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1.
Université Joseph Fourier
- Grenoble I Sciences et GĂ©ographie THESE Soutenue publiquement par Didier FILOPON le 21 dĂ©cembre 2005 pour obtenir le grade de DOCTEUR DE LâUNIVERSITE JOSEPH FOURIER â GRENOBLE I Discipline : Virologie, Microbiologie, Immunologie - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - MĂ©canismes de rĂ©gulation impliquĂ©s dans la pathogĂ©nicitĂ© de Pseudomonas aeruginosa : SystĂšme de SĂ©crĂ©tion de Type III, EpigĂ©nĂšse et Quorum Sensing - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Composition du Jury Professeur D. Schneider PrĂ©sident Professeur B. Guery Rapporteur Docteur A. Filloux Rapporteur Professeur D. Haas Examinateur Professeur J. Guespin-Michel Co-directeur de thĂšse Professeur B Polack Co-directeur de thĂšse ThĂšse prĂ©parĂ©e au Groupe de Recherche et dâEtude du Processus Inflammatoire - GREPI EA 2938 / CHU Grenoble et au Laboratoire de Microbiologie Du Froid â LMDF EA 2123 / Evreux
2.
Université Joseph Fourier
- Grenoble I Sciences et GĂ©ographie THESE Soutenue publiquement par Didier FILOPON le 21 dĂ©cembre 2005 pour obtenir le grade de DOCTEUR DE LâUNIVERSITE JOSEPH FOURIER â GRENOBLE I Discipline : Virologie, Microbiologie, Immunologie - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - MĂ©canismes de rĂ©gulation impliquĂ©s dans la pathogĂ©nicitĂ© de Pseudomonas aeruginosa : SystĂšme de SĂ©crĂ©tion de Type III, EpigĂ©nĂšse et Quorum Sensing - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Composition du Jury Professeur D. Schneider PrĂ©sident Professeur B. Guery Rapporteur Docteur A. Filloux Rapporteur Professeur D. Haas Examinateur Professeur J. Guespin-Michel Co-directeur de thĂšse Professeur B Polack Co-directeur de thĂšse ThĂšse prĂ©parĂ©e au Groupe de Recherche et dâEtude du Processus Inflammatoire - GREPI EA 2938 / CHU Grenoble et au Laboratoire de Microbiologie Du Froid â LMDF EA 2123 / Evreux
3.
4.
à Andrée et
Firmin
5.
6.
Je tiens tout
dâabord Ă remercier Madame le professeur Françoise Morel et Madame le professeur Nicole Orange qui ont acceptĂ© de mâaccueillir au sein de leur laboratoire respectif. Un grand merci au professeur BenoĂźt Polack pour son encadrement, sa patience et pour lâensemble du savoir pratique et thĂ©orique quâil mâa transmis. JâespĂšre quâil nâaura pas trop souffert de mon flegme lĂ©gendaire et je nâoublierai pas « quâĂ faire et Ă refaire on nâest jamais sans rien faire »⊠Un grand merci Ă©galement au professeur Janine Guespin pour sa patience, lâensemble du savoir quâelle mâa transmis et pour mâavoir fait dĂ©couvrir et apprĂ©cier un nouvel aspect de la microbiologie. Merci au docteur Annabelle MĂ©rieau pour son encadrement, sa gentillesse, le partage de ses connaissances et pour mâavoir aidĂ© Ă rapidement mâintĂ©grer Ă lâĂ©quipe du LMDF. Je tiens aussi Ă remercier Monsieur le professeur Dominique Schneider pour avoir acceptĂ© la prĂ©sidence de ce jury de thĂšse. Jâadresse mes remerciements aux professeurs Dieter Haas et BenoĂźt Guery ainsi quâau docteur Alain Filloux pour mâavoir fait lâhonneur de juger ce travail. Pour leurs conseils, leur soutien et les moments que nous avons partagĂ©s, jâadresse un grand merci aux membres du GREPI et du LMDF, en particulier Ă Lauriane, DaniĂšle, Mariette, Nico, lâĂ©quipe PetâRoll, GaĂ«lle R et surtout GaĂ«lle H. Je remercie lâensemble du personnel du laboratoire dâenzymologie et dâhĂ©matologie de mâavoir si rapidement intĂ©grĂ© au sein de leur Ă©quipe. Enfin et surtout, je voudrais adresser plus quâun grand merci Ă mes parents qui ont toujours Ă©tĂ© lĂ pour moi et sans qui tout cela nâaurait pas Ă©tĂ© possible.
7.
8.
Abréviations ADN Acide désoxyribonucléique ADP
AdĂ©nosine diphosphate ApR RĂ©sistance Ă lâampicilline ARN Acide ribonuclĂ©ique ATP AdĂ©nosine triphosphate CatR RĂ©sistance au chloramphĂ©nicol CbR RĂ©sistance Ă la CarbĂ©nicilline CDO CatĂ©chol DioxygĂ©nase DMSO DimĂ©thylsulfoxyde dNTP mĂ©lange de nuclĂ©otides triphosphates (ATP, GTP, CTP, TTP) DO DensitĂ© Optique DR Double Recombinant EGTA Acide Ă©thylĂšne glycol-bis(ÎČ-aminoĂ©thy Ă©ther) N,N,N',N'-tĂ©tra-acĂ©tique EHEC Escherichia coli entĂ©rohĂ©moragique EPEC Escherichia coli entĂ©ropathogĂšne GFP Green Fluorescent Protein GmR RĂ©sistance Ă la Gentamicine GTP Guanosine triphosphate HBSm "Hepes Buffer Saline" modifiĂ© Hepes Acide hydroxyĂ©thyl-pipĂ©razine-Ă©thane-sulfonique IPTG isopropyl-beta-D-thigalactopyranoside kDa KiloDaltons KmR RĂ©sistance Ă la kanamycine LB Milieu Luria Bertani LDH Lactate DĂ©hydrogĂ©nase MOI Multiplicity of infection Pb Paires de bases PBS Tampon phosphate isotonique "Phosphate Buffer Saline" PCA Acide perchlorique PCR "PolymĂ©rase chain reaction" PIA Pseudomonas isolation agar
9.
PNN Polynucléaires neutrophiles p/v
Poids pour volume qsp Quantité suffisante pour RLU Unité de luminescence relative rpm Rotations par minute SDS Sodium dodécyl sulfate SDS-PAGE ElectrophorÚse en gel de polyacrylamide en présence de SDS SR Simple Recombinant SSTT SystÚme de sécrétion de type III TAE Tampon "Tris-acétate-EDTA" TBE Tampon "Tris-borate-EDTA" TCA Acide trichloroacétique TcR Résistance à la Tétracycline TE Tampon "Tris-EDTA" Tris Tris(hydroxylméthyl)aminométhane U Unité enzymatique UV Ultraviolets v/v Volume pour volume VB Milieu Vogel Bonner
10.
Table des matiĂšres INTRODUCTION.......................................................................................................
1 I. Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 3 I-A. CaractĂ©ristiques........................................................................................ 3 I-B. Un pathogĂšne opportuniste....................................................................... 3 I-C. Les facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa .......................... 5 II. Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type III ............................................................... 12 II-A. Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de Type III de P. aeruginosa........................... 13 II-B. La rĂ©gulation du SSTT chez les autres bacilles pathogĂšnes Ă Gram nĂ©gatif................................................................................................................ 27 III. Le Quorum Sensing ................................................................................... 35 III-A. GĂ©nĂ©ralitĂ©s.......................................................................................... 35 III-B. Le quorum sensing chez P. aeruginosa.............................................. 41 IV. EpigenĂšse .................................................................................................. 48 IV-A. LâĂ©pigenĂšse chez les bactĂ©ries : Lâexemple de lâopĂ©ron lactose chez E. coli 49 IV-B. PrĂ© requis pour lâĂ©pigĂ©nĂšse et utilitĂ© de la modĂ©lisation ..................... 51 MATERIELS ET METHODES .................................................................................. 53 I. Plasmides et Souches bactĂ©riennes.............................................................. 55 I-A. La souche de rĂ©fĂ©rence du laboratoire : CHA......................................... 56 I-B. Culture bactĂ©rienne ................................................................................ 57 I-C. Antibiotiques utilisĂ©s ............................................................................... 58 I-D. Suivi de croissance et densitĂ© bactĂ©rienne............................................. 58 I-E. Conservation des souches...................................................................... 58 II. Techniques de biologie molĂ©culaire............................................................... 59 II-A. Purification des acides nuclĂ©iques.......................................................... 59 II-B. PrĂ©paration dâADN plasmidique dâE. coli ................................................ 60 II-C. PrĂ©paration dâADN chromosomique de P. aeruginosa ........................... 60 II-D. PrĂ©paration dâARN de P. aeruginosa...................................................... 61 II-E. ElectrophorĂšse dâADN ............................................................................ 61 II-F. Manipulation des fragments dâADN ........................................................ 62 II-G. Technique de retard sur gel (Electrophoretic Mobility Shift Assay - EMSA) 64 II-H. Clonage .................................................................................................. 66
11.
II-I. Transformation........................................................................................ 67 II-J.
MutagenĂšse par Ă©change allĂ©lique chez Pseudomonas aeruginosa...... 68 III. Culture cellulaire......................................................................................... 71 III-A. Interaction des bactĂ©ries avec des polynuclĂ©aires neutrophiles.......... 71 IV. ExpĂ©rimentation animale............................................................................ 72 V. Techniques de biochimie ............................................................................... 73 V-A. PrĂ©paration des Ă©chantillons................................................................... 73 V-B. Dosage de lâactivitĂ© enzymatique CatĂ©chol DioxygĂ©nase (CDO) ........... 74 V-C. ElectrophorĂšse SDS-PAGE................................................................. 75 V-D. Analyse des protĂ©ines......................................................................... 75 V-E. Mesure de lâactivation transcriptionnelle des gĂšnes du SSTT ................ 77 V-F. Analyse du surnageant de culture bactĂ©rien........................................... 78 PRESENTATION DU TRAVAIL................................................................................ 79 RESULTATS ............................................................................................................ 83 I. Acquisition dâune cytotoxicitĂ© dĂ©pendante du SSTT par un mĂ©canisme Ă©pigĂ©nĂ©tique ......................................................................................................... 85 I-A. ModĂ©lisation de la rĂ©gulation du SSTT................................................... 87 I-B. DĂ©monstration expĂ©rimentale de la modification Ă©pigĂ©nĂ©tique pour lâacquisition dâun SSTT inductible...................................................................... 91 II. RĂ©gulation de lâexpression du SystĂšme de SĂ©crĂ©tion de Type III................ 103 II-A. RĂŽle de la densitĂ© cellulaire.................................................................. 104 II-B. RĂŽle du quorum sensing dans la rĂ©gulation nĂ©gative du SSTT ............ 113 II-C. CaractĂ©risation du PARST.................................................................... 122 II-D. Autres partenaires de la rĂ©gulation du SSTT........................................ 124 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ................................................................... 127 BIBLIOGRAPHIE.................................................................................................... 137 ANNEXES .............................................................................................................. 155 ARTICLE 1 ............................................................................................................. 157
12.
Introduction 1 INTRODUCTION
13.
Introduction 2
14.
Introduction 3 I. Pseudomonas aeruginosa I-A.
CaractĂ©ristiques Pseudomonas aeruginosa est un bacille Ă Gram nĂ©gatif, mobile, capable de se dĂ©velopper dans un large spectre de tempĂ©ratures (+4°C Ă +42°C). AĂ©robie, cette bactĂ©rie peut cependant utiliser les nitrates comme accepteur dâĂ©lectrons en croissance anaĂ©robie. P. aeruginosa vit Ă lâĂ©tat saprophyte dans lâeau, le sol et sur les plantes. Dans son environnement naturel, P. aeruginosa peut ĂȘtre trouvĂ©e sous sa forme planctonique, mobile ou dans un biofilm, attachĂ©e Ă une surface inerte ou une source de substrat. Le gĂ©nome de P. aeruginosa a Ă©tĂ© entiĂšrement sĂ©quencĂ© en 2000. Il sâagit dâun des plus grand gĂ©nome bactĂ©rien connu avec 6,3 mĂ©ga bases codant 5570 cadres de lectures (Stover et al., 2000). Cette bactĂ©rie possĂšde un nombre important de gĂšnes impliquĂ©s dans des systĂšmes de rĂ©gulation et des fonctions mĂ©taboliques. Cette diversitĂ© lui confĂšre la capacitĂ© dâutiliser un grand nombre de composĂ©s organiques et ainsi de se dĂ©velopper dans de nombreuses niches Ă©cologiques mĂȘme pauvres en nutriments. I-B. Un pathogĂšne opportuniste P. aeruginosa est un pathogĂšne opportuniste capable dâinfecter un large spectre dâhĂŽtes : hommes, animaux, plantes (D'Argenio et al., 2001;Pukatzki, Kessin, et Mekalanos, 2002;Rahme et al., 1995). Chez lâhomme, cette bactĂ©rie affecte particuliĂšrement les personnes immunodĂ©primĂ©es, les grands brĂ»lĂ©s, les patients en soins intensifs ou atteints de la mucoviscidose. Elle est capable de coloniser une grande diversitĂ© de tissus provoquant, entre autres, des bactĂ©riĂ©mies, ou des infections oculaires, intestinales, ou urinaires. P. aeruginosa est Ă©galement capable de causer des mĂ©ningites et ostĂ©omyĂ©lites en infectant le systĂšme nerveux central et les structures osseuses.
15.
