Ventajas del uso de microsatelites en peces

1. CIVA 2003 (http://www.civa2003.org), 1042-1056
La variabilidad microsatélite y sus aplicaciones en la Acuicultura
1,2 2 2 2
Yaisel Juan Borrell , Gloria Blanco , Emilia Vásquez , Jorge Álvarez ,
2 1 3
Hermes Pineda , Georgina Espinosa , Carlos Fernández-Pato , Concha
3 2
Martínez , Jose Antonio Sánchez
1
Dpto. Bioquímica, Universidad de la Habana (Cuba)
2
Dpto. Biología Funcional, Universidad de Oviedo (España)
3
I.E.O. Planta de Experimentación en Acuicultura “El Bocal”, Santander (España)
Resumen Summary
Este trabajo se propone como objetivo general Microsatellites and its applications in Aquaculture
discutir la utilidad de la variación microsatélite en el The main purpose of this paper is a discussion about the
manejo de tres especies con gran interés utility of the microsatellite variation on the management
económico: el salmón atlántico Salmo salar L, el of three species with economic interest: the atlantic
rodaballo Scophthalmus maximus, y el camarón salmon Salmo salar L., the turbot Scophthalmus
blanco Litopenaeus schmitti. Los resultados maximus, and the white shrimp Litopenaeus schmitti.
obtenidos, que forman parte de una tesis de Our results, that constituted part of a Doctoral Thesis
doctorado defendida en la Universidad de Oviedo en presented in 2002 at University of Oviedo, show that
el 2002, demuestran que los loci microsatélites microsatellites present high levels of genetic variation
muestran altos niveles de variabilidad en las and detect genetic differentiation among populations of
poblaciones naturales del camarón blanco que the white shrimp L. schmitti separated only by a few
constituyen el sostén de la acuicultura en Cuba y hundreds of kilometers. These natural populations are
detectan diferenciación genética entre poblaciones the source of broodstocks for aquaculture. We discuss
separadas entre sí solo por pocos kilómetros. Se that those microsatellite loci with minor levels of
discute que los loci microsatélites con niveles de variability are more useful for studies on natural
variabilidad bajos-medios son los más adecuados populations. In the other hand higher variable
para los análisis genéticos de poblaciones naturales. microsatellites are useful tools for the broodstocks
Por otra parte los loci microsatélites con altos niveles management in the atlantic salmon and turbot through
de variabilidad son útiles para el manejo de the establishment of individual pedigrees if the previous
reproductores en las estaciones de cultivo de salmón analysis of genetic variation and genetic relatedness
atlántico y rodaballo a través del establecimiento de among broodstocks, together with the possibility of
pedigríes si además se tienen en cuenta otros appearance of mutation and null alleles, are taken into
factores como lo son: un análisis previo de account. Despite high levels of variability, microsatellite
variabilidad y relaciones genéticas en los alleles related to economic traits in Salmo salar were not
reproductores y la posibilidad de mutaciones y alelos found, however enzymatic heterozigosity is related to
nulos. A pesar de los altos niveles de variabilidad de favorable traits while microsatellite variation exhibited
los microsatélites no se encontró una relación alelos- lacks of correlations, this could support the idea that
caracteres de interés comercial en el cultivo para el enzymes through higher metabolic efficiency enhance
caso del salmón atlántico, no obstante encontramos the individual fitness.
asociación entre la heterocigosidad enzimática y
caracteres favorables, mientras parece no existir
ninguna relación con la heterocigosidad
microsatélite, lo cual podría apoyar la idea de que
las enzimas, a través del control del metabolismo,
juegan un papel fundamental en el incremento de la
eficacia biológica de los individuos.
Introducción
La aplicación de la genética al manejo de poblaciones naturales o cultivadas de especies
marinas ha experimentado en los últimos años un importante incremento a partir de la
utilización de los loci microsatélites (1). Los altos niveles que estos exhiben en cuanto a
polimorfismo y número en los genomas de todas las especies, además de su amplia
distribución en cuanto a localización genómica, han contribuido a que prácticamente en
todos los trabajos que abordan estudios sobre conservación biológica, ecología, conducta,
rendimiento de poblaciones cultivadas, entre otros, hayan sustituido a las enzimas como
marcadores genéticos de elección y hayan sido descritos para casi todas las especies (2).
En este trabajo se analiza la utilidad de esa variación microsatélite en determinados
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1042

2. aspectos concretos que incidirían directamente en la mejora del rendimiento en acuicultura
de especies marinas que presentan un alto valor económico como lo son el salmón atlántico
(Salmo salar L), el rodaballo (Scophthalmus maximus) y el camarón blanco que habita
aguas cubanas (Litopenaeus schmitti). Los aspectos abordados están relacionados con la
aplicación de estudios de parentesco ó la búsqueda de marcadores genéticos relacionados
con caracteres de interés en especies en cultivo y además, con la caracterización de
poblaciones naturales que constituyen la base de la producción por acuicultura en aquellas
especies donde los ciclos de producción no están cerrados, donde fenómenos naturales ó
epidemias destruyen los bancos de reproductores establecidos ó donde el manejo para
generar descendientes y nuevos reproductores ha provocado importantes procesos
endogámicos (3 y 4). Todos los datos se obtuvieron desde 1998 hasta el 2001 durante la
realización de una tesis presentada en opción al Título de Doctor por la Universidad de
Oviedo en el año 2002.
