1. การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) นักเรียนผู้ทำโครงงาน นายอานนท์ แซ่เล้า รหัสประจำตัว 04689 นักเรียนชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 6/8

2. ที่มาและความสำคัญ โรคไตผิดปกติในการขับกรด ( D istal Renal Tubular Acidosis ) เป็นโรคที่พบได้บ่อยและเป็นปัญหาสาธารณสุขของคนไทย ผู้ป่วยโรคนี้มีความผิดปกติที่ท่อส่วนปลายของเนฟรอน (distal nephron) ทำให้ไม่สามารถขับกรดออกทางปัสสาวะ มีกรดคั่งในร่างกาย การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) http :// mednote . co . kr / images / DiurecticNephron . gif

3. ที่มาและความสำคัญ สาเหตุของโรคนี้มี 2 หลักใหญ่คือ สิ่งแวดล้อมและพันธุกรรม - สาเหตุจากสิ่งแวดล้อมที่มีการกล่าวถึง คือ ภาวะขาดโปแตสเซียม และการมีสารแวนนาเดียม (vanadium) สูงในร่างกาย - สาเหตุจากพันธุกรรม คือ การมิวเตชั่นของยีน AE1 ที่มา : http :// en . wikipedia . org / wiki / Portal : Medicine / Selected_Article_Archive_ ( 2007 ) การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) AE1

4. การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) - AE 1 มีทั้งหมด 20 Exon ที่เกิดการมิวเตชั่นส่วนใหญ่คือ Exon 11, 13, 14, 15, 17 และ 18

5. แผนการดำเนินงาน แผนการดำเนินงาน การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) ตุลาคม อภิปรายและสรุปผล สร้าง Haplotype ดำเนินการวิเคราะห์ SNPs รวบรวมตัวอย่างเลือด ศึกษาวิธีการทำ วางแผนการดำเนินงาน พฤศจิกายน กันยายน สิงหาคม กรกฎาคม เดือน

7. Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) http :// www . scq . ubc . ca / wp - content / uploads / 2006/07 / dna1 . gif http :// igridext . cryst . bbk . ac . uk / WWW / PhD_thesis_files / image018 . jpg การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

8. ประเภทของ Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) 1) SNP ในส่วนที่มีการถอดรหัส ( coding SNP ) 2) SNP ในส่วนที่ไม่ถูกถอดรหัส http :// home . biotec . or . th / NewsCenter / my_documents / my_pictures / 38137_col2 . JPG การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

9. SNPs Haplotype การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

10. Polymerase Chain Reaction หรือ PCR Polymerase Chain Reaction หรือ PCR เป็นเทคนิคสำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยอาศัยหลักการ DNA Replication ซึ่งเป็นการสังเคราะห์สายดี เอ็น เอ สายใหม่ จาก ดีเอ็นเอต้นแบบในหลอดทดลองภายในระยะเวลาอันสั้นและได้ดีเอ็นเอสายใหม่เกิดขึ้นเป็นล้านเท่า http :// www . ucl . ac . uk / ~ucbhjow / bmsi / lec5_images / pcr . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

12. ขั้นตอน PCR ใน 1 รอบ http :// users . ugent . be / ~avierstr / principles / pcrsteps . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

13. http :// www . mun . ca / biology / scarr / PCR_sketch_3 . gif

14. http :// users . ugent . be / ~avierstr / principles / pcrcopies . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

15. การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย PCR การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

17. การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย วิธี ASA อาศัยความจำเพาะของไพรเมอร์ในการทำ PCR โดยจะแบ่งไพรเมอร์เป็น 2 แบบ คือ Normal Primer และ Mutant Primer หลักการคือ DNA ปกติ จะเกิดผลิตภัณฑ์ ได้กับ ไพรเมอร์ปกติ ส่วน DNA ที่ Mutant จะเกิด Product ได้กับไพรเมอร์ที่ Mutant Normal Heterozygote Mutant N M N M N M ASA Control การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

19. วิธีการดำเนินงาน สกัด DNA เก็บ Stock DNA ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค PCR ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค ASA หาความเข้มข้นของ DNA ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค RFLP สรุปผลการตรวจสอบ สร้าง Haplotype Block การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

20. สกัด DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

21. สกัด DNA Plasma Buffy coat RBC การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) ตั้งทิ้งไว้ 10 นาที

22. สกัด DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

28. สกัด DNA 27. เติม Chloroform+Isoamyl alcohol ในอัตราส่วน 24:1 ให้มีปริมาตรเป็น 1 เท่า ของที่มีอยู่ 28. เขย่า 100 ที แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) 29. ดูดชั้น organic phase ( ชั้น Chloroform ) ทิ้งโดยพยายามไม่ให้ดูดชั้นขาวขุ่นทิ้ง ( ชั้นตรงกลาง ) 30. ทำตามขั้นตอนที่ 27-29 ซ้ำ 1-2 ครั้ง 31. สารละลายใส ให้เติม 4M NaCl ปริมาณ 1/10 ของที่มีอยู่ 32. เติม Absolute Ethanol ที่เย็น ( เพื่อตก DNA ) ปริมาณ 2 เท่าของที่มีอยู่ 33. จะปรากฏใย DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