Introduction 4 I B-1. Pseudomonas
aeruginosa et la mucoviscidose P. aeruginosa est aussi une des causes majeures de mortalitĂ© et de morbiditĂ© chez les personnes atteintes de mucoviscidose (Govan et Harris, 1986). Cette maladie hĂ©rĂ©ditaire autosomique rĂ©cessive a pour origine la mutation dâune protĂ©ine membranaire, CFTR (Cystic Fibrosis Transconductance Regulator), qui joue un rĂŽle dans la rĂ©gulation des Ă©changes ioniques des cellules avec le milieu extĂ©rieur. Sur le plan pulmonaire, lâabsence ou le dysfonctionnement de cette protĂ©ine provoque un changement de la composition ionique et une diminution de lâhydratation du mucus bronchique. Ce mucus plus visqueux perturbe le phĂ©nomĂšne de clairance ciliaire et constitue un terrain plus propice Ă la colonisation bactĂ©rienne (Lyczak, Cannon, et Pier, 2002;Ratjen et Döring, 2003). Les patients atteints de mucoviscidose dĂ©veloppent une infection pulmonaire chronique conduisant Ă une destruction des tissus pulmonaires par les toxines bactĂ©riennes et le relargage du contenu des granules des cellules phagocytaires. Un modĂšle de pathogĂ©nicitĂ© suggĂšre deux phases dâinfection : lâinvasion puis la persistance. Lors de lâinvasion initiale du poumon, P. aeruginosa exprime une grande quantitĂ© de facteurs de virulence neutralisant les dĂ©fenses immunitaires innĂ©es de lâhĂŽte. Ensuite, durant la seconde phase, une fois la zone colonisĂ©e, la bactĂ©rie adhĂšrerait Ă lâĂ©pithĂ©lium et adopterait un phĂ©notype mucoĂŻde. Elle se dĂ©veloppe alors sous forme de micro-colonies entourĂ©es dâun biofilm composĂ© notamment dâun oligosaccharide, lâalginate. Sous cette forme, P. aeruginosa est plus rĂ©sistante face aux dĂ©fenses de lâhĂŽte et aux antibiotiques. La colonisation de la totalitĂ© des poumons se ferait ensuite de proche en proche par ressortie dâindividus du biofilm et rĂ©activation du cycle dâinvasion-persistance avec expression de facteurs de virulence. Aujourdâhui, Ă cotĂ© des thĂ©rapies consistant Ă diminuer lâinoculum bactĂ©rien par des cures dâantibiotiques rĂ©pĂ©titives, les traitements en dĂ©veloppement sâorientent vers deux axes. Ils tentent de perturber ou de dĂ©truire le biofilm pour Ă©liminer les colonies dĂ©jĂ installĂ©es. En parallĂšle, ils visent Ă diminuer la cytotoxicitĂ© de la bactĂ©rie lors des phases aiguĂ«s de lâinfection. Cette derniĂšre approche passe par la rĂ©pression de lâexpression des gĂšnes codant les diffĂ©rents facteurs de virulence sĂ©crĂ©tĂ©s par P. aeruginosa ou par lâinhibition de lâactivitĂ© de ces facteurs.
16.
Introduction 5 I-C. Les facteurs
de virulence de Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa possĂšde de nombreux facteurs de virulence lui permettant de survivre dans de nombreux environnements et de coloniser divers types dâhĂŽtes (Lazdunski, 1998). Ces facteurs sont impliquĂ©s dans les diverses phases dâinfection. On peut distinguer deux classes de facteurs de virulence : ceux associĂ©s Ă la bactĂ©rie, comme les adhĂ©sines et les pili, et ceux sĂ©crĂ©tĂ©s, comme les toxines et les protĂ©ases. Ces facteurs associĂ©s Ă la bactĂ©rie sont principalement impliquĂ©s dans lâadhĂ©rence et la motilitĂ©. Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type III, qui constitue un facteur de virulence majeur, fait lâobjet dâun chapitre sĂ©parĂ© (Chapitre II). I C-1. Les facteurs de virulence associĂ©s Ă la bactĂ©rie IC 1-a) Le biofilm Outre la forme planctonique, P. aeruginosa est capable de se dĂ©velopper sous forme de biofilm. Dans ce mode de croissance, les bactĂ©ries adhĂšrent Ă une surface et sĂ©crĂštent une matrice dâexopolysaccharides, dont lâalginate, dans laquelle elles sont insĂ©rĂ©es. La formation du biofilm nĂ©cessite plusieurs Ă©tapes et dĂ©pend de signaux environnementaux et bactĂ©riens dont ceux du quorum sensing (figure 1 et chapitre III-B) (Filloux et Vallet, 2003). Sous cette forme, P. aeruginosa prĂ©sente une Figure 1 : ModĂšle de formation dâun biofilm par P. aeruginosa (DâaprĂšs Filloux et Vallet, 2003)
17.
Introduction 6 résistance accrue aux
dĂ©fenses immunitaires et aux traitements antibiotiques notamment grĂące Ă lâalginate qui joue le rĂŽle de barriĂšre physique contre les cellules immunitaires et piĂ©ge les Ă©lĂ©ments de la rĂ©ponse immune, anticorps et radicaux libres de lâoxygĂšne provenant respectivement des lymphocytes B et des polynuclĂ©aires neutrophiles (Kobayashi, 2005;Reisner et al., 2005). IC 1-b) Le flagelle P. aeruginosa possĂšde un seul flagelle polaire lui confĂ©rant la capacitĂ© de nager dans un environnement aqueux ou contenant une faible quantitĂ© dâagar (<0,4%) (mobilitĂ© de type « swimming »). Il intervient Ă©galement dans la mobilitĂ© de type « swarming » pouvant ĂȘtre traduit par « essaimage » qui permet le dĂ©placement sur des surfaces semi solides, comme un milieu entre 0,4 et 1% dâagar (Kohler et al., 2000). Le flagelle est une structure rotative constituĂ©e de trois principales parties (figure 3) : le filament extra bactĂ©rien permettant le mouvement, le crochet et le corps basal ancrĂ©s dans les membranes bactĂ©riennes dont une partie en relation avec le crochet est rotative, permettant Ă lâensemble de fonctionner comme une hĂ©lice. Des mutants dĂ©pourvus de flagelle ont une virulence attĂ©nuĂ©e (Feldman et al., 1998;Tang et al., 1996). Cette structure est aussi impliquĂ©e dans lâadhĂ©rence aux cellules Ă©pithĂ©liales respiratoires et participe Ă la formation du biofilm in vitro (Feldman et al., 1998;O'Toole et Kolter, 1998). IC 1-c) Les pili de type IV Le pilus de type IV est la principale adhĂ©sine de P. aeruginosa responsable de lâadhĂ©sion aux cellules Ă©pithĂ©liales (Hahn, 1997). SituĂ© sur la membrane externe, il est constituĂ© de monomĂšres de piline. La capacitĂ© de rĂ©traction du pilus confĂšre Ă la bactĂ©rie une mobilitĂ© de type « twiching » (dĂ©placement sur des surfaces) et « swarming »(Kohler et al., 2000). Lorsque cette structure est non fonctionnelle ou absente lâadhĂ©rence et les dommages de la bactĂ©rie sur les cellules Ă©pithĂ©liales in vitro diminuent ainsi que la virulence in vivo (Comolli et al., 1999;Hahn, 1997).
18.
Introduction 7 IC 1-d) Facteur
dâattachement de type fimbriae RĂ©cemment mis en Ă©vidence chez P. aeruginosa, ce type de pilus est nĂ©cessaire pour lâadhĂ©rence Ă des surfaces inertes et dans la formation du biofilm(Vallet et al., 2001). IC 1-e) Le lipopolysaccharide (LPS) Constituant lipidique majeur de la couche externe de la membrane, le LPS contient une rĂ©gion polysaccharidique ramifiĂ©e qui couvre la totalitĂ© de la surface de la bactĂ©rie et se trouve donc impliquĂ©e dans la stimulation de la rĂ©ponse inflammatoire et dans les interactions avec les tissus de lâhĂŽte. Cette rĂ©gion polysaccharidique, appelĂ©e antigĂšne O, est variable et peut mĂȘme ĂȘtre absente. Selon la prĂ©sence et la composition de lâantigĂšne O, les souches de P. aeruginosa sont plus ou moins rĂ©sistantes Ă la phagocytose dirigĂ©e par le complĂ©ment. La capacitĂ© dâinteraction des diffĂ©rentes formes de LPS avec la protĂ©ine CFTR, joue aussi un rĂŽle important dans la pathogĂ©nie de P. aeruginosa notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose. En effet, CFTR semble pouvoir jouer le rĂŽle de rĂ©cepteur de motif bactĂ©rien (PRM : pattern recognization molecule) activant la rĂ©ponse inflammatoire. Lâabsence ou le dysfonctionnement de CFTR chez les patients atteints de mucoviscidose ainsi que les modifications du LPS au niveau de lâantigĂšne O pourraient empĂȘcher lâinteraction LPS-CFTR, retarder la rĂ©ponse immunitaire et empĂȘcher lâĂ©limination bactĂ©rienne facilitant ainsi lâinstallation et la persistance de la bactĂ©rie (Goldberg et Pier, 1996;Pier, 2002;Schroeder et al., 2002). I C-2. Les facteurs de virulence sĂ©crĂ©tĂ©s Les facteurs de virulence secrĂ©tĂ©s par P. aeruginosa interviennent principalement dans la dissĂ©mination de la bactĂ©rie et la perturbation ou la destruction des dĂ©fenses de lâhĂŽte. Lâexotoxine A est la protĂ©ine la plus cytotoxique produite par P. aeruginosa. SĂ©crĂ©tĂ©e sous forme dâune pro-toxine inactive, elle est reconnue de façon spĂ©cifique par le
19.
Introduction 8 LRP (LDL related
protein)(Herz et al., 1990). Cette interaction produit le clivage de la pro-toxine et une internalisation de la partie active qui cible le facteur dâĂ©longation E2 perturbant ainsi la synthĂšse protĂ©ique(Wick et al., 1990). Les Ă©lastases LasA et LasB, perturbent quant Ă elles certaines fonctions physiologiques en dĂ©gradant lâĂ©lastine nĂ©cessaire notamment Ă la contraction et lâextension du tissu pulmonaire. LasB est Ă©galement capable dâinactiver dâautres protĂ©ines comme les IgA, les IgG et des composĂ©s du complĂ©ment modulant ainsi la rĂ©ponse immunitaire (Heck et al., 1990;Hong et Ghebrehiwet, 1992). P. aeruginosa sĂ©crĂšte Ă©galement des phospholipases de type C (PLC) avec diffĂ©rentes spĂ©cificitĂ©s de substrats (Stonehouse et al., 2002). Certaines ont une activitĂ© hĂ©molytique (PlcN et PlcH) et peuvent jouer un rĂŽle dans la mobilitĂ© de type « twiching » comme PlcB (Barker et al., 2004) Lâaction des phospholipases est facilitĂ©e par les rhamnolipides produits par les bactĂ©ries. Ces biosurfactants sont des molĂ©cules amphiphiles, qui possĂšdent un pouvoir dĂ©tergent sur les phospholipides membranaires facilitant leur accessibilitĂ© aux phospholipases. Les rhamnolipides participent Ă©galement Ă la structuration du biofilm (Boles, Thoendel, et Singh, 2005;Davey, Caiazza, et O'Toole, 2003). I C-3. RĂ©gulation des facteurs de virulence Les Ă©tudes sur la rĂ©gulation des facteurs de virulence ont mis en Ă©vidence une grande variĂ©tĂ© de modes de contrĂŽle de lâexpression des toxines et des autres structures impliquĂ©es dans la pathogĂ©nicitĂ© de P. aeruginosa. La synthĂšse et la sĂ©crĂ©tion de la plupart de ces facteurs sont modulĂ©es en fonction du stade de croissance bactĂ©rien (phase exponentielle ou stationnaire), du mode de dĂ©veloppement (planctonique ou biofilm) et des conditions environnementales dans lesquelles se trouve la bactĂ©rie, notamment lors de lâinfection dâun hĂŽte. Les deux principaux mĂ©canismes senseurs permettant de lier les changements dâĂ©tat et dâenvironnement Ă une expression protĂ©ique adaptĂ©e sont les systĂšmes Ă deux composants et le quorum sensing.
20.
Introduction 9 Les systĂšmes de
rĂ©gulation Ă deux composants permettent, grĂące Ă la dĂ©tection et la transduction de signaux extĂ©rieurs, une rĂ©ponse rapide de lâorganisme face Ă des modifications de lâenvironnement. Dans la majoritĂ© des cas, le systĂšme est constituĂ© de deux protĂ©ines et met en jeu un transfert de phosphate pour la transduction du signal. Il sâagit : â dâune protĂ©ine kinase, gĂ©nĂ©ralement situĂ©e dans une des membranes, appelĂ©e senseur. En rĂ©ponse Ă un signal, cette protĂ©ine sâautophosphoryle. â dâun rĂ©gulateur de rĂ©ponse sur lequel est transfĂ©rĂ© le groupe phosphate Ă partir du senseur qui rĂ©gule son activitĂ©. Il possĂšde un domaine de fixation Ă lâADN et rĂ©gule la transcription. P. aeruginosa possĂšde de nombreux systĂšmes de rĂ©gulation Ă deux composants putatifs. 55 senseurs, 89 rĂ©gulateurs de rĂ©ponse et 14 systĂšmes hybrides senseur- rĂ©gulateur de rĂ©ponse ont Ă©tĂ© dĂ©nombrĂ©s (Rodrigue et al., 2000;Stover et al., 2000). Le nombre important de ces systĂšmes pourrait expliquer en partie lâextrĂȘme adaptabilitĂ© de P. aeruginosa Ă diffĂ©rents milieux. Le second mĂ©canisme global senseur/rĂ©gulateur face aux changements dâenvironnement ou dâĂ©tat est le « quorum sensing ». Il permet lâexpression coordonnĂ©e de nombreux facteurs de virulence notamment en fonction de la densitĂ© cellulaire. LâĂ©tude de ce systĂšme faisant partie du travail effectuĂ©, un chapitre dĂ©taillĂ© lui est consacrĂ© (Chapitre III). I C-4. SĂ©crĂ©tion des facteurs de virulence La sĂ©crĂ©tion des facteurs de virulence est rĂ©alisĂ©e grĂące Ă diffĂ©rents mĂ©canismes qui permettent le transport actif de protĂ©ines Ă travers les membranes bactĂ©riennes. Les quatre systĂšmes de sĂ©crĂ©tion, ubiquitaires chez les bactĂ©ries Ă Gram nĂ©gatif, ont Ă©tĂ© dĂ©crits chez P. aeruginosa, et sont schĂ©matisĂ©s en figure 2. Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type IV, rencontrĂ© chez Agrobacterium tumefaciens nâa pas Ă©tĂ© mis en Ă©vidence chez P. aeruginosa.
21.
Introduction 10 IC 4-a) Le
systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type I Ce systĂšme permet le transport de protĂ©ines directement du cytoplasme vers le milieu extra bactĂ©rien. Il est constituĂ© de 3 complexes protĂ©iques : une protĂ©ine de transport avec une activitĂ© ATPase dans la membrane interne (AprD), une protĂ©ine dans la membrane externe formant un pore (AprF), et enfin une protĂ©ine de fusion membranaire (AprE) situĂ©e dans le pĂ©riplasme et ancrĂ©e dans la membrane interne qui rĂ©alise la liaison entre les deux premiĂšres (Kostakioti et al., 2005). Figure 2 : SchĂ©ma des principaux systĂšmes de sĂ©crĂ©tion de protĂ©ines connus chez les bactĂ©ries Gram nĂ©gatives. La sĂ©crĂ©tion de lâhĂ©molysine (HlyA) dâE.coli est donnĂ©e en exemple pour le type I, la sĂ©crĂ©tion de lâexotoxine (YopE) de Y.pestis pour le type III, la sĂ©cretion de la protĂ©ase IgA1 (IgAp) de Neisseria gonorhoeae pour le systĂšme autotransporteur, et la sĂ©crĂ©tion de la pullulanase (PulA) de Klebsiella oxytoca (DâaprĂšs Kostakioti).
22.