Los microsatélites en poblaciones naturales del camarón blanco
Litopenaeus schmitti
En los loci microsatélites se han encontrado altas tasas de mutación; desde 10-6 en
Drosophila (5) hasta 10-2 en Escherichia coli (6); lo que determina el que aparezca una gran
diversidad alélica en los análisis de poblaciones. Sin embargo, se encuentran loci
microsatélites con niveles de variabilidad bajos, medios y altos y esta característica es de
importancia en el momento de seleccionar que tipo de loci utilizar para abordar una
problemática concreta. De esta forma Hedrick (7) ha sugerido mayor utilidad de los loci
microsatélites con niveles de polimorfismo medios (7-10 alelos) en los análisis de
poblaciones naturales, mientras que en estudios genéticos aplicados al cultivo se
recomiendan mayores niveles de polimorfismo (8 y 9).
La necesidad de loci microsatélites con niveles de variabilidad medios en los análisis
genéticos de poblaciones naturales, parte de la influencia que sobre los resultados tienen
los tamaños de muestras habitualmente utilizados. Así, cuando se analizan 40-50 individuos
por población para loci microsatélites con más de 20 alelos, las frecuencias alélicas
encontradas son bajas aún para los alelos mayoritarios en las poblaciones (ver la Tabla I y
la Figura 1 donde se muestran las zonas de muestreo y los resultados del análisis de
4 poblaciones naturales de camarón blanco con 5 loci microsatélites). La presencia de
muchos alelos en bajas frecuencias en las poblaciones origina contradicciones en algunas
ocasiones entre los resultados obtenidos con muestreos temporales de las mismas
poblaciones, detectándose inestabilidades de frecuencias génicas que no se deben a
cambios genéticos en las poblaciones sino a efectos de muestreo (7 y 10). Lo mismo ocurre
con los constantes hallazgos de deficiencias de heterocigotos para loci con altos niveles de
variabilidad en los análisis de poblaciones naturales (11 y 12).
Estos desequilibrios de Hardy-Weinberg, cuando aparecen en la mayoría de los loci
analizados, pueden deberse también a la utilización de muestras pequeñas en los
experimentos (11). No obstante hay que tener en cuenta que se pueden obtener los mismos
resultados (déficit de heterocigotos) cuando se estudian mezclas de poblaciones ó
poblaciones sub-estructuradas (13) ó cuando en algún locus, en particular, aparecen alelos
nulos (14 y 15). En el caso del camarón blanco el locus Pse028 presenta en todas las
poblaciones estudiadas un déficit significativo de heterocigotos y frecuencias estimadas
para posibles alelos nulos significativamente grandes (0.2209 en la Población Batabanó,
0.2690 en Cienfuegos, 0.1992, en Tunas de zaza y 0.1748 en Manzanillo; Programa Cervus
(13 y 16)), siendo esta la causa que con mayor probabilidad podría atribuirse al
desequilibrio genético que exhiben las poblaciones de L. schmitti (Tabla II).
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1043

3. Tabla I
Frecuencias génicas y parámetros de variabilidad genética en poblaciones naturales de Litopenaeus
schmitti de Cuba al utilizar 5 loci microsatélites
Poblaciones Poblaciones Poblaciones
Alelos BT CF TZ MZ. Alelos BT CF TZ MZ. Alelos BT CF TZ MZ.
Locus Lsch-1 Locus Pse028 Locus Pse036
(n) 42 39 45 39 (n) 40 35 37 33 (n) 39 39 40 33
136 .560 .282 .344 .538 146 .025 .000 .000 .000 134 .000 .013 .000 .000
142 .012 .000 .011 .000 154 .000 .000 .000 .015 136 .013 .000 .000 .000
162 .036 .064 .033 .090 156 .000 .000 .027 .015 138 .000 .013 .000 .000
174 .000 .000 .011 .000 158 .087 .157 .176 .121 140 .013 .000 .013 .015
176 .393 .641 .567 .321 160 .013 .071 .027 .000 142 .051 .013 .013 .015
206 .000 .013 .033 .051 162 .025 .086 .000 .015 144 .090 .026 .050 .030
164 .087 .000 .027 .000 146 .038 .051 .025 .091
Locus Lsch-2 166 .013 .000 .000 .000 148 .051 .115 .063 .061
(n) 35 35 46 38 174 .000 .000 .000 .015 150 .064 .077 .112 .091
206 .000 .014 .000 .000 180 .013 .000 .000 .000 152 .064 .115 .050 .091
208 .000 .014 .011 .000 182 .000 .014 .000 .015 154 .051 .051 .075 .061
209 .014 .000 .011 .000 186 .013 .014 .000 .000 156 .103 .064 .112 .061
210 .200 .257 .228 .211 188 .000 .029 .027 .000 158 .103 .064 .013 .045
211 .000 .029 .011 .039 190 .025 .071 .041 .045 160 .038 .038 .075 .106
