1. INTRODUCERE
-acum 10.000 de ani - creşterea plantelor agricole şi a animalelor pentru a obţine
acu 0.000 a c eş e ea p a e o ag co e ş a a e o pe u obţ e
mâncare şi haine.
-acum 6.000 de ani - în procesele biologice încep să se utilizeze microorganismele,
pentru diversifica gama de produse alimentare (tipuri diferite de pâine, de brânză), şi
pentru a conserva produsele alimentare pe o perioada mai lungă de timp
-perioada ’60 – ’70 – utilizarea constituientilor celulari în procesele biotehnologice
1. Ce este biotehnologia?
Bio
Bi –sugerează utilizarea proceselor bi l i
ă tili l biologice;
Tehnologie –sugerează realizarea produşilor prin utilizarea de diferite tehnici
definiţie de ansamblu utilizarea controlată sau deliberată a “agenţilor biologici”
(celule vii sau moarte, sau componente ale acestora) în
cadrul unor operaţii tehnice, sau în cadrul unor procese
tehnologice care duc la obţinerea unui produs finit
domeniu larg d l totalitatea tehnicilor bi l i utilizate î agricultură până l
d i l de la li h i il biologice ili în i l ă â ă la
cele utilizate la prepararea mâncării
Federaţia Europeană de Biologie (1978)
Utilizarea integrală a biochimiei microbiologiei şi ingineriei în scopul
biochimiei,
obţinerii unei aplicaţii tehnologice (industriale), cu ajutorul
microorganismelor, culturilor de celule şi a părţilor componente ale
acestora
2. Exemple:
Exemple:
-biotehnologia fermentaţiei, cum este cunoscută astăzi, îşi are originea în introducerea
pe u p a oa ă seco u a
pentru prima oară în secolul al IX-lea a agenţilor microbiologici în anumite procese
ea age ţ o c ob o og c a u e p ocese
de fermentaţie şi nu în descoperirea vinului sau a verzei acre sau în înţelegerea
proceselor biologice care au loc;
-obţinerea de biomasă din noroiuri active, selecţia şi producerea la scară largă a
microorganismului Clostridia pentru obţinerea de acetonă şi butanol
Aplicaţii în industrie
în
-producerea de biomasă pentru hrana animalelor;
- a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric acidul
citric,
glutamic, unii aminoacizi, antibiotice şi vitamine;
- în industria petrochimică, poate fi utilizată în obţinerea în cantitate mare a etanolului,
acetonei, butanolului,
acetonei butanolului acidului acetic etc;
-este utilizată în obţinerea de produşi celulari din plante şi animale, obţinerea de celule
microbiene modificate pentru a produce antigene, anticorpi sau agenţi terapeutici
diverşi;
ş;
-furnizează agenţi cheie pentru industria alimentară ca de exemplu culturi de celule şi
enzime care duc la o mai bună înţelegere a proceselor şi tehnicilor specifice acestei
industrii;
- are un rol deosebit în tratarea şi purificarea apelor, şi în volatilizarea substanţelor
reziduale.
Definirea termenului din ce în ce mai greu de realizat
3. Principalele direcţii
de dezvoltare a
biotehnologiilor
moderne sunt
determinate:
- d d
de descoperirile
i il
recente din domeniul
biologiei moleculare;
- de cerinţele
societăţii faţă de
anumite aspecte cu
care aceasta se
confruntă, cum ar fi:
criza energetică,
epuizarea rezervelor
p
de hrană de pe
planetă, probleme
ecologice şi de
bioremediere.
Figura 1. Principalele aplicaţii ale biotehnologiei
4. Introducere
Clasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii
microbiene
1. în funcţie de tipul de celule cu care se lucrează: vegetale
animale
2. în funcţie de domeniul în care-şi găseşte aplicaţie deosebim următoarele
categorii de biotehnologii:
- industriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, de
produse alimentare;
- agricole, studiază aspecte privind rezistenţa plantelor la anumiţi factori patogeni
ş
şi a toleranţei faţă de factorii de mediu defavorabili, implicarea în sisteme
ţ ţ p
simbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole şi
obţinerea de noi hibrizi sexuaţi;
- medical veterinare, se referă în special la nutriţia animală, creşterea rezistenţei
animalelor la atacul agenţilor patogeni, reproducere artificială şi predeterminare
a sexului, conservarea resurselor genetice animale;
- ecologice, sunt incluse toate metodele şi tehnicile de epurare biologică a apelor
uzate sau poluate, a aerului sau a solurilor d
t l t l i l il degradate, extracţia d minereuri cu
d t t ţi de i i
ajutorul microorganismelor;
- sănătate publică, crearea unor sisteme de diagnosticare.