Introduction 11 IC 4-b) Le
systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type II La sĂ©crĂ©tion de type II sâeffectue en deux Ă©tapes. La premiĂšre consiste en un transport des protĂ©ines Ă travers la membrane interne au moyen du systĂšme Sec ATP dĂ©pendant ou du systĂšme Tat ATP indĂ©pendant dirigĂ© par un gradient de pH (Robinson, Thompson, et Woolhead, 2001). Ces deux types de transport nĂ©cessitent la prĂ©sence dâune sĂ©quence signal spĂ©cifique. La seconde Ă©tape correspond Ă lâexport Ă travers la membrane externe via les systĂšmes Xcp et HxC (homologous to xcp). Ce systĂšme de sĂ©crĂ©tion permet notamment la sĂ©crĂ©tion de LasA, LasB, et de lâexotoxine A. IC 4-c) Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type IV Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type IV est capable de transporter une grande variĂ©tĂ© de substrats par un mĂ©canisme dĂ©pendant ou indĂ©pendant du contact cellulaire. La sĂ©crĂ©tion de protĂ©ines ou de complexes nuclĂ©oprotĂ©iques (fragment T du plasmide Ti dâAgrobacterium tumefaciens) est rĂ©alisĂ©e par un mĂ©canisme indĂ©pendant de la machinerie Sec, exceptĂ© pour la toxine pertussique (Bordetella pertussis) (Kostakioti et al., 2005). Aucun systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type IV nâa Ă©tĂ© mis en Ă©vidence chez P. aeruginosa. IC 4-d) Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type V Egalement appelĂ© autotransporteur, ce systĂšme fait appel au complexe Sec pour le transport vers lâespace pĂ©riplasmique. Les protĂ©ines rĂ©alisent ensuite elles-mĂȘmes le pore nĂ©cessaire Ă leur passage Ă travers la membrane externe au moyen dâune sĂ©quence dâadressage spĂ©cifique (Kostakioti et al., 2005).
23.
Introduction 12 II. Le systĂšme
de sĂ©crĂ©tion de type III Le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type III est prĂ©sent dans de nombreux genres de bacilles Ă Gram nĂ©gatif dont Pseudomonas, Yersinia, Salmonella, Shigella et les Escherichia entĂ©ropathogĂšnes (EPEC, EHEC) (Hueck, 1998). ActivĂ© par le contact avec la cellule eucaryote, ce systĂšme est dĂ©diĂ© Ă lâinjection dâeffecteurs directement du cytoplasme de la bactĂ©rie dans le cytosol de la cellule cible sans passage par le milieu extĂ©rieur. Ces effecteurs ont pour effets la mort cellulaire ou le dysfonctionnement de la cellule, en dĂ©truisant la membrane, en perturbant les cascades de transduction des signaux ou en dĂ©sorganisant le cytosquelette (Hueck, 1998;Shaver et Hauser, 2004;Vance, Rietsch, et Mekalanos, 2005). Ils permettent aux bactĂ©ries pathogĂšnes d'envahir les tissus de lâorganisme infectĂ© ou de circonscrire ses dĂ©fenses. Souvent comparĂ© Ă une aiguille, le SSTT est trĂšs conservĂ© au niveau structural entre les bactĂ©ries Ă Gram nĂ©gatif (Aizawa, 2001;Hueck, 1998;Plano, Day, et Ferracci, 2001;Tampakaki et al., 2004). Le SSTT dont la partie basale prĂ©sente de grandes similitudes avec le corps basal du flagelle est composĂ© de deux structures (figure 3) : - lâappareil de sĂ©crĂ©tion est un complexe protĂ©ique enchĂąssĂ© dans les membranes bactĂ©riennes. Il permet la sĂ©crĂ©tion des effecteurs spĂ©cialisĂ©s du SSTT du cytoplasme de la bactĂ©rie Ă lâextĂ©rieur sans transiter par le pĂ©riplasme. - lâappareil de translocation, encore appelĂ© « aiguille », qui est un second complexe au niveau extrabactĂ©rien en contact avec lâappareil de sĂ©crĂ©tion, sâinsĂšre dans la membrane de la cellule cible et permet lâinjection des effecteurs toxiques spĂ©cifiques du SSTT. Câest pourquoi on trouve souvent lâappellation de facteur de virulence pour dĂ©signer lâensemble du SSTT. Bien que la structure des diffĂ©rents SSTT soit similaire, ce facteur de virulence a Ă©voluĂ© de façon particuliĂšre pour chaque espĂšce, affectant le mode dâinteraction des bactĂ©ries avec la cellule cible et permettant diffĂ©rentes stratĂ©gies de pathogĂ©nicitĂ©, allant de lâĂ©chappement au systĂšme immunitaire pour P. aeruginosa et Yersinia spp, Ă lâinvasion des cellules pour Salmonella spp. La diversitĂ© des rĂŽles du SSTT et des environnements dans lesquels il sâexprime met en Ă©vidence lâimportance quâil joue dans les mĂ©canismes de virulence de certains pathogĂšnes Ă Gram nĂ©gatif et laisse supposer un haut niveau de rĂ©gulation.
24.
Introduction 13 II-A. Le systĂšme
de sĂ©crĂ©tion de Type III de P. aeruginosa Chez P. aeruginosa, le SSTT induit une mort cellulaire de type nĂ©crose des cellules de lâimmunitĂ© innĂ©e (polynuclĂ©aires neutrophiles et macrophages) et permet ainsi Ă la bactĂ©rie dâĂ©chapper au systĂšme immunitaire. Sur les cellules Ă©pithĂ©liales, le SSTT provoque une oncose par une dĂ©structuration du cytosquelette. Lors dâune infection Figure 3 : ModĂ©lisation de la structure du flagelle et des systĂšmes de sĂ©crĂ©tion de type III de diffĂ©rentes bactĂ©ries Ă Gram nĂ©gatif. A, structure du flagelle ; B, C, D, SSTT de Yersinia, de E. coli et de P. syringae respectivement. Seules les protĂ©ines conservĂ©es entre les diffĂ©rents SSTT (et leurs homologues chez le flagelle) sont reprĂ©sentĂ©es et identifiĂ©es par des couleurs et des positions similaires. Le « P rod » du flagelle nâa pas de protĂ©ine homologue connue chez les SSTT. Le point dâinterrogation signifie quâune structure de type canal au niveau de la membrane interne nâa pas encore Ă©tĂ© identifiĂ©e. Le constituant majeur de lâaiguille (needle ou Hrp pilus) est YscF chez Yersinia, EspA chez E. coli, HrpA chez P. syringae. Les protĂ©ines formant le pore dans la membrane eucaryote (EM) sont LcrV, YopB, YopD chez Yersinia et EspB, D chez E. coli. Chez le pathogĂšne des plantes, P. syringae, HrpZ est supposĂ©e ĂȘtre la protĂ©ine translocatrice. Les protĂ©ines dont la structure a Ă©tĂ© caractĂ©risĂ©e sont reprĂ©sentĂ©es de façon schĂ©matique. OM, membrane externe de la bactĂ©rie ; PL, peptidoglycane ; IM, membrane interne de la bactĂ©rie ; EM, membrane eucaryote ; CW, paroi cellulaire de la cellule vĂ©gĂ©tale. (DâaprĂšs Tampakak, 2004)
25.
Introduction 14 pulmonaire, notamment chez
les personnes atteintes de mucoviscidose, le SSTT joue un rĂŽle prĂ©pondĂ©rant dans la phase initiale de colonisation et probablement dans la progression de lâinfection (Corech et al., 2005;Dacheux et al., 1999;Jain et al., 2004). II A-1. Organisation gĂ©nĂ©tique et fonction principale des clusters de gĂšnes du SSTT A lâexception des gĂšnes codant les exotoxines, les gĂšnes codant le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type III chez Pseudomonas aeruginosa sont regroupĂ©s en clusters sur le chromosome contrairement au genre Yersinia pour lequel les SSTT est situĂ© sur un plasmide. Ils sont organisĂ©s en plusieurs opĂ©rons. LâopĂ©ron exsCEBA code les principaux rĂ©gulateurs du SSTT, les opĂ©rons exsD-pscBL et pscNUpcrD codent la structure de lâappareil de sĂ©crĂ©tion, et lâopĂ©ron pcrRGVH-popBD code des protĂ©ines impliquĂ©es dans lâappareil de translocation. II A-2. Les diffĂ©rentes toxines et leurs fonctions Quatre exotoxines sĂ©crĂ©tĂ©es par le SSTT sont connues chez P. aeruginosa : ExoS, ExoT, ExoY et ExoU. Toutes les souches ne possĂšdent pas toutes les toxines. Il semble en effet que la prĂ©valence de chaque toxine soit diffĂ©rente selon lâorigine des souches (environnement, isolats cliniques de diffĂ©rentes parties du corps) (Feltman et al., 2001). Ainsi dans lâĂ©tude de Feltman, incluant des souches environnementales et diffĂ©rents isolats cliniques non clonaux, la toxine ExoT est retrouvĂ©e chez la totalitĂ© des souches, la toxine ExoY est prĂ©sente Ă 89%, et 72% des souches possĂšdent le gĂšne exoS. La toxine ExoU a quant Ă elle une prĂ©valence plus faible, 28%en moyenne, avec de fortes variations. En effet le gĂšne exoU est retrouvĂ© dans 40% des isolats sanguins et de plaies mais dans seulement 10% des isolats respiratoires de patients atteints de mucoviscidose. De plus il semble que les gĂšnes exoS et exoU soient trĂšs rarement retrouvĂ©s ensemble dans une mĂȘme souche.
26.
Introduction 15 IIA 2-a) Les
Exotoxines ExoS et ExoT Les toxines ExoT et ExoS sont des protĂ©ines bifonctionnelles qui partagent 76% dâidentitĂ©. Elles possĂšdent une activitĂ© GAP spĂ©cifique des petites protĂ©ines G de la famille Rho (Goehring et al., 1999;Krall et al., 2000) et une activitĂ© ADP ribosyltransfĂ©rase Ă lâextrĂ©mitĂ© C-terminal sur des substrats diffĂ©rents : respectivement les protĂ©ines de la famille Ras et CrkI / II pour ExoS et ExoT (Barbieri et Sun, 2004;Coburn et Gill, 1991;Ganesan et al., 1999;Sun et Barbieri, 2003). Leurs activitĂ©s perturbent la transduction des signaux intracellulaires mĂ©diĂ©s par Ras et CrkI / II et conduisent Ă la mort cellulaire ou au remodelage du cytosquelette dâactine, induisant ainsi une inhibition de la phagocytose ou un changement de morphologie des cellules (Henriksson et al., 2002;Pederson et Barbieri, 1998;Sundin, Hallberg, et Forsberg, 2004). Le gĂšne orf1 en orientation inverse du gĂšne exoS code une protĂ©ine qui possĂšde dâune part les caractĂ©ristiques dâune protĂ©ine chaperonne selon la dĂ©finition quâen fait Parsot (Page et Parsot, 2002) et dâautre part des homologies de sĂ©quence avec SycE, chaperonne de lâhomologue dâExoS chez Yersinia sp. CodĂ© en mĂȘme temps que la toxine, ce gĂšne semble ĂȘtre la chaperonne de la protĂ©ine ExoS et potentiellement celle dâExoT (ThĂšse L. QuĂ©nĂ©e, UJF-Grenoble, 2004). IIA 2-b) Lâexotoxine Y ExoY est une adĂ©nylate cyclase qui prĂ©sente des homologies avec les adĂ©nylates cyclases de Bordetella pertussis (CyaA) et Bacillus anthracis (EF) (Yahr et al., 1998). Son activitĂ© nĂ©cessite un ou des facteurs eucaryotes inconnus. Cette toxine induit un « arrondissement » (rounding) des cellules CHO et une augmentation de la concentration en AMP cyclique corrĂ©lĂ©e avec une hyperpermĂ©abilitĂ© des cellules de la microcirculation pulmonaire secondaire Ă la formation de pores membranaires (Sayner et al., 2004). RĂ©cemment, Cowell et al. ont montrĂ© quâExoY, en perturbant le cytosquelette dâactine, interviendrait en dĂ©but dâinfection en inhibant lâinvasion des cellules Ă©pithĂ©liales par P. aeruginosa (Cowell, Evans, et Fleiszig, 2005). Cependant, ExoY aurait seulement un rĂŽle mineur dans la cytotoxicitĂ© de P. aeruginosa lors dâune infection pulmonaire aiguĂ« (Lee et al., 2005).
27.
Introduction 16 IIA 2-c) Lâexotoxine
U ExoU, lâeffecteur le plus cytotoxique injectĂ© par le SSTT de P. aeruginosa, possĂšde une activitĂ© phospholipase de type PLA2 (Sato et al., 2003). Il est associĂ©, in vitro, Ă une lyse rapide des cellules et Ă une forte pathogĂ©nicitĂ© en modĂšle animal (Hauser et al., 1998;Sawa et al., 1999). II A-3. RĂ©gulation de lâexpression du SSTT Il semble exister deux Ă©tats possibles pour le SSTT de P. aeruginosa. En effet, comme le montrent les Ă©tudes de Dacheux et al. et de lâĂ©quipe dâHauser, certaines souches de P. aeruginosa sont incapables dâactiver le SSTT ou en ont perdu la capacitĂ©. Ceci, bien quâelles possĂšdent les gĂšnes nĂ©cessaires Ă cette activation et mĂȘme si les bactĂ©ries se trouvent dans des conditions favorables Ă lâactivation de ce facteur de virulence (Dacheux, Attree, et Toussaint, 2001;Feltman et al., 2001;Jain et al., 2004). Dans ces Ă©tudes, il sâagit principalement de souches issues de poumons de patients ayant dĂ©veloppĂ©s une infection chronique Ă P. aeruginosa. Ceci suggĂšre quâil existe deux Ă©tats du SSTT chez P. aeruginosa. Lâun est activable par des signaux in vivo ou in vitro qui permettent lâinjection ou la sĂ©crĂ©tion des toxines du SSTT, et nous le qualifieront dâinductible. Lâautre nâest pas activable et ne permet pas la sĂ©crĂ©tion des effecteurs toxiques, bien quâaucune mutation des gĂšnes du SSTT nâait Ă©tĂ© mise en Ă©vidence dans ces souches, et nous le qualifierons de non inductible. Lâensemble des donnĂ©es sur la rĂ©gulation de lâexpression du SSTT, prĂ©sentĂ© ci- dessous, provient de lâĂ©tude du passage de lâĂ©tat inductible Ă lâĂ©tat activĂ©. Le SSTT de P. aeruginosa est activĂ© in vivo lors du contact de la bactĂ©rie avec la cellule cible. In vitro, le signal dâactivation peut ĂȘtre remplacĂ© par une dĂ©plĂ©tion du milieu en calcium (Hornef et al., 2000;Vallis et al., 1999). En lâabsence dâinduction, il existe une faible expression des gĂšnes du SSTT, permettant la formation dâun pool de toxines prĂ©formĂ©es et dâune petite quantitĂ© de structures membranaires en place mais dans une conformation fermĂ©e empĂȘchant la sĂ©crĂ©tion (ThĂšse L. QuĂ©nĂ©e, UJF- Grenoble, 2004). Le ou les signaux dâactivation, encore inconnus, induisent une
28.