212 .071 .014 .054 .026 192 .087 .043 .081 .061 162 .051 .115 .100 .061
213 .000 .029 .054 .000 194 .000 .014 .027 .030 164 .051 .090 .112 .061
214 .657 .614 .620 .697 196 .000 .029 .000 .015 166 .038 .090 .063 .061
215 .057 .029 .011 .026 200 .013 .014 .000 .000 168 .077 .026 .050 .000
202 .000 .000 .014 .015 170 .038 .000 .013 .121
Locus Lsch-3 204 .000 .000 .014 .061 172 .038 .013 .038 .000
(n) 39 34 38 37 206 .025 .000 .014 .015 174 .013 .013 .013 .030
134 .013 .015 .000 .000 208 .063 .000 .000 .015 176 .013 .013 .013 .000
136 .026 .000 .105 .014 210 .112 .014 .054 .030
137 .692 .676 .697 .743 212 .000 .029 .027 .000
138 .141 .162 .118 .122 214 .000 .014 .000 .045
139 .077 .088 .026 .095 216 .050 .043 .081 .045
140 .000 .029 .000 .000 218 .175 .000 .108 .045
143 .051 .029 .053 .027 220 .063 .071 .095 .076
222 .050 .129 .095 .061
224 .000 .057 .027 .152
226 .013 .071 .000 .030
230 .000 .000 .000 .015
250 .013 .000 .027 .030 P0.95 100 100 100 100
252 .013 .014 .014 .000 Na 11.6 11.6 11.6 11.0
254 .013 .014 .000 .015 Ho 0.609 0.653 0.605 0.612
258 .013 .000 .000 .000 He 0.688 0.691 0.696 0.678
BT: Batabanó, CF: Cienfuegos, TZ: Tunas de Zaza, MZ: Manzanillo
Los alelos privados están subrayados y los alelos más frecuentes por locus en cada población aparecen en negritas.
P0.95 : % loci polimórficos.
Na: Número medio de alelos por locus.
Ho: Heterocigosidad media observada.
He: Heterocigosidad media esperada.
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1044

4. Figura 1
Mapa de Cuba con las localizaciones geográficas de las cuatro muestras utilizadas para el estudio de
poblaciones naturales del camarón blanco L. schmitti con 5 loci microsatélites
23N
1
Golfo de Batabanó
Cienfuegos
2
3
Golfo de
21N
Ana María
Golfo de 4
200 km Guacanayabo
84W 81W 78W
78 75W
1. Batabanó, 2. Cienfuegos, 3. Tunas de Zaza (Golfo de Ana María), 4. Manzanillo (Golfo de Guacanayabo)
Tabla II
Desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg (FIS) en poblaciones
naturales de L. schmitti de Cuba al utilizar 5 loci microsatélites.
Poblaciones
Locus Batabanó Cienfuegos Tunas de Zaza Manzanillo
Lsch-1 -0.019 -0.257* -0.065 +0.067
Lsch-2 +0.025 -0.070 +0.192* -0.115
Lsch-3 -0.083 -0.147 +0.037 -0.201*
Pse028 +0.357*** +0.453*** +0.362*** +0.298***
Pse036 +0.108* +0.010 +0.037 +0.161**
*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001
Cuando se intenta comparar composiciones genéticas entre poblaciones utilizando loci
microsatélites con altos niveles de variabilidad, aparecen alelos exclusivos en bajas
frecuencias que son por lo tanto poco útiles para utilizarlos como marcadores genéticos de
población. Este es el caso de la caracterización genética de poblaciones de camarón blanco
llevada a cabo en este trabajo donde se encontraron 13 alelos exclusivos pero todos en
baja frecuencia (un 77% de ellos en los loci Pse028 y Pse036, Tabla I) y lo mismo ha
ocurrido previamente en estudios con salmón atlántico (10 y 17) y en trucha común (18 y
19). Por otra parte el locus Lsch-1 (6 alelos) aparece como el que más contribuye a detectar
diferenciación genética entre poblaciones (5.5%) (FSTtotal=0.012 p<0.001) (Tabla III),
encontrándose una inversión significativa de frecuencias de alelos mayoritarios entre los
grupos de poblaciones Batabanó-Manzanillo y Cienfuegos-Tunas de Zaza (Tabla I). De esta
forma con el número de individuos analizados por población (más de 40 individuos como
media), los loci con niveles de variabilidad medios parecen ser de mayor utilidad en la
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1045

5. caracterización genética de las mismas. La utilización de tamaños grandes de muestras en
los análisis genéticos de poblaciones naturales puede ser un requisito indispensable para
que la alta variabilidad que ostentan loci como Pse028 y Pse036 aporte información
significativamente diferente a la que se puede obtener en caracterizaciones poblacionales
llevadas a cabo con enzimas o con loci microsatélites menos variables y tamaños
muestrales más pequeños, por lo general más accesibles en los estudios genéticos (10).
Tabla III
Diversidad genética total (HT) y su distribución dentro (HS) y
entre muestras (DST) en poblaciones naturales de L. schmitti
de Cuba al utilizar 5 loci microsatélites.
