O documento descreve um experimento sobre a precipitação de proteínas da clara de ovo sob diferentes condições. Foram testados a adição de sais, calor e solventes orgânicos. A adição de sais e calor causou a precipitação da albumina, enquanto solventes orgânicos como etanol e acetona também precipitaram a proteína.

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Faculdade Maurício de Nassau
Bioquímica
AULA PRÁTICA I:
RELATÓRIO DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
Aluna: Ilana Farias Andrade de Moura
Bacharel em Enfermagem - Noite C
Prof° - Sra. Thaís Pontes
Fortaleza / Ceará
20.05.13

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ÍNDICE
1. Introdução ------------------------------------------------------------------------------- 3
2. Objetivo----------------------------------------------------------------------------------- 4
3. Materiais e métodos -------------------------------------------------------------------- 5
4. Resultados e discussões ---------------------------------------------------------------- 7
5. Conclusão -------------------------------------------------------------------------------- 9
6. Referência Bibliográfica ------------------------------------------------------------- 10

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INTRODUÇÃO
As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas
células. São encontradas em todas as partes de todas as células, uma vez que são
fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas
espécies diferentes de proteínas, cada uma especializada para uma função biológica
diversa, como por exemplo, transporte de substâncias, manutenção da pressão, defesa
contra organismos estranhos. Além disso, a maior parte da informação genética é
expressa pelas proteínas. Pertencem à classe dos peptídeos, pois são formadas por
aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas, sendo esta uma ligação covalente
entre o grupo amino (-NH 2 ) e um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH)
de outro aminoácido, através da formação de uma amida. Por estar muito próximo um
aminoácido do outro eles começam a interagir por pontes de hidrogênio. Essas
interações são do tipo ponte de hidrogênio e pontes de dissulfeto, interações
hidrofóbicas e interações iônicas. A desnaturação protéica se dá não só pelo calor, mas
também por extremos de pH, por alguns solventes orgânicos miscíveis com a água
(álcool e acetona, por exemplo), por certos solutos como uréia e cloridrato de
guanidínio ou por detergentes. Cada um desses agentes desnaturantes representa um
tratamento relativamente brando no sentido de que nenhuma ligação covalente na cadeia
polipepitídica é rompida. Os solventes orgânicos (uréia e detergente) agem
principalmente de modo a promover o rompimento de interações hidrofóbicas que
estabilizam as proteínas globulares; os extremos de pH alteram a carga líquida da
proteína, provocando a repulsão eletrostática e rompimento de algumas ligações de
hidrogênio.
A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas funções no
organismo, e não com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, são
proteínas; muitas vezes, as enzimas existem em porções muito pequenas. Mesmo assim,
estas substâncias catalisam todas as reações metabólicas e capacitam aos organismos à
construção de outras moléculas - proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos e lipídios -
que são necessárias para a vida. O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos
leva, invariavelmente, ao estudo de proteínas. Portanto, torna-se importante a existência
de métodos adequados de purificação e quantificação destes compostos. A purificação e
caracterização de uma proteína baseiam-se em suas características físico-químicas.

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OBJETIVO
Analisar o comportamento da proteína ovoalbumina sob o efeito de diversos
fatores: temperatura, solventes orgânicos e altas concentrações salinas, podem ser feitos
experimentos no qual determinada proteína é exposta a diferentes condições. Para tal,
utilizaremos a albumina, presente na clara de ovo.