Introduction 17 augmentation importante de
la transcription de la plupart des gĂšnes codant lâappareil de sĂ©crĂ©tion/translocation et les toxines (Wolfgang et al., 2003). Lâensemble des gĂšnes constituant le SSTT de P. aeruginosa est sous le contrĂŽle dâun facteur de transcription de la famille AraC, ExsA. Cet activateur transcriptionnel, coordonnant lâexpression des gĂšnes de lâappareil de sĂ©crĂ©tion/translocation et des toxines, est essentiel Ă lâactivation du systĂšme. En effet, les souches mutĂ©es pour le gĂšne exsA sont beaucoup moins virulentes dans des modĂšles dâinfection pulmonaire (Ader et al., 2005), ont une cytotoxicitĂ© rĂ©duite sur les cellules eucaryotes (Dacheux et al., 1999;Fauvarque et al., 2002) et sont incapables de sĂ©crĂ©ter les exotoxines lors dâune induction in vitro, exceptĂ© si un gĂšne exsA exogĂšne est exprimĂ© de façon constitutive dans ces mutants. Les rĂ©seaux de rĂ©gulation contrĂŽlant lâactivation du SSTT agissent principalement sur lâexpression ou lâactivitĂ© dâExsA de façon directe ou indirecte. On peut distinguer deux classes de rĂ©gulateurs : ceux codĂ©s au niveau des opĂ©rons du SSTT, contrĂŽlĂ©s par ExsA et ceux indĂ©pendants dâExsA. IIA 3-a) RĂ©gulation ExsA dĂ©pendante Lâensemble des gĂšnes des rĂ©gulateurs connus, contrĂŽlĂ©s par ExsA (ExsA, ExsC, ExsB, ExsE, ExsD) sont regroupĂ©s au niveau des opĂ©rons exsCEBA et exsD-pscBL. Lâensemble des interactions entre ces protĂ©ines rĂ©gule lâactivitĂ© dâExsA (figure 4). (i) ExsA ExsA est un membre de la famille des activateurs transcriptionnels de type AraC, homologue Ă VirF qui contrĂŽle lâexpression du SSTT chez Yersinia. Il possĂšde une activitĂ© de fixation Ă lâADN de type « hĂ©lice-tour-hĂ©lice » et se fixe sur les promoteurs des opĂ©rons codant les Ă©lĂ©ments du SSTT au niveau de la sĂ©quence consensus TXAAAAXA, Ă environ 50 paires de bases en amont du site dâinitiation de la transcription (Hovey et Frank, 1995;Yahr et al., 1995). ExsA active sa propre synthĂšse en se fixant sur le promoteur de lâopĂ©ron exsCEBA, crĂ©ant ainsi une boucle de rĂ©troaction positive. Une mutation du gĂšne exsA conduisant Ă un dĂ©faut dâexpression ou Ă une protĂ©ine non fonctionnelle, abolit lâexpression des gĂšnes du SSTT et aboutit Ă une souche moins virulente.
29.
Introduction 18 (ii) ExsB Le produit
supposĂ© du gĂšne exsB est homologue Ă VirB qui est impliquĂ© dans la rĂ©gulation du SSTT chez Yersinia enterocolitica. Le produit ou lâARN issu de ce gĂšne est un activateur dans la rĂ©gulation du SSTT puisquâune dĂ©lĂ©tion dâexsB provoque une diminution dâexpression dâexsA. Cependant exsB ne semble pas coder une protĂ©ine comme lâont montrĂ© les Ă©tudes de Goranson et al. (Goranson, Hovey, et Frank, 1997). Cette partie de lâopĂ©ron exsCEBA pourrait jouer un rĂŽle dans la rĂ©gulation post-transcriptionnelle dâexsA en stabilisant lâARN. (iii) ExsD Le gĂšne exsD, premier gĂšne de lâopĂ©ron exsD-pscBL sous le contrĂŽle dâExsA, code un anti-activateur du SSTT de P aeruginosa. En effet, McCaw et al. ont montrĂ© que cette protĂ©ine est capable de se fixer Ă ExsA et dâinhiber son activitĂ©. Une surexpression dâExsD induit une inhibition du SSTT et son absence une dĂ©rĂ©pression de lâopĂ©ron exsCEBA et par consĂ©quent de lâensemble des gĂšnes du SSTT (McCaw et al., 2002). Ceci se produit quelles que soient les conditions de culture (avec ou sans activation du SSTT par dĂ©plĂ©tion calcique ou contact cellulaire). Cependant, un mutant du gĂšne exsD est toujours dĂ©pendant du signal dâactivation (contact cellulaire ou dĂ©plĂ©tion calcique) pour sĂ©crĂ©ter les toxines du SSTT mĂȘme si les gĂšnes du systĂšme sont dĂ©rĂ©primĂ©s (McCaw et al., 2002). (iv)ExsC ExsC est codĂ©e par lâopĂ©ron exsCEBA sous la dĂ©pendance dâExsA. Cette protĂ©ine est un anti-anti-activateur de par sa capacitĂ© Ă fixer ExsD ce qui libĂšre ExsA et permet lâactivation de la boucle de rĂ©troaction sur exsA et lâaugmentation du taux de transcription des gĂšnes du SSTT. Un mutant de ce gĂšne voit la transcription des gĂšnes du SSTT rĂ©primĂ©e et une surexpression induit une dĂ©rĂ©pression de ces gĂšnes indĂ©pendamment de la concentration en calcium (Dasgupta et al., 2004). De plus, dâaprĂšs ses caractĂ©ristiques biochimiques (faible poids molĂ©culaire, pI basique, hĂ©lice α C-terminale amphiphatique) et les rĂ©cents travaux rĂ©alisĂ©s par Urbanowski et al. et Rietsch et al., ExsC pourrait ĂȘtre la protĂ©ine chaperonne dâExsE (Rietsch et al., 2005;Urbanowski, Lykken, et Yahr, 2005)
30.
Introduction 19 (v) ExsE ExsE est
le dernier partenaire du rĂ©seau de rĂ©gulation du SSTT. Cette protĂ©ine est positionnĂ©e au sommet de la cascade de rĂ©gulation centrĂ©e sur lâactivitĂ© dâExsA et sous sa dĂ©pendance. Cette petite protĂ©ine basique de 82 acides aminĂ©s (poids thĂ©orique de 8,7 kDa) possĂšde une activitĂ© de fixation Ă ExsC. Elle est sĂ©crĂ©tĂ©e in vitro par le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type III lors dâune dĂ©plĂ©tion du milieu en calcium. Lâinjection dâExsE et son Ă©ventuelle toxicitĂ© dans la cellule eucaryote restent Ă dĂ©terminer. Dans la bactĂ©rie ExsE serait liĂ©e Ă ExsC qui jouerait le rĂŽle de chaperonne. En effet, la sĂ©crĂ©tion dâExsE lors de lâactivation in vitro, est diminuĂ©e dâun facteur 16 en lâabsence dâExsC (Urbanowski, Lykken, et Yahr, 2005). Les quatre protĂ©ines ExsA, ExsD, ExsC et ExsE forment ainsi une cascade de rĂ©gulation sous la dĂ©pendance dâExsA. ExsE, au sommet de cette cascade, couple la transcription des gĂšnes du SSTT avec lâactivation de la sĂ©crĂ©tion. En lâabsence dâactivation, le canal de sĂ©crĂ©tion est fermĂ©, ExsE est fixĂ©e Ă ExsC laissant ExsD jouer son rĂŽle dâinhibiteur en se fixant Ă ExsA. Lors de lâactivation, ExsE est sĂ©crĂ©tĂ©e, ExsC libĂ©rĂ©e fixe alors ExsD et permet Ă ExsA dâinduire la transcription des gĂšnes du Figure 4 : ModĂšle dâinduction in vitro du SSTT. A, en prĂ©sence de calcium le canal de sĂ©crĂ©tion est fermĂ© par PcrV (V), ExsC est sĂ©questrĂ©e par ExsE (E) et le gĂšne exoS est peu exprimĂ©. B, lors de la dĂ©plĂ©tion calcique, ExsE est sĂ©crĂ©tĂ©e libĂ©rant ExsC qui sĂ©questre ExsD. ExsA libĂ©rĂ©e peut alors activer lâexpression dâexoS. (DâaprĂšs Rietch, 2005)
31.
Introduction 20 SSTT. Les Ă©vĂšnements
permettant la sĂ©crĂ©tion dâExsE lors de lâactivation sont encore inconnus. Lâexpression des gĂšnes du SSTT doit dĂ©pendre dâun Ă©quilibre fin entre les concentrations des diffĂ©rents constituants de cette cascade. La double interaction (ExsC-ExsE, ExsC-ExsD) contrĂŽlant lâexpression dâExsA et la prĂ©sence dâune transcription constitutive Ă un faible taux quâont montrĂ©es des Ă©tudes au laboratoire et dans dâautres Ă©quipes (Wolfgang et al., 2003), permet probablement au systĂšme de dĂ©tecter et de rĂ©pondre rapidement aux stimuli dâinduction limitant ainsi les dĂ©penses en Ă©nergie. Dâautres voies de rĂ©gulation, exposĂ©es ci-dessous, ajoutent un niveau supplĂ©mentaire de contrĂŽle et de flexibilitĂ© au systĂšme. Elles permettent de coupler efficacement la transcription Ă la sĂ©crĂ©tion et une rĂ©ponse rapide Ă une induction ou une rĂ©pression dictĂ©e par les conditions du milieu. IIA 3-b) RĂ©gulation ExsA indĂ©pendante Dâautres acteurs, dont lâexpression nâest pas connue pour ĂȘtre rĂ©gulĂ©e par ExsA, modulent Ă©galement lâexpression du SSTT. Lâensemble des interactions est rĂ©sumĂ© sur la figure 5. (i) Effets du mĂ©tabolisme Un nombre grandissant dâĂ©tudes tend Ă montrer que la richesse nutritive de lâenvironnement rencontrĂ© par les bactĂ©ries et les mĂ©tabolismes mis en jeu dans lâadaptation Ă ce milieu influencent de façon spĂ©cifique lâexpression des facteurs de virulence. Chez P. aeruginosa, plusieurs voies mĂ©taboliques ou protĂ©ines du mĂ©tabolisme semblent impliquĂ©es directement dans la rĂ©gulation du systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type III. LâĂ©quipe de Rietsch a mis en Ă©vidence quâune perturbation du mĂ©tabolisme de lâhistidine module lâexpression du SSTT (Rietsch, Wolfgang, et Mekalanos, 2004). La surexpression du gĂšne PA5097 (hutT) codant la permĂ©ase de lâhistidine est corrĂ©lĂ©e avec une diminution de la transcription du gĂšne codant la toxine ExoS et de la cytotoxicitĂ© SSTT dĂ©pendante sur des macrophages. Cette surexpression induit probablement un transport trop important de lâhistidine. Lâaccumulation intracellulaire
32.
Introduction 21 de cet acide
aminĂ© provoquerait une accumulation de ses produits de dĂ©gradation et un dĂ©sĂ©quilibre entre les sources de carbone et dâazote dĂ©lĂ©tĂšre pour la croissance bactĂ©rienne et la cytotoxicitĂ©. Ce phĂ©notype peut ĂȘtre partiellement corrigĂ© par la mutation du systĂšme rĂ©gulateur Ă deux composants, CbrAB. Ce systĂšme de senseur-rĂ©gulateur semble impliquĂ© dans le contrĂŽle dâopĂ©rons du catabolisme en rĂ©ponse Ă un dĂ©sĂ©quilibre dans lâapport en carbone et en azote, sa mutation permettrait de balancer les effets dâun import et dâun catabolisme excessif de lâhistidine. Des Ă©tudes sur dâautres pathogĂšnes ont Ă©galement montrĂ© une rĂ©gulation du SSTT dĂ©pendante du mĂ©tabolisme des acides aminĂ©s chez Yersinia et des acides gras chez Salmonella (Lucas et al., 2000;Ramamurthi et Schneewind, 2002). Dâautres protĂ©ines du mĂ©tabolisme bactĂ©rien sont impliquĂ©es dans la rĂ©gulation du SSTT. Ainsi, Dacheux et al. ont montrĂ©, dans la souche CHA issue dâun patient atteint de mucoviscidose, lâimportance des gĂšnes ppX codant une exopolyphosphatase et dsbA codant une thiol/disulfide oxidorĂ©ductase pĂ©riplasmique. Lâimplication de la protĂ©ine DsbA dans la maturation des protĂ©ines membranaires du SSTT Ă©tait dĂ©jĂ connu chez Salmonella typhimurium (Miki, Okada, et Danbara, 2004). Les auteurs ont Ă©galement mis en Ă©vidence le rĂŽle des sous unitĂ©s E1 et E2 de la pyruvate dĂ©hydrogĂ©nase (PDH) codĂ©es par lâopĂ©ron aceAB. La mutation dâun de ces gĂšnes entraĂźne une forte diminution de la sĂ©crĂ©tion des toxines consĂ©cutive Ă une perte dâinduction du SSTT in vitro et une diminution de presque 100% de la cytotoxicitĂ© dĂ©pendant du SSTT sur des polynuclĂ©aires neutrophiles (Dacheux et al., 2002). Chez un mutant de lâopĂ©ron aceAB, bien que lâaddition dâacĂ©tate au milieu permette de retrouver une croissance similaire Ă la souche parentale, elle ne permet pas une rĂ©version de la rĂ©pression de lâopĂ©ron exsCEBA et donc de lâactivation du SSTT. Plus quâun effet mĂ©tabolique global comme câest probablement le cas pour le mĂ©tabolisme de lâhistidine, la PDH de P. aeruginosa pourrait jouer un rĂŽle direct de rĂ©gulateur transcriptionnel. En rĂ©ponse Ă un stress, elle pourrait coupler modification du mĂ©tabolisme des acides tricarboxyliques et modulation de lâexpression de facteurs notamment les facteurs de virulence comme câest le cas chez Bacillus thuringiensis ou Azotobacter vinelandii (Regnstrom et al., 1999;Walter et Aronson, 1999).
33.