Valores absolutos Valores relativos
Loci HT HS DST HS DST
Lsch-1 0.580 0.548 0.032 0.945 0.055
Lsch-2 0.528 0.524 0.003 0.994 0.006
Lsch-3 0.480 0.477 0.004 0.992 0.008
Pse028 0.940 0.921 0.019 0.980 0.020
Pse036 0.936 0.926 0.011 0.989 0.011
Medias 0.693 0.678 0.014 0.980 0.020
Los loci microsatélites con altos niveles de variabilidad pueden tener sin embargo una
aplicación concreta en algunos aspectos de interés en el manejo de poblaciones naturales.
Tal es el caso del marcaje genético de individuos en especies en peligro de extinción donde
Palsboll y cols. (20) y Cipriano y Palumbi (21) han investigado conductualmente a ballenas
identificadas mediante composiciones genotípicas microsatélites; o en trabajos publicados
sobre conductas de apareamiento en otras especies (22 y 23). Finalmente, en la
adscripción de individuos a poblaciones de origen en las pesquerías la alta variabilidad de
los loci microsatélite juega un papel fundamental (24) y de ahí el interés que los loci Pse028
y Pse036 podrían tener en el caso del camarón blanco L. schmitti (Tabla IV).
Tabla IV
Asignación correcta de individuos a poblaciones naturales de origen
en el camarón blanco L. schmitti utilizando el método Bayesian
(Geneclass) luego del análisis de 5 loci microsatélites (entre
paréntesis el número de muestra por población).
Asignación correcta Muestras
Batabanó 73.9% 42
Cienfuegos 79.5% 39
Tunas de Zaza 73.3% 45
Manzanillo 71.8% 39
Los microsatélites en poblaciones de cultivo de rodaballo y salmón
atlántico
En los estudios genéticos aplicados al cultivo es indispensable utilizar loci microsatélites
con altos niveles de variabilidad. La alta variabilidad y la codominancia permitirían
establecer pedigríes en el cultivo (1 y 13) y además inferir relaciones de parentesco entre
reproductores de los cuales no se conoce su origen, esto último a través de índices que a
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1046

6. partir de la composición genotípica microsatélite, reflejen la similitud genética entre ellos
(Coeficiente de relación genética R (25)). También permitirían implementar programas de
selección genética asistidos por marcadores moleculares (MAS). Actualmente los
cultivadores utilizan el marcaje físico (imposible en edades tempranas) ó el cultivo en
estanques separados de las descendencias (costoso en recursos y espacio) para llevar a
cabo programas de selección; utilizando estas metodologías se han enfrentado a la
creación de sus bancos de reproductores para establecer cultivos estables, ignorando a
veces si desde el mismo punto de partida los individuos de la generación cero están
comprometidos en cuanto a la existencia de relaciones de parentesco entre ellos ó si la
existencia de una ínfima variabilidad genética impedirá posteriormente llevar a cabo una
estrategia de selección genética exitosa.
En este trabajo se llevó a cabo un estudio preliminar de parentesco en salmón atlántico
donde siete loci microsatélites con niveles de variabilidad medios (2-10 alelos) y que han
contribuido significativamente al estudio genético de poblaciones asturianas de la especie
(17, 24 ,26 y 27), aportan muy poco en los estudios de parentesco en un escenario en el
cual las asignaciones de descendientes a parentales tuvieran que realizarse entre altos
números de posibles genitores (las asignaciones de paternidad entre 10 padres candidatos
son correctas en un 80%, pero en las simulaciones con mayor número de padres
candidatos las asignaciones correctas disminuyen hasta un 30-50%). Sin embargo, Norris y
cols. (28) seleccionando ocho loci microsatélites con altos niveles de variabilidad
(10-29 alelos por locus) logran asignaciones correctas de paternidad de más del 95% en la
misma especie y una discriminación absoluta entre individuos emparentados y no
emparentados a través del uso de los coeficientes de relación genética.
Tabla V
Contenido de Información polimórfica para 8 loci microsatélites, reportados con
PIC>0.700 en la literatura, en lotes de reproductores de dos estaciones para el
cultivo del rodaballo.
Estación 1 Estación 2
Locus - a b c d
Smax-01 0.718 0.639 0.582 0.700 0.598
Smax-02 0.537 0.700 0.633 0.740 0.615
Smax-03 0.807 0.614 0.570 0.650 0.599
Sma1-125 0.723 0.606 0.526 0.648 0.432
Sma3-8 0.647 0.532 0.350 0.553 0.321
Sma3-12 0.516 0.480 0.362 0.527 0.355
Sma3-129 0.779 0.625 0.596 0.724 0.605
F1-OCA19 0.723 0.601 0.457 0.593 0.427
PIC(m) 0.681 0.600 0.509 0.642 0.494
He 0.730 0.659 0.583 0.701 0.570
Na 6.88 6.13 5.00 6.75 6.13
n 35 28 25 26 60
a, b, c, d son lotes diferentes de reproductores de la Estación 2
PIC: Contenido de información polimórfica. He: Heterocigosidad esperada. Na: número medio de
alelos por locus. n: número de reproductores analizados.