5. Introducere
Rolul cercetării fundamentale
satistica globală în viitor cea mai mare parte a industriei va utiliza procedeele de
s s c
satistica g ob v o a a e pa e dus e u a p ocedee e
fermentaţie, inginerie genetică, biologie moleculară ceea ce
imprimă un salt tehnologic covârşitor
natura interdisciplinară etape
1. manipularea genetică a organismului gazdă
- o genă din ADN animal este clonată într-o celulă a unui microorganism.
- se realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniul
biologiei moleculare geneticii şi biochimie;
- tehnicile utilizate sunt tehnici specifice de biologie moleculară, biochimie,
culturi de celule;
- cercetarea se derulează până când se obţin tulpini recombinante stabile iar
nivelul de expresie este cel dorit
2.cultivare- în vederea stabilirii parametrilor optimi - compoziţia mediului, pH,
temperatură, concentraţia oxigenului dizolvat
- se porneşte de la cultivarea microorganismului la scară mică, în flacoane
de 250 – 1.000 ml, sub agitare;
- performanţele organism l i s nt apreciate prin calc larea ratei de
organismului sunt calcularea
creştere, productivitatea specifică, randamentul de obţinere a produsului
finit.
6. Introducere
3. etapa pilot
e apa p o
-un bioreactor de 1, 2 sau 5 litri echipat cu instrumente de măsurare a parametrilor
ce indică performanţele organismului; pot fi încercate diferite tipuri de
p ţ g ; p p
bioreactoare;
-În condiţiile creşterii culturii în bioreactor parametri sunt uşor modificaţi, dar
monitorizarea lor este mai eficientă şi în plus se pot monitoriza parametri care nu
fac obiectul creşterii în flacoane de cultură, ca de exemplu caracteristicile de
spumare ale mediului;
- se identifică limitările impuse de tipul bioreactorului (dacă bioreactorul nu este
aerat celulele mor prin înfometare, dacă agitarea nu este la o viteză optimă celulele
se pot sparge şi astfel creşterea se realizează pe alte căi metabolice);
-se calculează diferiţi parametri cum ar fi: coeficientul de transfer de masă timpul
se masă,
de agitare, viteza de dizolvare a oxigenului, puterea de agitare, etc;
-se decide modul de cultivare cel mai avantajos – sistemul „batch” (discontinuu sau
submers) sau sistemul continuu;
- se realizează un calcul economic de fezabilitate.
7. 4. ridicarea la scară industrială
- ingineriei bioproceselor;
- bioreactoarele sunt mult mai sofisticate au un volum mult mai mare 100 –
sofisticate,
1.000 l;
- rezultatele pot fi mai bune sau mai scăzute faţă de cele obţinute în faza pilot; se
hotărăşte dacă se trece sau nu la producţia industrială;
- se proiectează întreaga instalaţie industrială de fabricare a produsului finit;
- recuperarea produsului finit din mediul de producţie - izolarea şi purificarea
acestuia până la produsul finit;
- etapă dificilă pentru produsele ADN recombinate;
- costurile reprezintă 80-90% din costul total al procesului tehnologic, deoarece
metodele aplicate în laborator nu pot fi extrapolate la scară industrială;
- filtrări, centrifugări, metode mecanice de distrugere a pereţilor celulari, extracţii
cu solvenţi, metode cromatografice cristalizări, uscări;
- sunt mari consumatoare de energie şi timp.
5. Pregătirea pentru introducerea pe piaţă
-ambalat şi vândut;
-produsele farmaceutice noi - testarea pe animale şi apoi pe om;
-produsele alimentare - t t specifice;
d l li t teste ifi
-avize oficiale care sunt în conformitate cu standardele existente pentru fiecare tip
de produs.
8. Operaţii biotehnologice
Cinci aspecte majore care, în aproape toate instalaţiile industriale corespund
stadiilor de procesare
Microbiologie şi biologie celulară Procese (aspecte)
Sistemică Alegerea culturii
Genetică Cultivarea celulelor
Fiziologie Răspunsul dat de celule
Proces tehnologic
Procesul tehnologic
Chimie Recuperarea produsului
1. Alegerea culturii: selecţia, creşterea sau crearea de organisme sau p p ţ
g ţ , ş g populaţii
celulare
2. Cultivarea celulelor
3. Răspunsul dat de celulă
4. Procesul tehnologic
5. Recuperarea produsului
9. CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR
DE INTERES BIOTEHNOLOGIC
De ce microorganismele?