Introduction 22 Cette modulation du
SSTT par les voies mĂ©taboliques semble Ă©galement intervenir via les modifications sur les ARNs de transfert (ARNt) nĂ©cessaires Ă la traduction dâARNs spĂ©cifiques. De telles modifications sont impliquĂ©es dans la rĂ©gulation de la virulence en rĂ©ponse Ă une variation des conditions nutritionnelles du milieu (Durand et Bjork, 2003;Urbonavicius, Durand, et Bjork, 2002). Chez S. flexneri lâabsence de modifications sur certains ARNs de transfert rĂ©duit la traduction du rĂ©gulateur VirF (homologue dâ ExsA) diminuant ainsi lâexpression du SSTT (Durand et al., 2000). Chez P. aeruginosa, la mutation du gĂšne truA codant une ARNt pseudo-uridine synthase entraĂźne une absence dâexpression des gĂšnes du SSTT (Ahn et al., 2004). La pseudo-uridine joue un rĂŽle important dans la structure des ARNs structuraux (Harrington et al., 1993). Cette modification doit donc ĂȘtre essentielle Ă la stabilitĂ© et/ou Ă la fonction dâun ou de plusieurs ARNt nĂ©cessaires Ă la traduction dâun ou des rĂ©gulateurs du SSTT de P. aeruginosa. Les pompes Ă efflux MexCD-OprJ et MexEF-OprN ont Ă©galement un effet sur la transcription des gĂšnes du SSTT. Ces pompes dont lâexpression est gĂ©nĂ©ralement rĂ©primĂ©e permettent un efflux de molĂ©cules dont les antibiotiques. Des mutants surexprimant ces complexes protĂ©iques voient la transcription dâexsA diminuer et ainsi celle de lâensemble des gĂšnes du SSTT lors dâune activation in vitro. Ce phĂ©notype peut ĂȘtre dĂ» Ă une sĂ©crĂ©tion du signal activant le SSTT, ou Ă une modification du mĂ©tabolisme due Ă une sĂ©crĂ©tion accrue de mĂ©tabolites rĂ©sultant de la surexpression des pompes Ă efflux. Il est intĂ©ressant de noter que la surexpression dâautres pompes que celles citĂ©es ci-dessus nâinduit pas de rĂ©pression du SSTT (Linares et al., 2005) laissant supposer un rĂŽle spĂ©cifique du ou des rĂ©gulateurs de ces pompes sur le SSTT. (ii) Les rĂ©gulateurs globaux Le SSTT de P. aeruginosa est Ă©galement sous le contrĂŽle de rĂ©gulateurs globaux de la virulence. Ainsi la protĂ©ine Vfr est essentielle Ă la transcription des gĂšnes du SSTT. Son activitĂ© nĂ©cessite la prĂ©sence dâAMPc synthĂ©tisĂ© par deux adĂ©nylates cyclases CyaA et CyaB. Vfr, membre de la famille des protĂ©ines de type CRP, rĂ©gule Ă©galement des facteurs de virulence tels que le pili de type IV et le systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type II (Wolfgang et al., 2003). La protĂ©ine CRP (cAMP receptor protein) dâE. coli interagit avec lâAMPc et joue le rĂŽle de rĂ©gulateur transcriptionnel en se fixant sur les promoteurs des gĂšnes cibles. De prĂ©cĂ©dentes Ă©tudes ont dĂ©jĂ montrĂ©
34.
Introduction 23 que lâAMPc et
son rĂ©cepteur sont impliquĂ©s dans la rĂ©gulation du SSTT de Yersinia enterocolitica (Petersen et Young, 2002). Les systĂšmes de rĂ©gulateur Ă deux composants jouent Ă©galement un rĂŽle dans la modulation de lâexpression des gĂšnes du SSTT en rĂ©ponse Ă une modification du milieu captĂ©e par le senseur. Le systĂšme senseur-rĂ©gulateur CopR-CopS, impliquĂ© dans la rĂ©sistance au stress induit par le Cu2+ , rĂ©prime lâexpression des gĂšnes du SSTT en prĂ©sence de cuivre. Cette rĂ©pression est effectuĂ©e par lâintermĂ©diaire de la protĂ©ine PtrA dont lâexpression est contrĂŽlĂ©e par CopR-CopS. PtrA est capable de se fixer spĂ©cifiquement Ă ExsA et dâen rĂ©primer lâactivitĂ© conduisant Ă la rĂ©pression des autres gĂšnes du SSTT. Un mutant ptrA prĂ©sente quant Ă lui une augmentation de la sĂ©crĂ©tion des toxines ExoS et ExoT(Ha et al., 2004). Lors de lâinduction in vitro du SSTT, lâEGTA utilisĂ© comme chĂ©lateur du Ca2+ pourrait Ă©galement lâĂȘtre pour le Cu2+ induisant une diminution dâexpression du gĂšne ptrA et donc une augmentation dâExsA libre. Une autre protĂ©ine, RetS, aussi nommĂ©e RtsM, possĂ©dant des homologies avec les protĂ©ines constituant les systĂšmes de type senseur-rĂ©gulateur, rĂ©gule lâexpression du SSTT. RetS est une protĂ©ine hybride possĂ©dant Ă la fois un domaine senseur avec une possible activitĂ© kinase et deux domaines rĂ©gulateur de rĂ©ponse en tandem. Cependant, elle ne possĂšde pas de domaine de fixation Ă lâADN comme la plupart des rĂ©gulateurs de rĂ©ponse connus. RetS rĂ©gule de façon positive lâexpression des gĂšnes impliquĂ©s dans la pathogĂ©nicitĂ© de P. aeruginosa, notamment la transcription dâexsA. Les essais de complĂ©mentation dâun mutant âretS avec le rĂ©gulateur Vfr ont montrĂ© quâil agit en aval de RetS(Goodman et al., 2004;Laskowski, Osborn, et Kazmierczak, 2004;Zolfaghar et al., 2005). La dĂ©plĂ©tion calcique lors de lâactivation du SSTT nâa pas dâeffet sur la transcription de RetS. Cependant, il nâest pas exclu que des modifications post-traductionnelles lors du changement de concentration en calcium active ce rĂ©gulateur. (iii) RĂŽle du « quorum sensing » et du phĂ©notype mucoĂŻde Lâexpression des gĂšnes du systĂšme de sĂ©crĂ©tion de type III semble Ă©galement rĂ©gulĂ©e par des systĂšmes modulĂ©s par la densitĂ© bactĂ©rienne. Il sâagit dâune part du facteur sigma alternatif de rĂ©ponse au stress et Ă la densitĂ© cellulaire, RpoS et dâautre part dâau moins un des systĂšmes de quorum sensing (QS) de P. aeruginosa,
35.
Introduction 24 RhlI/R (voir chapitre
III pour les systĂšmes de quorum sensing). Hogardt et al. ont montrĂ© que la transcription dâexoS lors dâune dĂ©plĂ©tion calcique est supĂ©rieure chez un mutant dâune de ces protĂ©ines par rapport Ă la souche parentale. Dans le cas du mutant rhlI, la supplĂ©mentation du milieu en C4-homosĂ©rine lactone, produite normalement par RhlI, permet de rĂ©tablir un niveau de transcription similaire Ă la souche parentale(Hogardt et al., 2004). Le facteur de transcription RpoS et la synthase RhlI sont donc impliquĂ©s dans un mĂ©canisme de rĂ©pression de lâexpression de la toxine ExoS lors dâune activation du SSTT in vitro. Il a Ă©tĂ© montrĂ© que lâexpression de RpoS se trouve en partie sous le contrĂŽle du systĂšme de quorum sensing RhlI/R (voir chapitre III-B). La rĂ©pression exercĂ©e par ces protĂ©ines pourrait donc se dĂ©rouler en cascade, RhlI agissant en amont de RpoS. RĂ©cemment, Bleves et al. ont confirmĂ© le rĂŽle rĂ©presseur de RhlI et du signal C4-HSL sur lâexpression dâExoS (Bleves et al., 2005). Cependant, il est intĂ©ressant de noter que lâexpression du gĂšne ExoU ne semble pas dĂ©rĂ©primĂ©e par une mutation du gĂšne rpoS (Hogardt et al., 2004) et que lâexpression du rĂ©gulateur exsA nâest pas non plus influencĂ©e par une mutation du gĂšne rhlI (Bleves et al., 2005). Ces donnĂ©es indiqueraient que RhlI et RpoS ont une influence diffĂ©rente selon les gĂšnes du SSTT ou les souches de P. aeruginosa. Hogardt et al. ont Ă©galement montrĂ© que lâexpression dâExoS est rĂ©primĂ©e lors dâune croissance en biofilm, dont la formation est contrĂŽlĂ©e par le quorum sensing et RpoS. LâhypothĂšse dâune rĂ©pression du SSTT, pour les bactĂ©ries se dĂ©veloppant sous forme de biofilm, est appuyĂ©e par deux autres Ă©tudes. La premiĂšre montre lâimplication du gĂšne algR dans la rĂ©pression du SSTT (Wu et al., 2004). AlgR est un rĂ©gulateur nĂ©cessaire Ă la synthĂšse de lâalginate, un des composants du biofilm chez P. aeruginosa sous le contrĂŽle dâAlgU (Deretic et al., 1994;Wozniak et Ohman, 1994). La seconde met en Ă©vidence quâun systĂšme de rĂ©gulation Ă trois composants, codĂ© par lâopĂ©ron sadRS et le gĂšne sadA, intervient dans la formation du biofilm et dans lâexpression du SSTT. En effet un mutant sadRS est dĂ©fectif dans la formation dâun biofilm mature et montre une dĂ©rĂ©pression du SSTT lors de la croissance en biofilm. De plus, une surexpression de sadRS entraĂźne une rĂ©pression du SSTT en mode de croissance planctonique. De façon surprenante, des mutants de sĂ©crĂ©tion du SSTT testĂ©s pour leur capacitĂ© Ă former des biofilms montrent une augmentation de cette formation de biofilm (Kuchma, Connolly, et O'Toole, 2005). La relative protection contre les dĂ©fenses immunitaires confĂ©rĂ©e par le biofilm rend le SSTT
36.
Introduction 25 « inutile »
dans cet environnement. Il semble donc que la bactĂ©rie ait dĂ©veloppĂ© un systĂšme permettant de coordonner production des composants du biofilm et extinction du SSTT. Ces observations sont en accord avec dâautres Ă©tudes montrant que les bactĂ©ries mucoĂŻdes, isolĂ©es de patients atteints de mucoviscidose, possĂšdent un SSTT non inductible par un signal in vitro ou in vivo (Dacheux, Attree, et Toussaint, 2001;Jain et al., 2004).
37.
Introduction 26 ME MI ExsA Translocon exsCEBA DsBA Toxines du SSTT TruA ARNt
modifiĂ© ? Etat mĂ©tabolique DisponibilitĂ© des acides aminĂ©s ? CyaAB AMPc Vfr RpoS RhlI CopR/S PtrA Cu2+ RetS Biofilm SadARS PDH PpX Activation RĂ©pression Facteur de transcription RĂ©gulateur Ă deux composants Enzyme AlgR Pompes dâefflux MexCD / OprJ MexEF / OprN GĂšne ou opĂ©ron Translocon ME MI Membrane interne Membrane externe ME MI ExsA Translocon exsCEBA DsBA Toxines du SSTT TruA ARNt modifiĂ© ? Etat mĂ©tabolique DisponibilitĂ© des acides aminĂ©s ? CyaAB AMPc Vfr RpoS RhlI CopR/S PtrA Cu2+ RetS Biofilm SadARS PDH PpX Activation RĂ©pression Facteur de transcription RĂ©gulateur Ă deux composants Enzyme AlgR Pompes dâefflux MexCD / OprJ MexEF / OprN GĂšne ou opĂ©ron Translocon ME MI Membrane interne Membrane externe Figure 5 : RĂ©gulation transcriptionnelle du SSTT indĂ©pendante dâExsA chez P. aeruginosa. Les interactions des protĂ©ines entre elles ou avec le promoteur des gĂšnes ne sont pas forcĂ©ment directes. Les protĂ©ines avec une fonction similaire sont reprĂ©sentĂ©es par la mĂȘme forme.
38.
Introduction 27 II-B. La régulation
du SSTT chez les autres bacilles pathogĂšnes Ă Gram nĂ©gatif II B-1. Les Yersiniae Il existe trois espĂšces de Yersinia pathogĂšnes. Elles infectent les rongeurs et peuvent ĂȘtre transmises Ă lâhomme par lâintermĂ©diaire des ectoparasites comme les puces. LâespĂšce la plus connue est Yersinia pestis, lâagent de la peste. Les deux autres espĂšces, Yersinia enterocolitica et Yersinia pseudotuberculosis, provoquent chez lâhomme des gastro-entĂ©rites plus ou moins sĂ©vĂšres (Cornelis et Wolf-Watz, 1997). Le SSTT de ces trois espĂšces de Yersinia pathogĂšnes est celui qui a fait lâobjet du plus grand nombre dâĂ©tudes avec celui des Salmonellae. Chez ces bactĂ©ries, il est Ă©galement activĂ© par le contact avec une cellule hĂŽte. In vitro, comme P. aeruginosa, il rĂ©pond Ă la dĂ©plĂ©tion du milieu en calcium mais nĂ©cessite aussi une tempĂ©rature de 37°C. Lâexpression des opĂ© rons du SSTT chez Yersinia dans ces conditions requiert les protĂ©ines VirF et YmoA. VirF, un rĂ©gulateur de type AraC comme ExsA, est transcrit essentiellement Ă 37°C et active les opĂ©rons yop (Yersinia outer protein) codant les substrats du SSTT et lâopĂ©ron virC codant les composants du systĂšme. YmoA est une histone bactĂ©rienne qui intervient dans la modification de la structure de lâADN et rĂ©prime lâexpression des gĂšnes du SSTT. Lâactivation des opĂ©rons yop par VirF nĂ©cessite dâabord un changement de conformation de lâADN favorable Ă la transcription (Lambert, Sluiters, et Cornelis, 1992). Cette modification intervient lorsque la dĂ©gradation de YmoA par les protĂ©ases ClpXP et Lon est augmentĂ©e Ă 37°C (Jackso n, Silva-Herzog, et Plano, 2004). Chez P. aeruginosa, on peut Ă©galement penser que la conformation de lâADN est importante pour la rĂ©gulation du SSTT puisque la protĂ©ine Vfr joue un rĂŽle important. En effet, lâhomologue de Vfr chez E. coli, CRP, influence la conformation de lâADN lorsquâelle interagit avec celui-ci et joue le rĂŽle dâactivateur notamment dans la rĂ©gulation de lâopĂ©ron arabinose. Dâautres protĂ©ines interviennent dans la rĂ©gulation du SSTT chez les trois espĂšces de Yersinia pathogĂšnes. LcrQ chez Y. pseudotuberculosis, et ses homologues YscM1 et 2 chez Y. enterocolitica sont des protĂ©ines sĂ©crĂ©tĂ©es par le SSTT qui ont une activitĂ© inhibitrice sur ce systĂšme (Ramamurthi et Schneewind, 2002). Les
39.