Para el caso del rodaballo Scophthlamus maximus se seleccionaron, en la literatura, ocho
loci microsatélites descritos con altos niveles de polimorfismo (Contenido de Información
Polimórfica, PIC>0.700) y se ensayó su utilidad en las asignaciones de paternidad y en la
inferencia de relaciones de parentesco entre individuos con origen desconocido en
2 estaciones para el cultivo de la especie (5 lotes de reproductores en total (174 individuos)
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1047

7. y descendencias de 2 de ellos (158 descendientes)). Los resultados obtenidos (Tabla V,
Figuras 2, 3, 4 y 5), confirman la necesidad de altos niveles de polimorfismo para abordar
estudios de parentesco, elemento que a través de simulaciones ya había sido sugerido (1, 8
y 9). No obstante, en este estudio se han encontrado varios elementos, además de la alta
variabilidad genética, que deben ser tenidos en cuenta en este tipo de análisis dentro de las
estaciones de cultivo a partir de que encontramos diferencias significativas entre las
asignaciones correctas esperadas, según las simulaciones basadas en los niveles de
variabilidad genética, y las encontradas al asignar descendientes virtuales generados con el
programa Probmax (29) (Lotes b y d de la Estación 2) ó descendencias reales (Lote a de la
Estación 2) (Figura 2).
Figura 2
Relación entre el Contenido de Información Polimórfica (PIC), el porcentaje de asignación correcta
esperada luego de simulación con frecuencias génicas (Cervus) (I), el porcentaje de asignación
correcta luego de generar con Probmax 200 descendientes virtuales de 25 familias y asignarlos (II) y
finalmente los porcentajes de asignación correcta a ambos parentales encontradas al asignar un total
de 50 (Estación 1) y 108 descendientes de rodaballo (Estación 2a) a partir de los genotipos para 8
loci microsatélites (III).
81,2
76,2
0,681 75,1
69,5 71,5 70,5
0,642
65,5
0,600 59
0,509
0,475
38,9 40,5 38,7
6,5
PIC I II III
Estación 1 Estación2(c ) Estación 2(a) Estación 2(b) Estación 2(d)
Figura 3
Relación entre la asignación correcta a parentales luego de asignar descendientes
virtuales generados con el programa Probmax y el PIC y número medio de alelos (Na) en 5
lotes de reproductores de rodaballo luego del análisis con 8 loci microsatélites.
100 b=319,65 F=20,070 p=0,021* 100 b=24,12 F=34,240 p=0,010*
80 1 80 1
% asignación correcta
% asignación correcta
A A
C
60 60 C
40 B 40 B
20 20
D D
0 0
.4 .5 .6 .7 4.0 5.0 6.0 7.0
PIC Número de alelos
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1048

8. Figura 4
Relación entre la asignación correcta a parentales de individuos generados con Probmax y los
porcentajes de individuos no emparentados según r ≤ 0 en 5 lotes de reproductores para el cultivo
del rodaballo luego del análisis con 8 loci microsatélites. a) considerando las relaciones genéticas
entre todos los reproductores. b) considerando las relaciones genéticas entre las hembras.
c) considerando las relaciones genéticas entre los machos.
100
b=4,35 F=0,870 p=0,419 a 100
b=6,42 F=11,870 p=0,041* b 100
b=-1,29 F=0,350 p=0,596 c
1 1 1
% asignación correcta
80 80 80
% asignación correcta
A
A
% asignación correcta
A C C
60 C 60 60
40 40 B 40 B
B
20 20 20
D D D
0 0 0
45 50 55 60 30 35 40 45 45 50 55 60 65 70
% individuos no emparentados % individuos no emparentados (hembras) % individuos no emparentados (machos)
Nota: Las hembras son los parentales más emparentados entre sí según r ≤ 0 entre ellas en los 5 lotes de reproductores
estudiados.
Figura 5
Distribución de coeficientes de relación genética y medias (± D.E) por tipo de parentesco en
descendientes de dos estaciones para el cultivo del rodaballo (8 loci microsatélites). a) Estación 1. b)
Estación 2 (lote A). (Por debajo de r ≤ 0 o de r < r (media de los individuos no relacionados) el 100%
(Estación 1) y 71% (Estación 2) de los individuos encontrados son efectivamente individuos no
relacionados).