- diversitatea acestora este enormă;
- microorganismele care pot fi utilizate - procariote (bacteriile);
i i l ili i (b iil )
- eucariote (drojdiile şi fungi)
Drojdiile
la producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte specia
Saccharomyces cerevisiae;
pentru obţinerea vinului se folosesc specii de S. cerevisiae, şi ellipsoideus, fie sub formă de
tulpini selecţionate, fie prin fermentaţie spontană realizată cu drojdii epifite;
la fabricarea berii se folosesc cereale germinate ca orzul în Europa, porumbul în America şi
sorgul în Africa. Cele mai utilizate tulpini sunt S. cerevisiae şi S. uvarum care au fost
selecţionate treptat în diferite laboratoare;
la fabricarea pâinii se utilizează S cerevisiae care în timpul dospirii pâinii produce o
S. cerevisiae,
fermentaţie alcoolică cu degajare de dioxid de carbon ce permite afânarea aluatului;
proteinele furajere se obţin prin cultivarea drojdiei pe subproduse industriale (alcani, metanol)
şi reziduuri agricole (zer de lapte, melasă). Adăugate în furajele animalelor, proteinele aduc
un aport d aminoacizi.
de i i i
10. Fungii
Fungii
Materii prime :
subproduse ale industriei alimentare şi reziduuri agricole (zer, melasa de la fabricarea
zahărului din sfecla de zahăr, drojdia de la distilării, paiele etc.);
multe specii saprofite, care se dezvoltă pe resturile organice animale şi vegetale desăvârşind
astfel marele ciclu biologic natural.
cicl nat ral
Aplicaţii
în industria brânzeturilor fungii au un rol important în înmuierea şi aromatizarea pastei,
tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde) verde),
Penicillium camembertii şi Geotrichium candidum (pastă presată);
în industria salamurilor folosirea unui strat alb de Penicillium nalgiovense pe suprafaţa
salamurilor previne dezvoltarea microorganismelor care degradează produsul;
hidroliza amidonului din orez care precede fermentaţia se realizează cu amilaze biosintetice de
Aspergillus oryzae.
în industria chimică şi farmaceutică prin biosinteză se produc:
Enzime – proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;
acizi organici - acid citric cu Aspergillus niger;
antibiotice - penicilina cu tulpina Penicillium chrysogenum, cefalosporinele cu tulpini din
genul Cephalosporium;
hormoni;
h i
biomasă în scopul obţinerii unei surse complementare de proteine pentru furaje animale.
11. Bacterii
Bacteriile acetice (Gluconobacter, Acetobacter)
- fabricarea tradiţională a oţetului de vin, cidru, cartofi;
- obţinerea de vitamină C (oxidarea sorbitolului la sorboză)
Bacteriile lactice (Lactobacillus, Lactococus, Treptococcus)
- fermentează produsele lactate (iaurt, brânză dulce). Ele sunt prezente în mod obişnuit - în
lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);
- în prepararea brânzeturilor participă la formarea cheagului şi la maturarea lui;
- conferă untului gustul şi aroma specifice, prin producerea de acid diacetic;
- producerea de acid lactic la scară industrială
Bacteriile butirice (Clostridium butyricum)
B iil b i i (Cl idi b i )
- intervin în înmuierea inului şi a cânepii deoarece distrug pectina şi astfel eliberează
fibrele textile
Genul Bacillus
- Baccilul thuringiensis – în timpul sporulării produce substanţe toxice care sunt toxice
pentru larve;
- producerea de enzime: proteaze termostabile pentru ind. detergenţilor, α-amilaze,
glucozo izomerază
gl co o i omera ă
Actinomicetele
Bacteriile din genul Corynebacterium şi Brevibacterium şi mutantele derivate
Bacteriile metilotrofe cultivate pe metan sau metanol
Propionibacterium
Bacteriile termofile metanogene
12. Căile de biosinteză a constituienţilor celulari ai microorganismelor
creşterea microbiană
Etape:
- faza de creştere logaritmică;
- faza staţionară;
- faza de declin
Figura 22. Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a – creşterea celulelor şi biosinteza
constituienţilor are loc aproape simultan; b- după creşterea celulelor şi eliberarea metabolitului primar acesta
se transformă în metabolit secundar; c- substratul de creştere rămas după finalizarea creşterii celulelor este