30. เก็บ Stock DNA นำหลอด DNA ที่ละลายใน TE แล้ว ไป Centrifuge ด้วยระบบ Quick run โดยการกดปุ่ม Quick run ค้างไว้ DNA ที่ละลายใน TE Transfer DNA ลงในหลอด Efpendrop เก็บรักษาในตู้ Freeze ที่อุณหภูมิ -25 o C ใช้ระบบ Quick run Eppendrop ขนาด 1.6 ml การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

31. หาความเข้มข้นของ DNA Dilute DNA 25 เท่า ปริมาณ 1000 µl น้ำที่ sterile แล้ว 960 µl DNA จาก Stock 40 µl Mix ให้เข้ากันดี แปลค่า OD 260nm เป็นค่าความเข้มข้น [OD 260nm = 1 = 50 ng/ µl ] หาค่า OD ด้วยเครื่อง Spectrophotometer โดยใช้ความยาวคลื่น 260 nm และ 280 nm การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

32. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค PCR Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ณ บริเวณ Exon 11 ด้วย Primer Exon 11 ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

33. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค RFLP Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ณ บริเวณ Exon 17 ด้วย primer exon 17 ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ Hpa II ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ที่ตัดแล้ว ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

34. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค ASA Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ด้วยเครื่อง PCR โดยใช้เทคนิค ASA รัน DNA ที่ PCR แล้วด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

35. ผลการทดลอง ภาพที่ 1 แสดงการรันเจล Exon 11 ของยีน AE1 การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

36. ผลการทดลอง ภาพที่ 2 แสดงการรันเจล Exon 11 และ 17 ที่ถูกตัดด้วย Hpa II แล้ว การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

37. ผลการทดลอง ภาพที่ 3 แสดงการรันเจล Exon 17 ของยีน AE1 ที่ถูกตัดด้วย Hpa II แล้ว การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

38. ภาพที่ 4 แสดงการรันเจล Exon 17 ตัวอย่างที่ 4-19 ของยีน AE1 ที่ถูกตัดด้วย Hpa II แล้ว ผลการทดลอง การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

39. สรุปและวิเคราะห์ผลการทดลอง จากผลการทดลอง มีผู้ที่เป็นโรคไตผิดปกติในการขับกรดทั้งหมด 3 คน ซึ่งในจำนวนนี้ เป็นผู้ที่มีความผิดปกติที่ Exon 11 จำนวน 2 คน คือตัวอย่างที่ 16 และ 18 และ เป็นผู้ที่มีความผิดปกติที่ Exon 17 อีก 1 คนคือหมายเลข 19 ซึ่งเป็นแบบ Homozygote ทำให้เกิดโรคได้ทันที แต่ตัวอย่างที่ 17 ที่มีความผิดปกติที่ Exon 17 เป็นความผิดปกติของยีนแบบ Heterozygote จึงไม่เป็นโรค นอกจากนี้ยังมีอีก 1 คน ( หมายเลข 18 ) ที่เป็นโรคนี้โดยที่มีการมิวเตชั่นทั้ง Exon 11 และ 17 เรียกว่า Compound Heterozygote การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

40. สรุปและวิเคราะห์ผลการทดลอง ความผิดปกติของยีนที่เกิดขึ้นบริเวณ Exon 11 เป็นการมิวเตชั่นแบบ Deletion คือมีการขาดหายไปของลำดับเบส ทำให้กรดอะมิโนขาดหายไป ส่วนความผิดปกติที่ Exon 17 นั้นเกิดจาก SNPs ที่เปลี่ยนแปลงจาก G เป็น A หรือ T ซึ่งเป็นผลให้เอนไซม์ไม่สามารถตัดได้ ภาพที่ 5 บริเวณที่ถูกตัดด้วย Hpa II T C C G G C T T A G G C C G A A SNPs การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

41. ข้อเสนอแนะ 1. ในการเลือก Exon ควรเลือก Exon ที่มีการกลายพันธ์ที่หลากหลายกว่านี้ 2. ควรเพิ่ม Exon ที่จะศึกษา เพื่อนำไปสร้าง Haplotype block แล้วค่อยนำมา ศึกษา 3. ควรรวบรวมตัวอย่างเลือดเป็นครอบครัว เพื่อศึกษาการถ่ายถอดของยีนด้วย การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )

42. เอกสารอ้างอิง สมาคมพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย . 2548. สาระน่ารู้อณูพันธุศาสตร์ . เท็กซ์ แอนด์ เจอร์นัล พับลิเคชั่น . ไทย . Sambrook and Russell. 2001 . Molecular Cloning : A Laboratory Manual Volume 2 . 3 rd ed. . Cold Spring Harbor Laboratory Press. การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) Sambrook and Russell. 2001 . Molecular Cloning : A Laboratory Manual Volume 1 . 3 rd ed. . Cold Spring Harbor Laboratory Press.