14 %
12
r≤0
100% no relacionados 10
8
r≤r(m) (no relac.) 6
100% no relacionados 4
2
0
(r )
05
15
25
35
45
55
65
75
85
95
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
,9
,8
,7
,6
,5
.4
.3
.2
.1
.0
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
h. completos r(m)=+0,4885±0,1657 no relac. r(m)=-0,0782±0,2271
b)
14 %
r≤0
12
71% no relacionados
10
r≤r(m) (no relac.) 8
71% no relacionados 6
4
2
0
(r )
05
15
25
35
45
55
65
75
85
95
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
,9
,8
,7
,6
,5
.4
.3
.2
.1
.0
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
-0
h. comple tos r(m)=+0,4898±0,2356 me dios he rmanos r(m)=+0,0220±0,3481
no re l ac. r(m)=-0,0824±0,3126
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1049

9. La composición genética de los lotes de reproductores constituye un factor de importancia
para las asignaciones de paternidad. Nótese que utilizando el mismo conjunto de loci
microsatélites se encuentran niveles de variabilidad dispares en los lotes de reproductores
analizados, lo que determina que los resultados de asignación entre ellos sean también
dispares (Figura 2). Esta amplia variación encontrada en cuanto a asignaciones correctas,
está relacionada con la variabilidad genética en los lotes de reproductores analizados
(promedios de PIC y números de alelos) (Tabla V, Figuras 2 y 3) y además con la
composición en cuanto a similitudes genéticas entre reproductores de los mismos sexos
dentro de cada uno de los lotes de reproductores, en este caso con las hembras que
aparecen siempre como los parentales más relacionados genéticamente (Figura 4). Los
lotes de reproductores b y d de la Estación 2 son aquellos donde existe una mayor relación
genética entre las hembras de cada lote y por ello se dificulta la asignación y se observan
discrepancias entre las asignaciones correctas observadas y las esperadas a partir de las
simulaciones hechas sobre la base de los niveles de variabilidad genética (Figura 2). Estos
resultados sugieren que cada lote de reproductores representa por lo tanto una entidad
única con características peculiares en lo que se refiere a su composición genética, la cual
dependerá del origen de los individuos que lo componen (poblaciones naturales de
procedencia), ciclos de cultivo que hayan experimentado y tipo de manejo establecido para
obtenerlos. Por lo tanto es necesario identificar dentro de un conjunto amplio de loci
microsatélites, seleccionados en la literatura en función de sus altos niveles de variabilidad,
cuales funcionan mejor en cada lote de reproductores a través de un estudio previo en el
cual los elementos mencionados (PIC, número de alelos y relaciones genéticas entre
reproductores, en general y por sexos) sean los criterios de selección. Puede ocurrir que
determinados lotes de reproductores exhiban muy bajos niveles de variabilidad microsatélite
con todos los loci ensayados debido a que los individuos que los componen están muy
emparentados (el Lote d de la Estación 2 es un ejemplo). En esas condiciones sería
recomendable sugerir a los productores una renovación de este lote de reproductores
utilizando individuos disponibles en otros lotes dentro de la misma estación ó con individuos
procedentes de otras estaciones y con orígenes diferentes, antes de implementar un
manejo “asistido” por marcadores genéticos donde la alta variabilidad genética es condición
indispensable.
El diseño del estudio de parentesco llevado a cabo en rodaballo donde se analizan
progenitores y descendientes y se conoce además el origen de todos los descendientes
(sólo Norris y cols. han publicado un diseño equivalente (28)), ha permitido identificar
además de la importancia que tiene la composición genética de los lotes de reproductores,
otros elementos que también afectan a la capacidad de asignación de los loci microsatélites
y las inferencias que se hacen a través de los coeficientes de relación genética sobre las
relaciones de parentesco entre individuos con origen desconocido: la aparición de
mutaciones y de alelos nulos (14 y 15).
En el trabajo con progenitores y descendientes de la Estación 2 para el cultivo en rodaballo
(Lote a) se encontró una tasa de mutación de 10-4 (1 mutación en las 1 264 meiosis
estudiadas), tasa que se encuentra dentro de los rangos descritos para la variación
microsatélite (30). Esto determinaría que sólo uno de cada 10 000 individuos no se podría
asignar a ningún parental, en el caso de que la mutación produjese un alelo nuevo que no
se encuentra en el lote de reproductores, ó sería mal asignado si el cambio es hacia uno de
los alelos ya existentes. Sin embargo, los errores de asignación que podrían cometerse
debido a la presencia de alelos nulos constituyen un elemento de mayor importancia, en
nuestro caso un 70% de los descendientes de un reproductor que portaba un alelo nulo en
el Lote a de la Estación 2 fueron mal asignados en el estudio llevado a cabo en rodaballo.
Considerar la posibilidad de que en un estanque de cría donde se han mezclado
descendientes, un reproductor que porta un alelo nulo sea responsable de una contribución
importante de gametos y por ello las inferencias basadas en los datos microsatélites sean
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1050

10. significativamente erróneas, debe ser una responsabilidad a asumir por parte de los
responsables de cada programa genético en una estación de cultivo. Solo un elemento
podría parcialmente ayudar a resolver esta problemática y está relacionado con evitar la
utilización de loci microsatélites que exhiban, en particular, un déficit significativo de
heterocigotos. No obstante, en una situación en la cual todos o casi todos los microsatélites
ensayados exhiban déficits significativos de heterocigotos en los reproductores es probable
que estemos en presencia de una mezcla importante de acervos génicos diferentes (efecto
Wahlund, muy frecuente en las estaciones de cultivo de peces) y no ante una evidencia de
alelos nulos, lo cual podría comprobarse investigando el origen de los reproductores, si es
que está disponible (13).
El uso de los coeficientes de relación genética como herramienta para la selección
adecuada de parejas de reproductores en las estaciones cuando se desconoce el origen
(pedigrí) de los mismos, es un método que contribuiría a evitar la endogamia en las
estaciones de cultivo. Doyle y cols. (31) han demostrado que un número mínimo de los
reproductores utilizados en una estación, pueden acumular casi toda la diversidad alélica y
heterocigosidad del conjunto de genes de los parentales. En este estudio comprobamos
que realmente estos coeficientes se comportan tal y como predice la teoría para cada uno
de los tipos de parentesco que estaban disponibles, y también que se pueden establecer
ciertos “valores de corte” para los coeficientes de relación genética (ej.: r ≤ 0), que
demuestran tener niveles aceptables de confidencia a la hora de identificar a individuos no
relacionados (Figura 5).