transformat în metabolit secundar
13. Metaboliţii microbieni primari
Procesul microbian tipic în care în timpul fazei de creştere exponenţială (perioada
de lag) se formează un metabolit primar se numeşte fermentaţie alcoolică
Exemplu:
etanolul este metabolitul primar produs în fermentaţia alcoolică aerobă a
drojdiilor sau a unor bacterii în acelaşi timp reprezentând şi un metabolit
energetic
Figura 3. Cinetica procesului de fermentaţie în timpul formării (a) metaboliţilor primari şi
(b) a metaboliţilor secundari
14. Metaboliţii microbieni secundari
Metaboliţii care se formează în timpul fazei staţionare (de creştere sau trofofaza) sau
la finalul acesteia se numesc metaboliţi secundari
Caracteristici:
• sunt sintetizaţi de un număr mic de microorganisme;
• nu sunt importanţi pentru creşterea şi dezvoltarea microorganismului;
• pentru sinteza lor necesită prezenţa unui număr mare de reacţii enzimatice;
• formarea lor este dependentă de condiţiile de creştere şi de compoziţia mediului;
• se prezintă sub forma unui amestec de compuşi cu structură chimică înrudită;
p p ş ;
• de obicei se obţin în cantitate mult mai mare decât metaboliţii primari .
Etape de obţinere:
• trofofaza - este faza de creştere (prefixul „trofo” în limba greacă înseamnă
„creştere”);
• idiofaza – este faza în care se sintetizează metabolitul (prefixul „idio în limba
idio”
greacă înseamnă „ceva propriu”);
15. Interrelaţia dintre căile de biosinteză ale metabolitului primar (diferiţi
acizi organici şi aminoacizi) şi a metaboliţilor secundari (o serie de
antibiotice)
)
Figura 4. Relaţia
dintre calea
metabolică de
obţinere a
aminoacizilor şi a
unor acizi
organici şi
i i i
formarea unor
antibiotice cu
nucleu aromatic
16. Biosinteza şi creşterea
Figura 5. Prezentarea sintetică a principalelor căi anabolice şi catabolice. Sunt prezentate într-o
versiune simplificată numai căile majore de biosinteză şi conexiunile acestora cu căile catabolice
17.
18. Controlul metabolismului
Necesarul de nutrienţi
Majoritatea nutrienţilor, cu excepţia oxigenului şi a câtorva surse de carbon, sunt
preluate din mediul de cultură prin sisteme de transport specifice. Aceste procese
pot fi controlate deoarece o dată ce celula şi-a luat nutrientul în cantitatea necesară
restul d nutrient poate fi î d ă
l de i îndepărtat sau di i
direcţionat pe o altă cale astfel î â să nu
lă l f l încât ă
fie în detrimentul celulei. Aceste sisteme de transport active necesită un aport de
energie.
Compartimentarea
reprezintă a doua formă de control metabolic
exemple:
- mitocondria celulelor eucariote care separă reacţiile ciclului acizilor tricarboxilici de
alte reacţii din citoplasmă;
- î peroxizomi se găsesc enzime care d
în i i ă i degradează acizii graşi şi care sunt separate d
d ă i ii i i t t de
enzimele din citoplasmă care determină sinteza acizilor graşi. Separarea celor două
seturi de enzime previne reciclarea oricărui intermediar comun;
- alte organite (vacuole nucleu cloroplaste etc ) controlează în mod similar alte
(vacuole, nucleu, etc.)
reacţii care au loc în celulă.
20. Controlul sintezei enzimatice
Multe dintre enzime sunt prezente în celulă indiferent de condiţiile de creştere ale
acesteia. O parte di enzime „apar” atunci când este necesar cum ar fi d exemplu
t i t din i ” t i â d t de l
izocitrat liaza din şuntul glioxilatului care apare numai atunci când celulele sunt
crescute pe un substrat C2. Acest proces este denumit „inducerea” sintezei enzimei.
Figura 7. Ciclul glioxilatului.
21. Unele enzime pot să „dispară” atunci când nu mai sunt necesare. De
exemplu enzimele din calea de biosinteză a histidinei încetează a mai fi produse
a u c câ d co ce aţ a
atunci când concentraţia de histidină din celulă este suficientă pentru a satisface
s d ă d ce u ă es e su c e ă pe u sa s ace
necesităţile celulei. Acest proces este numit represie. Astfel într-o celulă există un
permanent echilibru între procesele de inducţie şi represie a anumitor enzime cheie,
în funcţie de necesităţile celulei.