Introduction 28 mutants LcrQ ou
YscM1-2 expriment les gĂšnes du SSTT mĂȘme dans des conditions dĂ©favorables (forte concentration en calcium). La rĂ©gulation rĂ©alisĂ©e par ces protĂ©ines se dĂ©roulerait au niveau post-transcriptionnel par action sur les parties non traduites des ARN messagers (Cambronne et Schneewind, 2002). Lâinteraction entre les protĂ©ines YscM1 et 2 et la chaperonne SycH lĂšverait cette rĂ©pression (Cambronne, Sorg, et Schneewind, 2004). Contrairement aux protĂ©ines LcrQ/YscM, dont lâactivitĂ© inhibitrice dans le cytoplasme est levĂ©e lors de leur liaison Ă SycH puis leur sĂ©crĂ©tion, la protĂ©ine LcrH est un rĂ©presseur qui reste exclusivement cytoplasmique. FixĂ©e Ă YopD, un constituant du SSTT dont elle permet la stabilisation et une sĂ©crĂ©tion efficace, elle rĂ©prime lâexpression des Yops par un mĂ©canisme post-transcriptionnel. Bien que ne possĂ©dant pas dâactivitĂ© ribonuclĂ©ase, ce complexe induit indirectement une dĂ©gradation des ARNs des Yop (Anderson et al., 2002). Il existe Ă©galement une rĂ©gulation de la sĂ©crĂ©tion exercĂ©e par le couple LcrG/LcrV. LcrV est une protĂ©ine secrĂ©tĂ©e par le SSTT qui a comme chaperonne de type Syc LcrG. La mutation du gĂšne lcrV induit une absence de sĂ©crĂ©tion des Yops. Celle du gĂšne lcrG induit un phĂ©notype dit de perte de spĂ©cificitĂ© qui se caractĂ©rise par une sĂ©crĂ©tion des toxines dans le milieu lors dâune infection cellulaire alors que les Yops sont normalement exclusivement injectĂ©es et par une sĂ©crĂ©tion indĂ©pendante de la concentration en calcium in vitro (Lee, Tam, et Schneewind, 2000;Matson et Nilles, 2001). II B-2. Salmonella typhimurium Actuellement, Salmonella est le seul genre bactĂ©rien Ă possĂ©der deux SSTT (Shea et al., 1996). Ces deux systĂšmes jouent des rĂŽles diffĂ©rents dans les phases dâinvasion de la bactĂ©rie. Le premier cluster de gĂšnes, SPI.1 (Salmonella Pathogenicity Island 1), permet aux pathogĂšnes de passer la barriĂšre de la muqueuse intestinale. Le deuxiĂšme cluster de gĂšnes, SPI.2 (Salmonella Pathogenicity Island 2), est nĂ©cessaire Ă la bactĂ©rie pour la phase dâinvasion systĂ©mique. Ces deux systĂšmes sont donc activĂ©s Ă diffĂ©rents stades de lâinfection (GalĂĄn, 2001). Le SSTT codĂ© par les gĂšnes du SPI.1 (SSTT.1) est exprimĂ© par Salmonella dans la lumiĂšre du tractus intestinal, alors que le SSTT codĂ© par les
40.
Introduction 29 gĂšnes du SPI.2
(SSTT.2) est exprimĂ© seulement quand les bactĂ©ries ont pĂ©nĂ©trĂ© dans les cellules eucaryotes. Lâactivation in vitro du SSTT.1 de S .typhimurium nĂ©cessite des conditions environnementales extrĂȘmement particuliĂšres. En effet, il faut simultanĂ©ment un faible taux dâoxygĂšne, une forte osmolaritĂ©, et un pH voisin de 8 (Bajaj et al., 1996). Ces conditions sont celles de la lumiĂšre du tractus intestinal et permettent donc aux gĂšnes du SSTT dâĂȘtre activĂ©s uniquement quand les bactĂ©ries se trouvent sur le site dâinvasion. La tempĂ©rature nâest pas un facteur environnemental dĂ©terminant pour lâactivation du SSTT.1, cependant comme pour Yersinia, la protĂ©ine H-NS apparentĂ©e aux histones et jouant un rĂŽle dans la structure de lâADN, est impliquĂ©e dans la rĂ©gulation de lâexpression des gĂšnes du SPI.1, mais son activitĂ© nâa pas Ă©tĂ© montrĂ©e influencĂ©e par la tempĂ©rature (Schechter et al., 2003). Il existe deux facteurs de transcription codĂ©s dans le SPI.1. HilA est nĂ©cessaire Ă lâexpression de tous les gĂšnes du SPI.1 (Bajaj, Hwang, et Lee, 1995). Ce facteur de transcription, dont le gĂšne nâest pas autorĂ©gulĂ©, est impliquĂ© dans la perception des conditions environnementales activant le SSTT.1 et se fixe aux promoteurs des gĂšnes invF et prgH (Bajaj et al., 1996). InvF est le deuxiĂšme facteur de transcription dont le gĂšne se localise dans le SPI.1 et il contrĂŽle lâexpression des promoteurs du cluster inv-spa (Darwin et Miller, 1999;Kaniga, Bossio, et Galan, 1994). LâactivitĂ© dâInvF est conditionnĂ©e par sa liaison avec SicA. SicA est la chaperonne des toxines du SPI.1, SipB et SipB. Lors de lâactivation de la sĂ©crĂ©tion, SicA se retrouve libre et peut lier InvF pour activer la transcription (Miller, 2002). Deux autres facteurs de transcription rĂ©gulent lâactivation du SSTT.1 mais ne sont pas codĂ©s dans le SPI.1 : SirA et PhoP. SirA est lâĂ©lĂ©ment de rĂ©ponse du systĂšme Ă deux composants BarA/SirA. Ce systĂšme permet lâaugmentation de lâexpression des gĂšnes de virulence pendant que lâexpression des gĂšnes de mobilitĂ© diminue. SirA active la virulence directement en augmentant lâexpression de HilA pendant que lâactivitĂ© du flagelle est rĂ©primĂ©e indirectement via lâactivation de lâexpression du gĂšne csrB (Teplitski, Goodier, et Ahmer, 2003). PhoP semble ĂȘtre un rĂ©gulateur nĂ©gatif du SSTT.1. En effet, il entraĂźne une rĂ©pression de lâexpression de hilA (Garcia, Soncini, et Groisman, 1996). PhoP est activĂ©e aprĂšs avoir Ă©tĂ© phosphorylĂ©e par PhoQ, en rĂ©ponse Ă un changement de la concentration dâions divalents dans le milieu. Il est donc possible que la faible concentration en calcium dans les vacuoles de phagocytose soit un signal rĂ©primant
41.
Introduction 30 lâexpression du SSTT.1
aprĂšs lâinternalisation des bactĂ©ries. Une Ă©tude rĂ©cente a dĂ©crit une interaction spĂ©cifique entre les protĂ©ines HilE et HilD, intervenant dans la rĂ©gulation de lâexpression du SSTT.1 (Baxter et al., 2003). En effet, HilD est un activateur du promoteur de hilA, la fixation de HilE sur HilD agit comme anti- activateur de cette protĂ©ine. Les mĂ©canismes de la rĂ©gulation de lâexpression du SSTT.2 commencent Ă ĂȘtre dĂ©cryptĂ©s. Garmendia et al. ont montrĂ© que le systĂšme Ă deux composants SsrA/SsrB contrĂŽle lâexpression des gĂšnes de lâappareil de sĂ©crĂ©tion et des gĂšnes codant pour les effecteurs, en rĂ©ponse Ă diffĂ©rents signaux environnementaux de type faible osmolaritĂ©, pH acide ou encore faible concentration en calcium (Garmendia et al., 2003). II B-3. Escherichia coli enteropathogĂšnes Les Escherichia coli entĂ©ropathogĂšnes (EPEC) sont des bactĂ©ries responsables dâinfections intestinales sĂ©vĂšres. Elles diffĂšrent des autres souches dâE. coli par leur capacitĂ© Ă former des microcolonies sur la surface de ces cellules. Les EPEC sont responsables de la plupart des diarrhĂ©es infantiles dans les pays en voie de dĂ©veloppement. AprĂšs ĂȘtre entrĂ© en contact avec lâĂ©pithĂ©lium intestinal, les EPEC sâattachent de façon plus intime aux cellules Ă©pithĂ©liales et entraĂźnent la disparition des microvillositĂ©s et la formation dâun renflement de la cellule sur lequel la bactĂ©rie peut se dĂ©velopper (figure 6). Ce processus de colonisation nĂ©cessite la prĂ©sence dâune adhĂ©sine bactĂ©rienne, lâintimine, et du SSTT (Scaletsky, Silva, et Trabulsi, 1984). Lâintimine se fixe de façon spĂ©cifique sur le rĂ©cepteur Tir (translocated intimin Figure 6 : Interaction entre EPEC et une cellule Ă©pithĂ©liale. Le SSTT permet dâinduire la formation dâun renflement (pedestal) sur la membrane de la cellule cible favorisant lâattachement de la bactĂ©rie via lâinteraction intimineârĂ©cepteur Tir. (Frankel et al)
42.
Introduction 31 receptor), localisé dans
la membrane de la cellule Ă©pithĂ©liale Ă proximitĂ© directe de la zone dâattachement initiale de la bactĂ©rie sur la cellule. Ce rĂ©cepteur dâorigine bactĂ©rienne est injectĂ© dans la cellule par lâintermĂ©diaire du SSTT des EPEC puis exposĂ© sur la membrane de la cellule cible ce qui permet lâinteraction avec lâintimine. Le SSTT des EPEC est portĂ© par un locus de 35.5 kb sur lâADN chromosomique de la bactĂ©rie, appelĂ© LEE (Locus of Enterocyte Effacement) composĂ© de 5 opĂ©rons. Ce locus est aussi retrouvĂ© chez dâautres souches, telles que les souches dâE. coli entĂ©rohĂ©moragiques (EHEC). Lâexpression du SSTT chez les EPEC dĂ©pend de la tempĂ©rature. Des bactĂ©ries cultivĂ©es Ă 28°C ne prĂ©s entent pas de phĂ©notype de sĂ©crĂ©tion. La virulence maximale est observĂ©e Ă 37°C en dĂ©but de phase exponentielle de croissance (Umanski, Rosenshine, et Friedberg, 2002). In vivo, le SSTT des EPEC est un systĂšme contact dĂ©pendant. In vitro, la croissance en milieu de culture eucaryote (RPMI, DMEM) est nĂ©cessaire Ă la sĂ©crĂ©tion des protĂ©ines Esp (Kenny et al., 1997). En effet, les protĂ©ines de type III des EPEC ne sont pas sĂ©crĂ©tĂ©es dans les milieux de culture bactĂ©rien du type milieu LB. Comme dans la plupart des autres SSTT, lâactivation de la virulence chez les EPEC nĂ©cessite un activateur transcriptionnel de type AraC, PerA. Cette protĂ©ine est codĂ©e au niveau de lâopĂ©ron perABC, localisĂ© sur un plasmide de virulence nommĂ© « EPEC adherence factor (EAF) plasmid ». PerA active sa propre expression et celle du rĂ©gulateur Ler, codĂ© par le premier gĂšne de lâopĂ©ron LEE1. Cette protĂ©ine est essentielle pour lâexpression de la majoritĂ© des opĂ©rons LEE chez les EPEC. Le plasmide EAF nâest pas retrouvĂ© chez les EHEC mais il existe des homologues Ă lâactivateur PerC, codĂ©s par lâopĂ©ron pchABC situĂ© sur le chromosome (Iyoda et Watanabe, 2004). Dâautres gĂšnes codĂ©s au niveau du LEE1 rĂ©gulent Ă©galement lâactivation du SSTT. Il sâagit de GrlR et GrlA, qui sont respectivement inhibiteur et activateur du gĂšne ler. Dâautres rĂ©gulateurs, non codĂ©s au niveau du LEE, interviennent dans la rĂ©gulation du SSTT chez les EPEC, notamment des protĂ©ines associĂ©es Ă la chromatine telle que H-NS, Fis ou IHF(Bustamante et al., 2001;Goldberg et al., 2001;Umanski, Rosenshine, et Friedberg, 2002) dont un homologue, YmoA, est Ă©galement impliquĂ© dans la rĂ©gulation du SSTT chez Yersinia. Des gĂšnes reliĂ©s au quorum sensing sont aussi importants pour la rĂ©gulation de lâexpression du LEE chez les EHEC et les EPEC. LâopĂ©ron LEE1 est stimulĂ© par le rĂ©gulateur QseA, qui est activĂ© via une cascade de transductions impliquant les signaux AI2 et AI3. Il a Ă©galement Ă©tĂ©
43.
Introduction 32 montré que le
facteur sigma RpoS, contrĂŽlĂ© par le quorum sensing, inhibe lâexpression de lâopĂ©ron pchABC contrĂŽlant le SSTT tout comme chez P. aeruginosa pour laquelle RpoS inhibe lâexpression dâexsA (Iyoda et Watanabe, 2005;Sircili et al., 2004;Sperandio et al., 2003) (figure 7). II B-4. Un schĂ©ma de rĂ©gulation commun Bien quâils prĂ©sentent des rĂ©seaux de rĂ©gulation diffĂ©rents, les SSTT de ces diffĂ©rents bacilles Ă Gram nĂ©gatif possĂšdent le mĂȘme principe de rĂ©gulation. Lâactivateur principal est un membre de la famille AraC et son activitĂ© dĂ©pend de ses interactions avec une autre protĂ©ine. Au sommet de la cascade se trouve un rĂ©gulateur nĂ©gatif, codĂ© par lâun des opĂ©rons du SSTT, qui est une protĂ©ine secrĂ©tĂ©e par le SSTT. Les divergences se rencontrent au niveau des dĂ©tails de rĂ©gulation et dâinteraction avec cet inhibiteur (figure 8). Chez Salmonella et Shigella, la protĂ©ine qui lie le rĂ©gulateur principal (InvF et MxiE) est une chaperonne des toxines du SSTT (SicA et IpgC) qui agit comme un co-activateur. Chez Yersinia, le complexe Figure 7 : RĂ©gulation du SSTT (cluster LEE) chez les E. coli entĂ©ropathogĂšnes (EPEC) et entĂ©rohĂ©moragiques (EHEC). Les protĂ©ines, molĂ©cules et interactions retrouvĂ©es chez les EPEC sont symbolisĂ©es en rouge, chez les EHEC en bleu et chez les deux types dâE.coli pathogĂšnes en noir. Comme pour P. aeruginosa, on voit quâil existe des boucles de rĂ©trocontrĂŽle positives et nĂ©gatives pour la rĂ©gulation du SSTT et que RpoS rĂ©prime le SSTT en agissant sur le rĂ©gulateur clĂ© du systĂšme. Ler GrlR GrlA PerABC PchABC LEE H-NS RpoS QseA Quorum sensing: LuxS-AI2 / AI3 Ler GrlR GrlA PerABC PchABC LEE H-NS RpoS QseA Quorum sensing: LuxS-AI2 / AI3
44.