Teniendo en cuenta los elementos previamente mencionados es muy probable que en el
caso del rodaballo se pueda establecer, en la práctica, un programa que utilizando un
número mayor de loci microsatélites ó sustituyendo algunos de los que por sus niveles de
variabilidad en los lotes de reproductores analizados no son convenientes, revierta en un
mejor rendimiento productivo de las estaciones de cultivo con las que se ha trabajado.
Los loci microsatélites y su asociación con caracteres favorables
para el cultivo
El otro elemento mediante el cual se espera que la alta variación microsatélite constituya
una herramienta de importancia en el cultivo de especies marinas es en la selección
asistida. Existen expectativas referidas a la posibilidad de encontrar alelos microsatélites
marcadores que estén relacionados con caracteres de interés comercial en numerosas
especies debido al alto polimorfismo que exhiben y a su distribución ubicua en los
cromosomas (1, 32 y 33). En este trabajo se abordó este enfoque en el salmón atlántico
analizando 257 individuos con 8 loci microsatélites, no obstante, no se encontró una
relación entre los alelos microsatélites y ninguno de los caracteres de interés estudiados
(sexo, momento de la primera alimentación activa, estadio fisiológico, talla y peso).
Danzmann y cols. (34), Jackson y cols. (35), y además Streelman y Kocher (36) han
encontrado marcadores microsatélites relacionados con la tolerancia a la temperatura en
familias de trucha común y con la expresión de prolactina en tilapia, respectivamente. No
obstante, se necesita probar muchos marcadores moleculares y un esfuerzo común de
varios equipos de investigación, tal y como ocurre en los proyectos sobre mapas genéticos
de algunas especies (37), para obtener resultados satisfactorios en este objetivo. De esta
forma es posible localizar la mayor cantidad posible de marcadores genéticos en el genoma
(no solo microsatélites, sino también otros marcadores de ADN muy variables) para
relacionarlos posteriormente con caracteres de interés económico. Por lo tanto es de
esperar que los loci microsatélites sean útiles en este empeño, pero sólo a través de este
enfoque amplio que comprenda la elaboración de un mapa genético de salmón. A pesar de
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1051

11. que no se encontraron en nuestro trabajo alelos marcadores microsatélites, ni enzimáticos,
si se observaron diferencias entre ambos tipos de marcadores en cuanto a las asociaciones
entre heterocigosidad y eficacia biológica.
En este trabajo se encontraron asociaciones positivas entre la heterocigosidad enzimática y
el momento de la primera alimentación activa (correlacionado con la eficacia biológica) (38,
39 y 40), la talla y el peso de los peces mientras ese tipo de asociaciones no existen al
considerar la heterocigosidad microsatélite; también los individuos más heterocigotos para
las alozimas son menos asimétricos, mientras no se encuentra relación entre la
heterocigosidad microsatélite y la asimetría (Tablas VI y VII) (la eficacia biológica y la
estabilidad del desarrollo han sido correlacionadas desde los estudios de Lerner en 1954
(41)). Estos resultados se implican en un extenso e histórico debate entre neutralismo y
seleccionismo para explicar el porque se encontraban correlaciones entre heterocigosidad
enzimática y eficacia biológica y sus consecuencias para el cultivo de especies acuícolas, a
partir de que las variantes solo representen polimorfismos transientes de alelos neutrales ó
variantes alélicas que por sí mismas implican ventajas adaptativas para los individuos (42 y
43).
Tabla VI
Heterocigosidad y caracteres morfológicos en salmones con diferentes momentos
de alimentación activa
Salmones Salmones
tempranos tardíos F
Nº de individuos por muestra 141 116
He 0.189 0.145 6.11*
Hµ 0.488 0.497 0.14 ns
Asimetría Global 0.8481 1.1849 3.01 ns
Nº de caracteres asimétricos (media) 0.6424 0.8451 3.97*
Talla (cm) 41.58 26.52 39.94***
Peso (g) 15.21 12.50 34.18***
He = heterocigosidad enzimática (MDH-3,4*, mMEP-2*, IDHP-3*, sAAT-4*, IDDH-1* e IDDH-2*).
Hµ = heterocigosidad microsatélite (SsaF43, SsaD30, Ssa2019, Ssa1337, SSOSL311, SSOSL417, Str543 y
Str15).
Asimetría Global: Calculada como la suma de los valores de asimetría (A) de tres caracteres morfométricos
(radios de las aletas pélvicas y pectorales, y número de branquiespinas) corregidas mediante normalización,
al dividir por la media de cada carácter en cada población.
*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ns: No significativo.
Tabla VII
Relación entre la heterocigosidad y caracteres de interés en el cultivo de salmón
atlántico. En paréntesis el número de individuos por muestra.