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MATERIAIS DE MÉTODOS
1. Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito de força iônica)
a) Reagentes e soluções
- solução de clara de ovo
- solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4]
- solução de NaCl
- água destilada
b) Vidraçaria e instrumental
- Pipeta
- 1 tudo de ensaio
* Preparo da solução de clara de ovo: Dissolver 3 ml de clara de ovo com 12 ml de
solução de NaCl 1%. Misturar.
** Preparo da solução saturada de (NH4)2SO4: Dissolva 7,7g de sulfato de amônia
(NH4)2SO4 em 10 ml de água destilada.
c) Procedimento
1. Em um tubo de ensaio, colocar 2 ml da solução de proteínas (clara do ovo);
2. Adicionar, deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2 ml da solução de sulfato de
amônio;
3. Observe. Misture o conteúdo do tubo (por inversão) e anote os resultados.
4. Em um tubo de ensaio, colocar 2 ml da solução de proteínas (clara do ovo);
5. Adicionar, deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2 ml da solução de NaCl 1%.
6. Observe.
2. Precipitação por ação do calor (desnaturação)
a) Reagentes e soluções
- solução de proteínas (solução de clara de ovo)
b) Vidraçaria e instrumental
- Pipeta
- 1 tudo de ensaio
c) Procedimento
1. Colocar 5 ml da solução de clara de ovo em um tubo de ensaio;
2. Deixar o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos (o tubo também pode ser

6. 6
aquecido direto na chama de um bico de Bunsen);
3. Retire o tubo do banho, observe e anote os resultados.
3. Precipitação das proteínas por solventes orgânicos
a) Reagentes e soluções
- solução de proteínas (clara de ovo)
- etanol (CH3CH2OH) 95% gelado
- acetona (CH3COCH3) gelada
- cloreto de sódio (NaCl) sólido
- água destilada
b) Vidraçaria e instrumental
- 04 tubos de ensaio
- pipetas (vidro ou plásticas)
c) Procedimento
OBS: trabalhar a baixa temperatura
1. Tome dois tubos de ensaio e coloque, em cada um, 2 ml da solução de proteínas;
2. Adicionar 4 ml de etanol gelado a cada tubo;
3. Agite;
4. Em um dos tubos, coloque uma pequena quantidade de NaCl sólido, sob agitação;
5. Observe e responda: qual o efeito do álcool sobre a proteína na presença e na
ausência do eletrólito?
6. Adicione 6 ml de água destilada e observe.
7. Repita as etapas anteriores substituindo o etanol por 4 ml de acetona gelada a
cada tubo;
8. Compare os resultados.

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RESULTADOS E DISCURSSÕES
1. Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito de força iônica)
Foi dissolvido 2 ml de clara de ovo com 2 ml de solução de NaCl 1% e
observado. Viu-se que houve homogeneização parcial. Ocorreu precipitação da
albumina, pois em altas concentrações de sais as proteínas precipitam de suas soluções.
Em seguida, foi dissolvido 7,7g de sulfato de amônia (NH4)2SO4 em 10 ml de
água destilada e adicionada tudo de ensaio, onde o composto ficou trifásico com a
albumina no meio, houve precipitação da albumina.
Concluí-se que altas concentrações de sais precipitam proteínas de suas
soluções. Este fenômeno é denominado de salting out ou precipitação por sais. Os sais
desidratam as proteínas, atraindo as moléculas de água do meio, de modo a ficar menos
água disponível para as moléculas proteicas. A solubilidade de uma proteína depende da
quantidade de água disponível ao redor de seus grupos iônicos. Por outro lado, baixas
concentrações de sais podem aumentar a solubilidade de muitas proteínas. É o
fenômeno conhecido como salting in ou solubilização por sais. Isso pode ser explicado
através da interação entre os íons salinos e as cargas iônicas das proteínas, aumentando,
assim, o numero efetivo de cargas e a quantidade de moléculas de água fixadas à
ionosfera proteica. De modo geral, pequenos aumentos da força iônica solubilizam
melhor as proteínas, enquanto que aumentos maiores provocam a precipitação das
mesmas.
2. Precipitação por ação do calor (desnaturação)
Foi colocado 5 ml da solução de clara de ovo em um tubo de ensaio e deixado o
tubo em banho-maria fervente por 5 minutos. Observou-se que a substância ficou densa
e a albumina desnaturou, a desnaturação promove alterações que diminuem a
solubilidade da proteína, levando à sua precipitação.
As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida, da qual dependem
fundamentalmente suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Essa estrutura é
relativamente sensível à ação do calor, que causa desorganização das cadeias peptídicas,
com consequente alteração na sua conformação. Esse fenômeno recebe o nome
de desnaturação, e altera as estruturas quaternária, terciária e secundária da
proteína levando-as até a sua estrutura primária.
A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da proteína,
levando à sua precipitação.
3. Precipitação das proteínas por solventes orgânicos
Em um tubo de ensaio foi inserido 2 ml da solução de proteínas e adicionado 4 ml
de etanol gelado, agitando-o. Colocado uma pequena quantidade de NaCl sólido, sob
agitação. Em seguida, adicionado 6 ml de água destilada. Observou-se que a proteína
precipitou ficando homogênea e densa. O etanol causa o rompimento das interações
fracas, por isso ocorre à precipitação.