Introduction 33 chaperonne-substrat (YopD-LcrH) et
lâinhibiteur sĂ©crĂ©tĂ© (LcrQ/YscM) lient les ARNm pour empĂȘcher leur traduction. Chez P. aeruginosa, câest lâanti-activateur (ExsD) qui est rĂ©gulĂ© par une chaperonne du SSTT (ExsC). Il semble Ă©galement que la topologie de lâADN, contrĂŽlĂ©e par des protĂ©ines de type histone, ait un rĂŽle dans la rĂ©pression du SSTT. Tous les acteurs de cette rĂ©gulation ne sont pas connus chez toutes les bactĂ©ries. Ainsi, aucun rĂ©presseur sĂ©crĂ©tĂ© nâa encore Ă©tĂ© mis en Ă©vidence chez les E. coli pathogĂšnes et le mĂ©canisme de rĂ©pression par modification de la structure de lâADN nâa pas Ă©tĂ© dĂ©montrĂ© chez P. aeruginosa. Lâensemble des rĂ©seaux de rĂ©gulation montre Ă©galement que lâactivation du SSTT chez les bacilles Ă Gram nĂ©gatif et notamment chez P. aeruginosa, nĂ©cessite lâintĂ©gration de conditions environnementales, en plus dâĂȘtre dĂ©pendante du contact avec son hĂŽte. Ces systĂšmes permettent ainsi lâexpression de plus dâune vingtaine de protĂ©ines en un lieu et un moment prĂ©cis oĂč elles sont vraiment nĂ©cessaires. Figure 8 : Principe de base de la rĂ©gulation des SSTT avec ou sans activation de la sĂ©crĂ©tion. Lâexpression des gĂšnes par lâactivateur principal, de type AraC (A), est bloquĂ©e par un rĂ©presseur (R) qui est sĂ©crĂ©tĂ© par le SSTT lors de lâactivation. Les diffĂ©rents types dâactions possibles du rĂ©presseur sont reprĂ©sentĂ©s mais ne sont pas retrouvĂ©s dans toutes les bactĂ©ries. RSignal dâactivation R GĂšnes du SSTT A A ME MI ME MI RA RA Activateur principal Represseur R A C C R C R C Co-inducteur RSignal dâactivation R GĂšnes du SSTT A A ME MI ME MI RA RA Activateur principal Represseur R A C C R C R C Co-inducteur
45.
Introduction 34 II B-5. SSTT
et mucoĂŻdie Dans le cas dâune infection chronique Ă P. aeruginosa, le SSTT et la capacitĂ© Ă former un biofilm jouent un rĂŽle important. Le SSTT facilite la colonisation lors de la premiĂšre infection et la dissĂ©mination de la bactĂ©rie dans lâhĂŽte une fois lâinfection installĂ©e. Le phĂ©notype mucoĂŻde avec formation du biofilm, permet la persistance de la bactĂ©rie. Cependant, la cytotoxicitĂ© dĂ©pendante du SSTT peut ĂȘtre difficilement associĂ©e au dĂ©veloppement sous forme de biofilm puisque le SSTT est rĂ©primĂ© sous ce mode de croissance. Le dĂ©veloppement de nouvelles thĂ©rapies contre P. aeruginosa, en particulier lors dâune infection pulmonaire chronique, bĂ©nĂ©ficierait grandement de la comprĂ©hension des mĂ©canismes conduisant Ă cette rĂ©pression. Dans cette optique, nous avons voulu dĂ©terminer quels sont les mĂ©canismes mis en jeu pour le passage dâune bactĂ©rie mobile, non mucoĂŻde, avec un SSTT actif Ă une bactĂ©rie mucoĂŻde avec un SSTT rĂ©primĂ© ? Le quorum sensing qui joue un rĂŽle important dans la formation du biofilm et la rĂ©gulation de nombreux facteurs de virulence pourrait ĂȘtre un des mĂ©canismes impliquĂ©s (Kuchma, Connolly, et O'Toole, 2005).
46.
Introduction 35 III. Le Quorum
Sensing III-A. GĂ©nĂ©ralitĂ©s Face Ă une modification de leur environnement, les bactĂ©ries ont besoin de coordonner la rĂ©ponse dans lâensemble de la population en modifiant un grand nombre de gĂšnes. Cette rĂ©gulation est notamment permise par une communication intercellulaire, que lâon pensait jusquâil y a peu de temps rĂ©servĂ©e aux organismes pluricellulaires. Les bactĂ©ries produisent en effet des molĂ©cules de signalisation diffusibles qui sâaccumulent dans lâenvironnement au cours de la croissance. Ces phĂ©romones bactĂ©riennes permettent Ă chaque cellule de « sentir » lorsquâune unitĂ© de population ou quorum bactĂ©rien (ou densitĂ© de population) est atteint et dâinitier un comportement concertĂ© de toute la population bactĂ©rienne. Lorsque la densitĂ© de population devient suffisante, ce mĂ©canisme de rĂ©gulation globale, dĂ©fini par le terme de « quorum sensing », permet aux bactĂ©ries de coordonner rapidement au sein de la population, lâexpression de gĂšnes spĂ©cifiques. DĂ©crit pour la premiĂšre fois chez Vibrio fischeri pour le phĂ©nomĂšne de bioluminescence, ce mĂ©canisme a Ă©tĂ© aujourdâhui identifiĂ© chez de nombreuses bactĂ©ries (Ă Gram-nĂ©gatif et Ă Gram-positif). Il est connu pour rĂ©guler, en fonction de la densitĂ© de population, des processus impliquĂ©s dans lâadaptation mĂ©tabolique et la virulence : production de facteurs de virulence, dĂ©veloppement de la compĂ©tence gĂ©nique, formation du biofilm et mobilitĂ© (de Kievit et Iglewski, 2000;Kleerebezem et al., 1997;Withers, Swift, et Williams, 2001). RĂ©cemment, il a Ă©tĂ© montrĂ© que ce mĂ©canisme de rĂ©gulation globale semble pouvoir intervenir aux diffĂ©rents stades de la croissance bactĂ©rienne et durant les phĂ©nomĂšnes de stress (Van Delden, Comte, et Bally, 2001). La rĂ©gulation via le quorum sensing sâeffectue toujours selon le mĂȘme modĂšle avec des variations spĂ©cifiques Ă chaque organisme. Le quorum sensing fait intervenir trois acteurs principaux : un signal Ă©galement appelĂ© autoinducteur, un mĂ©canisme permettant la synthĂšse de ce signal et un rĂ©gulateur transcriptionnel. Bien que le
47.
Introduction 36 mécanisme de quorum
sensing soit retrouvĂ© chez les bactĂ©ries Ă Gram nĂ©gatif et Ă Gram positif, les acteurs sont trĂšs diffĂ©rents et peuvent ĂȘtre classĂ©s en trois groupes : le systĂšme LuxI/R chez les bactĂ©ries Ă Gram nĂ©gatif qui utilise gĂ©nĂ©ralement des homosĂ©rines lactones comme signal, le systĂšme des bactĂ©ries Ă Gram positif avec des oligopeptides modifiĂ©s comme autoinducteur, et les systĂšmes hybrides (Henke et Bassler, 2004). La figure 9 rĂ©sume ces trois systĂšmes et prĂ©sente des exemples de diffĂ©rents autoinducteurs et systĂšmes rĂ©gulĂ©s par le quorum sensing. III A-1. Le quorum sensing chez les bactĂ©ries Ă Gram positif : Oligopeptides et RĂ©gulateurs Ă deux composants Chez les bactĂ©ries Ă Gram positif le signal est un oligopeptide, obtenu Ă partir dâun prĂ©curseur protĂ©ique et sĂ©crĂ©tĂ© via un transporteur ABC. Lorsque la concentration de ce peptide dans le milieu atteint le seuil de stimulation, il est dĂ©tectĂ© par un systĂšme de signalisation Ă deux composants (senseur-rĂ©gulateur). Lâinteraction du peptide avec le senseur provoque lâautophosphorylation et lâactivation de celui-ci qui transfĂšre alors un groupement phosphate sur le rĂ©gulateur. Le rĂ©gulateur phosphorylĂ© active alors la transcription de gĂšnes cibles (Surette et Bassler, 1998). Le quorum sensing chez les bactĂ©ries Ă Gram positif est notamment impliquĂ© dans lâacquisition de la compĂ©tence gĂ©nĂ©tique chez Bacillus subtilis et la virulence chez Staphylococcus aureus (Kleerebezem et al., 1997;Yarwood et Schlievert, 2003).
48.
Introduction 37 Figure 9 :
Les trois principaux groupes de quorum sensing : LuxI/R , Oligopeptides et systĂšme Ă deux composants, et le systĂšme hybride. Les pentagones rouge reprĂ©sentent les acyl homosĂ©rines lactones (AHLs) ; les lignes bleues les oligopeptides et les triangles oranges lâautoinducteur 2 (AI-2). Les principaux autoinducteurs et systĂšmes, contrĂŽlĂ©s par le quorum sensing, les plus Ă©tudiĂ©s sont exposĂ©s sous chaque groupe. HPt, histidine phosphotranfĂ©rase ; P, phosphate ; RR, rĂ©gulateur de rĂ©ponse ; SHK, senseur histidine kinase (Henke et Bassler 2004).
49.
Introduction 38 III A-2. Le
quorum sensing chez les bactĂ©ries Ă Gram nĂ©gatif : le systĂšme LuxI/LuxR Ce systĂšme de quorum sensing est mĂ©diĂ© par des acyl-homosĂ©rines lactones (acyl- HSLs) produites par une synthase nommĂ©e I et reconnues par un rĂ©gulateur R (figure 10). A faible densitĂ© cellulaire, le niveau basal dâexpression de la synthase est faible. Les acyl-HSLs diffusent dans le milieu et sâaccumulent au cours de la croissance. Lorsque la concentration atteint un seuil, lâacyl-HSL interagit avec son rĂ©cepteur spĂ©cifique. La formation de ce complexe entraĂźne la modulation de lâexpression des gĂšnes cibles dont le gĂšne de la synthase I, dâoĂč lâappellation dâautoinducteur pour les acyl-HSLs. Du fait de la diffusion du signal et de cette boucle dâauto-induction, l'induction d'une bactĂ©rie induit celle des bactĂ©ries voisines aboutissant ainsi Ă une rĂ©ponse coordonnĂ©e de l'ensemble de la population. Peu de bactĂ©ries Faible [acyl-HSL] GĂšnes cibles Ă©teints Croissance bactĂ©rienne Augmentation [acyl-HSL] GĂšnes cibles Ă©teints Quorum bactĂ©rien Autoinduction [acyl-HSL] GĂšnes cibles actifs r i I Substrat ir I Substrat + + Autoinduction Acyl-HSL Variation gĂ©notypique/phĂ©notypique Communication cellulaire GĂšnes cibles R R R Figure 10 : MĂ©canisme du quorum sensing mĂ©diĂ© par les homosĂ©rines lactones. r/R : rĂ©gulateur (gĂšne/protĂ©ine) ; i/I : synthase (gĂšne/protĂ©ine), [acyl-HSL] : concentration en acyl-HSL.
50.
Introduction 39 IIIA 2-a) Les
acyl-homosĂ©rines lactones De nombreuses acyl-HSLs sont produites par les bactĂ©ries. Elles se diffĂ©rencient par leur chaĂźne acyl. Ces molĂ©cules diffusent librement Ă travers la paroi bactĂ©rienne dans le cas du signal C4-HSL de P. aeruginosa ou font lâobjet dâun transport actif par le biais de pompes dâefflux pour le signal 3-oxo-C12-HSL de la mĂȘme bactĂ©rie (Pearson, Van Delden, et Iglewski, 1999). La longueur de la chaĂźne carbonĂ©e du groupe acyl, influençant lâhydrophobicitĂ© de la molĂ©cule, dĂ©terminerait son mode de transport. IIIA 2-b) Les synthases I Trois familles de synthases dâacyl-HSLs ont Ă©tĂ© dĂ©crites et groupĂ©es selon leurs homologies de sĂ©quences. Chaque classe ne partage aucune homologie avec les autres. La classe I regroupe les enzymes possĂ©dant une similaritĂ© avec LuxI (V. fischeri) (Fuqua et Greenberg, 1998). La classe II regroupe aujourdâhui les enzymes LuxM (V. harveyi), AinS (V. fischeri) et VanM (V. anguillarum) (Gilson, Kuo, et Dunlap, 1995;Milton et al., 2001). La derniĂšre classe (III) possĂšde actuellement un seul membre, HdtS, isolĂ© chez P. fluorescens (Laue et al., 2000). Bien que ces enzymes soient diffĂ©rentes, le mĂ©canisme de synthĂšse des acyl-HSLs reste identique. Ces synthases catalysent la liaison de la S-adĂ©nosyl-mĂ©thionine (SAM) avec la chaĂźne dâacide gras dâune acyl-acyl-carrier protein (acyl-ACP), suggĂ©rant une convergence au cours de lâĂ©volution dans le mĂ©canisme de synthĂšse des autoinducteurs. IIIA 2-c) Les rĂ©gulateurs R Deux classes de rĂ©gulateurs ont Ă©tĂ© dĂ©crites. Les rĂ©gulateurs dits de classe I, de la famille LuxR (V. fischeri) agissent sous forme dimĂ©rique et sont constituĂ©s de deux modules fonctionnels : â un domaine de liaison Ă lâhomosĂ©rine lactone en partie N-terminale. â un domaine rĂ©gulateur de la transcription avec un motif hĂ©lice-tour-hĂ©lice de fixation Ă lâADN.
51.
Introduction 40 La liaison de
lâautoinducteur avec le rĂ©gulateur induit une modification de structure rendant le domaine rĂ©gulateur accessible et fonctionnel. La seconde classe de rĂ©gulateurs nâa pour lâinstant Ă©tĂ© mise en Ă©vidence que chez le genre Vibrio. Il sâagit de protĂ©ines homologues aux senseur-rĂ©gulateur hybrides intervenant dans les systĂšmes de rĂ©gulation Ă deux composants. Ils nĂ©cessitent lâintervention dâautres partenaires pour rĂ©pondre aux autoinducteurs. Ces systĂšmes de type LuxI/R semblent exclusivement rĂ©servĂ©s Ă la communication au sein dâune espĂšce. Chacune produit un signal qui diffĂšre de celui produit par la plupart des autres bactĂ©ries et les rĂ©gulateurs sont trĂšs sensibles Ă la structure de lâautoinducteur. Une petite modification de la molĂ©cule induit une absence de reconnaissance par le senseur voire une inhibition du systĂšme. Les bactĂ©ries semblent cependant avoir dĂ©veloppĂ© un mĂ©canisme de communication entre espĂšces diffĂ©rentes toujours basĂ© sur le mode quorum sensing. III A-3. La communication inter espĂšces : le cas du signal AI2 et de la synthase LuxS La premiĂšre communication inter-espĂšces, via un mĂ©canisme de quorum sensing diffĂ©rent de celui mĂ©diĂ© par les acyl-HSLs ou les oligopeptides, a Ă©tĂ© mise en Ă©vidence par Bassler en 1999 entre E. coli, S. typhimurium et V. harveyi (Surette, Miller, et Bassler, 1999). Dâabord dĂ©couvert chez V. harveyi, le signal nommĂ© AI2, est produit par un grand nombre de bactĂ©ries Ă Gram positif et Ă Gram nĂ©gatif et nĂ©cessite la prĂ©sence de la protĂ©ine LuxS. Contrairement aux autres signaux quorum sensing, la voie de synthĂšse et les intermĂ©diaires pour la production de lâAI2 sont identiques dans toutes les bactĂ©ries Ă©tudiĂ©es produisant lâAI2. Chez la plupart des bactĂ©ries rĂ©pondant au signal AI2, celui-ci est impliquĂ© dans la formation de biofilm regroupant plusieurs espĂšces et dans la rĂ©gulation de facteurs de virulence entre espĂšces (Fong et al., 2001;McNab et Lamont, 2003). Cependant le mĂ©canisme de reconnaissance et de transmission du signal nâa Ă©tĂ© mis Ă jour que chez trois espĂšces (V. harveyi, V. cholerae, S. typhimurium). Ce type de quorum sensing pourrait ĂȘtre un signal supplĂ©mentaire pour lâadaptation Ă un nouvel environnement multi bactĂ©rien. Dans le cas de bactĂ©ries pathogĂšnes, la
52.