Salmones tempranos (141) Salmones tardíos (116)
Asimetría global Talla (cm) Peso (g) Asimetría global Talla (cm) Peso (g)
He b = -0.546*** τ = +1.000*** τ = +0.333*** b = -1.021*** τ = +1.000*** τ = +1.000***
Hµ b = +0.323 τ = +0.200 τ = +0.467 b = +0.178 τ = -0.810* τ = -0.905**
b: Coeficiente de regresión lineal; τ: Coeficiente de rangos de Kendall; He, Hµ y Asimetría Global: Ver tabla VI.
*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ns: No significativo.
Este tipo de experimentos (relaciones entre heterocigosidad de marcadores enzimáticos y
de ADN con caracteres relacionados con la eficacia biológica) han sido sugeridos como una
forma válida de demostrar la hipótesis de la sobredominancia asociativa como base de las
asociaciones observadas en multitud de organismos (42, 43, 44 y 45), es decir si las
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1052

12. asociaciones eficacia biológica-heterocigosidad enzimática son una consecuencia de
desequilibrios de ligamiento entre los loci enzimáticos y genes deletéreos, se espera que
también los loci microsatélites, con distribuciones ubicuas en los genomas (32 y 33),
aparezcan en desequilibrio con estos genes. Nuestros resultados contradicen los
presupuestos de la hipótesis de la sobredominancia asociativa; el momento de la primera
alimentación activa, la estabilidad del desarrollo (simetría), la talla y el peso de los
individuos muestran asociaciones significativas y positivas con la heterocigosidad
enzimática y no aparecen asociaciones consistentes con la heterocigosidad microsatélite.
Este experimento parece sugerir como alternativa que las enzimas y los loci microsatélites
son diferencialmente afectados por la selección natural y que posiblemente los loci
enzimáticos, a través del control de las reacciones metabólicas, juegan un papel fundamental
en el incremento de la eficacia biológica de los individuos. Al menos otros dos resultados
publicados parecen reforzar esta hipótesis: Zouros y Pogson trabajando con juveniles de
Placopecten magellanicus, que exhiben correlaciones positivas y significativas entre la
heterocigosidad enzimática (7 loci) y la tasa de crecimiento, no encuentran correlación alguna
con la heterocigosidad de marcadores de ADN (42) y Thelen y Allendorf en un estudio con
Oncorhynchus mykiss utilizando 10 loci enzimáticos y 10 loci microsatélites, obtienen
resultados similares a los nuestros y llegan a la misma conclusión (45).
No obstante, de la misma forma en que en varios experimentos se ha fallado en el intento
de demostrar la hipótesis de la sobredominancia asociativa, la sobredominancia directa de
las enzimas ha sido demostrada en muy contadas ocasiones en experimentos donde se ha
apreciado directamente ventajas selectivas de los individuos heterocigotos frente a los
homocigotos. Tal es el caso del polimorfismo de la alcohol deshidrogenasa en salamandra,
que a través de los niveles de oxígeno produce variaciones en crecimiento y supervivencia,
o del polimorfismo en la glicerato deshidrogenasa asociado en plantas al crecimiento y a la
viabilidad en sitios secos (43). De esta forma los resultados obtenidos aquí deben ser
interpretados exclusivamente como un experimento en el cual no se ha podido demostrar la
hipótesis de la sobredominancia asociativa, pero no como una confirmación de la hipótesis
de la sobredominancia directa, objetivo para el que se necesitaría un enfoque distinto al
abordado en este trabajo.
Conclusiones
• Los loci microsatélites muestran mayores niveles de variabilidad que los encontrados
con enzimas en los estudios con poblaciones naturales del camarón blanco Litopenaeus
schmitti, y detectan diferenciación genética entre poblaciones cercanas
geográficamente. En estos estudios los loci microsatélites con niveles de variación
“medios” resultan ser los de mayor utilidad.
• Los loci microsatélites con altos niveles de variación son útiles en el diseño del manejo
de reproductores en programas de cultivo del rodaballo Scophthlamus maximus a través
de estudios de parentesco aunque es imprescindible tener en cuenta los siguientes
elementos:
- La variabilidad de los loci microsatélites en los reproductores y relaciones genéticas
existentes entre los reproductores (PIC, heterocigosidad y número de alelos,
coeficientes de relación genética en general y por sexos).
- La posibilidad de mutaciones y presencia de alelos nulos.
• A pesar de la alta variación que exhiben los loci microsatélites es difícil encontrar
asociaciones entre alelos, ó composiciones genotípicas, y caracteres favorables para el
II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1053

13. cultivo del salmón atlántico. Las asociaciones existentes entre los niveles de
heterocigosidad enzimática y momento del inicio de la alimentación activa, estabilidad
del desarrollo, talla y peso de los individuos, no se observan al considerar los niveles de
heterocigosidad microsatélite. Estos resultados apoyan la idea de que las enzimas y los
microsatélites son diferencialmente afectados por la selección natural y que los loci
enzimáticos, posiblemente a través del control de las reacciones metabólicas, juegan un
papel fundamental en el incremento de la eficacia biológica.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Servicio de Recursos Naturales y Protección Ambiental de la
Consejería de Medio Ambiente del Principado de Asturias y al Instituto Español de
Oceanografía por su colaboración.
Y. Borrell y H. Pineda disfrutaban de una beca AECI durante la realización de este trabajo.
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