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Em um tubo de ensaio foi inserido 2 ml da solução de proteínas e adicionado 4
ml de cetona gelado, agitando-o. Colocado uma pequena quantidade de NaCl sólido,
sob agitação. Em seguida, adicionado 6 ml de água destilada. Observou-se que se
formou um conglomerado de proteínas no fundo do tudo de ensaio.
Solventes orgânicos que têm uma porção hidrofóbica (lipofílica) e uma porção
polar são agentes de precipitação de macromoléculas. Os grupos polares interagem
com grupos polares proteicos em competição com moléculas de água. Os grupos
hidrofóbicos podem romper interações intramoleculares estabilizantes da estrutura da
proteína. Um volume elevado de solvente orgânico reduz a concentração efetiva da
água, deixando menos moléculas de água para hidratação da proteína. Isto é,
modificam a camada de solvatação das proteínas.
A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os
solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na
separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes
podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e
estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação
proteica.

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CONCLUSÃO
Concluí-se que as proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida
que está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na
estrutura tridimensional nativa de uma proteína, com a consequente alteração de suas
propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve alterações nas
estruturas quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas não da primária. A
desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas. A diminuição da
solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que
prejudiquem a interação proteína-água e favoreçam a interação proteína-proteína. A
desnaturação é o evento primário e importante. A floculação e a coagulação, que muitas
vezes são confundidos com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações
visíveis das alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. Existem vários
agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos,
soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc.
Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação protéica, pode-se
citar:diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação
enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia
polipeptídica, alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc. A
precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de
proteínas em solução, também são úteis para proceder a desprotenização de líquidos
biológicos para análise decomponentes não proteicos.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Relatório bioquímica experimental: proteínas. Disponível em:
<http://www.ebah.com.br/content/ABAAABgX4AB/relatorio-bioquimica-
experimental-proteinas> Acessado em: 15/05/2013
Experimento de bioquímica. Disponível em:
<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/precipitacao_protei
nas.htm> Acessado em: 15/05/2013
Proteínas: Reações de coloração e precipitação. Disponível em:
<http://pt.scribd.com/doc/29031871/PROTEINAS-Reacoes-de-coloracao-e-
precipitacao> Acessado em: 15/05/2013
Desnaturação de proteínas. Disponível em:
<http://educador.brasilescola.com/estrategias-ensino/desnaturacao-proteinas.htm>
Acessado em: 15/05/2013
Extração, separação e purificação enzimática. Disponível em:
<http://www.eq.ufrj.br/biose/nukleo/aulas/Enzimol%20Grad/aula8.pdf> Acessado em:
19/05/2013
Proteínas. Disponível em:
<http://www.geocities.ws/laboratoriodebioquimica/index_arquivos/Page929.htm>
Acessado em: 19/05/2013
As proteínas. Classificação, estrutura e propriedades. Disponível em:
<http://www.insumos.com.br/aditivos_e_ingredientes/materias/298.pdf> Acessado em:
19/05/2013