Introduction 41 détection de ce
signal permettrait lâexpression de systĂšmes en adĂ©quation avec lâenvironnement. Câest ce que suggĂšrent les rĂ©sultats obtenus par Duan et al. En effet, lors dâinfections pulmonaires chez le rat par P. aeruginosa en prĂ©sence de flore oropharyngĂ©e, les lĂ©sions causĂ©es par le pathogĂšne sur le tissu sont plus importantes (Duan et al., 2003). III-B. Le quorum sensing chez P. aeruginosa La rĂ©gulation via le quorum sensing est essentielle dans la pathogĂ©nie de P. aeruginosa notamment lors des infections pulmonaires chroniques. Elle contrĂŽle entre autres lâadhĂ©sion, la formation de biofilm, et lâexpression dâune batterie de facteurs de virulence permettant Ă la fois la progression de lâinfection et la persistance des bactĂ©ries dans les poumons (Imamura et al., 2005;Smith et Iglewski, 2003). P. aeruginosa possĂšde deux systĂšmes complets de quorum sensing basĂ©s sur les homosĂ©rines lactones nommĂ©s LasI/R et RhlI/R (figure 11). LasI, appartenant Ă la famille des synthases de type LuxI, synthĂ©tise la molĂ©cule signal 3-oxo-C12-HSL. Ce premier autoinducteur appelĂ© PAI1 (Pseudomonas AutoInducer 1) se lie au rĂ©gulateur LasR, homologue Ă LuxR (Gambello et Iglewski, 1991;Pearson et al., 1994). Le couple LasR-PAI1 rĂ©gule lâexpression dâune variĂ©tĂ© de gĂšnes cibles. Il active notamment lâexpression de facteurs de virulence tels que les Ă©lastases LasA et LasB et lâexotoxine A (ToxA). Ce premier systĂšme de QS rĂ©gule aussi de façon positive certains gĂšnes constituant lâappareil de sĂ©crĂ©tion de type II en activant lâopĂ©ron xcp (Smith et Iglewski, 2003) couplant ainsi la synthĂšse des toxines et des constituants du systĂšme permettant leur export. Une fois activĂ© par la 3-oxo-C12- HSL, LasR active Ă©galement le gĂšne lasI crĂ©ant ainsi une boucle dâauto-induction (Seed, Passador, et Iglewski, 1995).
53.
Introduction 42 Le second systĂšme
de rĂ©gulation par quorum sensing chez P. aeruginosa est codĂ© par les gĂšnes rhlI et rhlR. RhlI catalyse la synthĂšse dâune HSL, la C4-HSL (Ochsner et Reiser, 1995). Ce second autoinducteur, nommĂ© PAI2, se lie au rĂ©gulateur RhlR pour lâactiver. Le complexe RhlR-C4-HSL rĂ©gule notamment lâexpression des gĂšnes lasR lasI LasR lasR LasI rhlR rhlI RhlI RhlR + ActivĂ© ActivĂ© Inactif Inactif rpoS RpoS Adaptation Ă la phase stationnaire / Stress ToxA LasA PQS 3-oxo-C12-HSL C4-HSL LasB Xcp Pyocyanine Lipases + RhlR pqsR pqsABCDE phnAB pqsH lasR + - + -3-oxo-C12- HSL PqsR PqsR PQS QscR + RsaL - ++ + Vfr, GacA + + + + C4-HSL RpoS RpoS + +/- GĂšnes cibles + rsaL Figure 11 : Principales protĂ©ines et rĂ©seaux dâinteractions impliquĂ©s dans le mĂ©canisme de quorum sensing chez Pseudomonas aeruginosa. (â) inhibition, (+) activation
54.
Introduction 43 lasB, xcp et
rhlAB (nĂ©cessaire Ă la production des rhamnolipides) et la production de mĂ©tabolites secondaires tels que la pyocyanine et le cyanure (opĂ©ron hcnAB). Les deux systĂšmes de rĂ©gulation par quorum sensing chez P. aeruginosa sont organisĂ©s en cascade. Le systĂšme LasI/R exerce une rĂ©gulation Ă deux niveaux sur le systĂšme RhlI/R. Au niveau transcriptionnel, Latifi et al. et Pesci et al. ont montrĂ© que RhlR est activĂ©e par le couple LasR-PAI1 (Latifi et al., 1996;Pesci et al., 1997). Au niveau post-transcriptionnel, la 3-oxo-C12-HSL entre en compĂ©tition avec la C4- HSL pour la liaison au rĂ©gulateur RhlR, rĂ©sultant en un complexe inactif (Pesci et al., 1997). Les synthases LasI et RhlI produisent Ă©galement dâautres homosĂ©rines que les PAI1 et PAI2 qui pourraient Ă©galement jouer le rĂŽle de compĂ©titeur et moduler les interactions autoinducteur-rĂ©cepteur (Pearson et al., 1994;Winson et al., 1995). Bien que ces deux systĂšmes soient imbriquĂ©s, ils ne contrĂŽlent pas les mĂȘmes ensembles de gĂšnes. Plusieurs Ă©tudes dâanalyse de transcriptome et de protĂ©ome ont mis en Ă©vidence que les gĂšnes rĂ©gulĂ©s par le quorum sensing peuvent ĂȘtre regroupĂ©s en trois classes : ceux rĂ©gulĂ©s exclusivement par un des autoinducteurs (le gĂšne toxA, les gĂšnes pour la production de pyocyanine) et ceux nĂ©cessitant les deux autoinducteurs simultanĂ©ment pour voir leur expression modifiĂ©e (lâopĂ©ron xcp). De plus, ces classes de gĂšnes sont exprimĂ©es Ă des stades diffĂ©rents de la croissance bactĂ©rienne (Arevalo-Ferro et al., 2003;Hentzer et al., 2003;Schuster et al., 2003;Wagner et al., 2003;Wagner, Gillis, et Iglewski, 2004). Ces Ă©tudes indiquent que lâarchitecture en cascade des deux systĂšmes de quorum sensing induit une expression de gĂšnes sĂ©quentielle permettant probablement la mise en place des processus prĂ©coces et tardifs lors dâune infection. En plus des deux homosĂ©rines majoritaires, P. aeruginosa produit une 2-hepthyl-3- hydroxy-4-quinolone (PQS, Pseudomonas Quinolone Signal) (Pesci et al., 1999). Contrairement aux PAI1 et PAI2 dont la concentration est maximale lors de la transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance, la concentration du PQS dans le surnageant de culture est maximale Ă forte densitĂ© cellulaire ce qui correspond Ă une fin de phase stationnaire de croissance en milieu riche (aprĂšs 30 Ă 42 heures post inoculation) (McKnight, Iglewski, et Pesci, 2000). La synthĂšse du PQS nĂ©cessite lâexpression des protĂ©ines codĂ©es par les opĂ©rons pqsABCDE, phnAB et pqsH (D'Argenio et al., 2002;Gallagher et al., 2002). La transcription de ces gĂšnes nĂ©cessite la prĂ©sence du rĂ©gulateur PqsR (aussi nommĂ©
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Introduction 44 MvfR) (Cao et
al., 2001;Deziel et al., 2005;Gallagher et al., 2002). DâaprĂšs les Ă©tudes rĂ©alisĂ©es par les Ă©quipes de Deziel et al. et Wade et al., ce rĂ©gulateur contrĂŽle lâexpression de nombreux gĂšnes impliquĂ©s dans la virulence dont ceux des opĂ©rons phnAB, et pqsABCDE (Deziel et al., 2005;Wade et al., 2005). Ce signal PQS est imbriquĂ© dans les mĂ©canismes de quorum sensing. En effet la synthĂšse du PQS est sous la dĂ©pendance des systĂšmes LasI/R et RhlI/R qui contrĂŽlent lâexpression du gĂšne pqsR (Wade et al., 2005). Le complexe LasR-PAI1 a un effet positif sur la transcription de pqsR tandis que le couple RhlR-PAI2 a un effet nĂ©gatif. Lâexpression de PqsR induit la production de PQS qui peut alors se lier Ă PqsR et facilite sa liaison au promoteur de lâopĂ©ron pqsABCDE. Cette boucle de rĂ©troaction positive dans la production du PQS en fait un co-inducteur. Le complexe PqsR-PQS active Ă©galement la transcription de rhlI, formant cette fois une rĂ©troaction nĂ©gative. Cet effet nâest visible que chez un mutant lasR ce qui suggĂšre que cela se produit lorsque lasR nâest pas exprimĂ© (Gallagher et al., 2002). Ces trois systĂšmes de communication intercellulaire sont fortement impliquĂ©s dans la pathogĂ©nicitĂ© de la bactĂ©rie. Les diffĂ©rents mutants des rĂ©gulateurs ou des voies de synthĂšse des signaux possĂšdent une cytotoxicitĂ© moins Ă©levĂ©e que les souches parentales. Jusqu'Ă prĂ©sent, il nâa pas Ă©tĂ© mis en Ă©vidence que P. aeruginosa est capable de produire le signal de communication inter espĂšces AI2, synthĂ©tisĂ© par les homologues de la synthase LuxS (voir chapitre III A-3). Le surnageant de culture de P. aeruginosa nâinduit pas dâactivation des biodĂ©tecteurs pour ce signal et il nâexiste pas dâhomologue Ă LuxS dans le gĂ©nome de P. aeruginosa. Cependant, les Ă©lĂ©ments pour rĂ©pondre au signal AI2 sont prĂ©sents comme lâont montrĂ© Duan et al. Lâaddition dâAI2 dans le milieu de culture active lâexpression de facteurs de virulence, notamment LasB et lâexotoxine T (Duan et al., 2003). Les Ă©tudes utilisant une approche globale Ă lâaide de puces Ă ADN, pour dĂ©finir les rĂ©gulons des systĂšmes LasI/R et RhlI/R, ont montrĂ© quâenviron 40% des gĂšnes contrĂŽlĂ©s par le quorum sensing, le sont aussi par le facteur sigma alternatif RpoS. Ce facteur de transcription rĂ©gule un ensemble de gĂšnes en rĂ©ponse Ă lâentrĂ©e en phase stationnaire de croissance et Ă diffĂ©rents stress dont la chaleur, lâaugmentation dâosmolaritĂ©, un pH bas ou la prĂ©sence de peroxyde dâhydrogĂšne. Le rĂŽle de RpoS
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Introduction 45 dans la régulation
par le quorum sensing a Ă©tĂ© longtemps controversĂ©. Deux travaux ont montrĂ©, Ă lâaide dâune analyse de transcriptome et par une fusion entre le promoteur du gĂšne rpoS et le gĂšne lacZ, que le complexe RhlR-PAI2 active la transcription de rpoS (Latifi et al., 1996;Wagner et al., 2003). A lâinverse Whiteley et al. dĂ©montrent que la transcription de rpoS nâest pas rĂ©gulĂ©e par le quorum mais que RpoS rĂ©prime lâexpression des gĂšnes de biosynthĂšse du cyanure (hcnABC), probablement en inhibant la transcription de rhlI. Ces rĂ©sultats ont Ă©tĂ© rĂ©cemment complĂ©tĂ©s et unifiĂ©s par Schuster et al. RpoS est activĂ©e par RhlR couplĂ©e Ă la C4- HSL et stimule en retour la transcription de LasR et RhlR (Schuster et al., 2004). La rĂ©gulation des gĂšnes contrĂŽlĂ©s par le quorum sensing (activation ou rĂ©pression) en phase stationnaire est probablement dirigĂ©e en partie par RpoS. Un autre facteur sigma alternatif rĂ©gule le quorum sensing, RpoN. Ce rĂ©gulateur est responsable de lâadaptation du mĂ©tabolisme lors dâune carence en azote. Il contrĂŽle Ă©galement lâexpression de certains gĂšnes impliquĂ©s dans des processus de virulence tels que ceux permettant la production dâalginate ou la formation des pili (Ishimoto et Lory, 1989;Kimbara et Chakrabarty, 1989). Thompson et al. en 2003 ont montrĂ© quâune bactĂ©rie mutĂ©e dans le gĂšne rpoN possĂšde une transcription rĂ©duite de rhlI ainsi quâune production moins importante de C4-HSL lors dâune culture en milieu pauvre en nutriments (milieu M9) par rapport Ă la souche parentale. Dans les mĂȘmes conditions de culture, ce mutant montre Ă©galement une diminution de lâexpression de certains systĂšmes contrĂŽlĂ©s par le quorum sensing (production de pyocyanine, formation du biofilm) (Thompson et al., 2003). Ainsi rhlI est sous le contrĂŽle positif de RpoN et cette rĂ©gulation est dĂ©pendante de lâenvironnement nutritionnel. Un autre systĂšme impliquĂ© dans la rĂ©ponse stringente provoquĂ©e par une carence en acides aminĂ©s, chez les bactĂ©ries, est un activateur du quorum sensing, la signalisation par les polyphosphoguanosines (ppGpp) synthĂ©tisĂ©es par la protĂ©ine RelA. Ce mĂ©canisme sâactive lors dâune carence en nutriments. Lâexpression de la synthase RelA dâE. coli, dans une culture en phase exponentielle, induit une expression prĂ©coce de facteurs impliquĂ©s dans le QS dont les autoinducteurs (Van Delden, Comte, et Bally, 2001). Lâanalyse de la sĂ©quence gĂ©nique entre lasI et lasR a permis dâidentifier une protĂ©ine de 80 acides aminĂ©s nommĂ© RsaL. La transcription de rsaL est activĂ©e par le complexe LasR-PAI1 et RsaL rĂ©prime lâexpression de lasI (de Kievit et al.,
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