65 mg com o quimioterápico Taxol na concentração de 3.7uM, específico de última geração responsavel pela inibição de proteinas envolvidas na dimerização de microtúbulos durante a divisão celular, nas fases G2/M, mostraram que em todas as fases do ciclo a fosfoetanolamina liquida na concentração de 6.6 mg diminui significativamente a capacidade de proliferação celular e é um indutor importante de células em apoptose com a mesma eficácia terapêutica, porém sem apresentar catastróficos efeitos
  42. 42. i0 15 20 11/17 colaterais; na concentração de 1.65 mg de fosfoetanolamina líquida a eficácia de inibição das fases quiescentes, S e proliferativa G2/M mostrou-se dependente da dose administrada no tratamento, sendo que as análises das fases do ciclo celular obtidas por citometria de fluxo das células de melanoma B16F10 dos grupos: controle, tratados com 6.6 e 1.65 mg/ mL de fosfoetanolamina líquida e com o quimioterápico Taxol apresentaram os seguintes resultados: Linhagem B16F10/ Sub-G1 G0/G1 S G2/M Tratamento (°o) (%) (°/ o) (%) Controle 6.9 J: 3.4 25.6 i 4.8 23.1 2: 4.6 51.3 1 3.0 Fosofoetanolamina 12.8 i 4.4 2.9 i 0.9 1.49 i 0.28 2.1 i 0.89 6.6 mg/ mL (0.0468uM) Fosofoetanolamina 17.5 i 2.3 12.7 i 4.1 4.9 :1.2 11.9 i' 2.2 1.65 mg/ mL (0.0117uM) Taxol (3.75 uM) 15.4 x 8.7 1.38 1 0.7 9. FOSFOETANOLAMINA COMO PRECURSOR DE FOSFOLIPIDEO PARA CORREÇÃO DE DISFUNÇÕES CELULARES E METABÓLICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que, após o 14° dia da implantação das células tumoraisl, 100% dos animais apresentavam tumores dorsais próximos aos locais de inoculação apresentando em média volume de 0.10 i 0.05cm3, sendo que os animais de todos os grupos de experimentação tratados e controle foram observados e tiveram os tumores pesados medidos diariamente, e, após 20 dias de tratamento com fosfoetalonamina sintética administrada pela via intraperitoneal com concentrações de 9.9, 6.6 e 1.65 mg, foram sacrificados por deslocamento cervical, necropsiados e os tumores dorsais e as metástases presentes nos órgãos internos pesados e fixados, por 24 horas, em tampão formalina, tamponado com o pH 7,4 para análises histopatológicas, sendo que, macroscopicamente, os tumores dos animais tratados com 1.65 mg de FOS líquida mostraram-se como massas nodulares dorsais não pigmentadas, não ulceradas e com raras áreas de irrigação ou neoangiogênese, tendo sido observado também a formação de tecido encapsulado. característico de fibrose, a massa não se apresentava aderida á superficie interna do animal, caracteristicas de tumores benignos; por outro lado, o grupo controle

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