În sistemul de cultivare în suspensie
(„batch”) celulele se multiplică într-un sistem închis
până când se termină unii din nutrienţi sau până
când unii produşi acumulaţi determină efecte
inhibitorii asupra unor enzime reglatoare sau,
numărul de celule formate au ocupat întreg spaţiul
de cultivare şi astfel noile celule nu mai au spaţiu să
ş p ţ
crească. În momentul în care în timpul creşterii
celulare unele din componentele celulare se
modifică sau unii compuşi moleculari se consumă,
celula îşi modifică forma – se alungeşte.
Figura 8. Reprezentarea schematică a schimbărilor ideale în
mărimea celulei (cell weight), numărul de celule, masa totală
ăi l l i ( ll i ht) ă ld l l t t lă
uscată şi compoziţia chimică în timpul creşterii unei bacterii în
sistemul de cultivare submers. În stânga este scală logaritmică
22. Controlul sintezei enzimatice
Eficienţa globală de creştere microbiană este discutată în
termeni termodinamici. Empiric, este în mod uzual exprimată în termeni de:
producţia de celule formate pornind de la o unitate masică de substrat de carbon
consumat.
producţia molară de creştere (Ys) este producţia de celule per mol de substrat,
coeficientul d conversie a carbonului care permite o mai uşoară comparare
fi i t l de i b l i it i ă
între numărul de moli de substratele diferite, este producţia de celule per gram
de substrat de carbon.
ATENŢIE! valoare scăzută a producţiei de creştere atunci când
organismele sunt transferate din sistemul de cultivare aerob în cel
anaerob, fenomen care evident este direct legat de reducerea fluxului
energetic şi astfel o producţie scăzută de ATP.
24. Randamentul de creştere a celulelor depinde de următorii factori:
factori:
1. natura sursei de carbon;
2. calea catabolică pe care o urmează substratul;
3. proviziile de substrate complexe (îndeosebi unele căi anabolice);
4.
4 necesarul d energie pentru asimilarea nutrienţilor î special al azotului (
l de i t i il t i ţil în i l l t l i (se
administrează mai puţin azot dacă se administrează aminoacizi şi mai mult
azot dacă sursa este reprezentată de ionii nitrat);
5. variaţia eficienţei reacţiilor generatoare de atp;
5
6. substanţele inhibitoare, contrabalansarea echilibrului ionic, sau alte
componente ale mediului care interacţionează cu sistemul de transport;
7. statusul fiziologic al organismului – aproape toate microorganismele îşi
modifică mecanismele de creştere în funcţie de condiţiile mediului de cultură
(ca de exemplu formarea sporilor).
8. natura substratelor care limitează creşterea – cea mai eficientă este sursa de
carbon care limitează creşterea , deoarece catabolizarea excesului de carbon
poate urma anumite căi metabolice care sunt din punct de vedere energetic
utile biotehnologului deoarece opresc creşterea;
9. viteză de creştere prestabilită;
10. înclinaţia microbilor de a creşte şi competenţa microbiologului.
25. BIOREACTOARE
Introducere
Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biologic”, şi se realizează în
bioreactor
“bioingineria” - se ocupă cu studiul bioproceselor din punctul de vedere al unui
biolog, al unui chimist fizician şi al unui inginer
Bioreactorul - instalaţie tehnologică în interiorul căreia are loc transformarea
materiilor prime cu ajutorul sistemului enzimatic pus la dispoziţie de microorganismele
vii, celulele animale şi vegetale, sau de enzimele izolate din acestea.
CONDIŢIILE CREATE ÎN BIOREACTOR PENTRU CREŞTEREA
ORGANISMELOR
Randamentul cu care procesul biotehnologic are lor
Pe măsură ce celulele cresc ele se adaptează noilor condiţii de creştere şi-şi modulează
activitatea în funcţie de condiţiile de mediu.
ţ ţ
Avantaj: monitorizarea permanentă a parametrilor creşterii
26. Materii prime Etapa de Etapa de Etapa de
prelucrare prelucrare prelucrare
fizică biochimică fizico-
fizico
chimică
Produs
• pregătirea mediului
p g • biosinteza • separarea produsului
de cultură, propriu-zisă principal,
• sterilizarea utilajelor, • monitorizarea • concentrarea,
• sterilizarea aerului parametrilor • pregătirea pentru
introducerea pe piaţă
Figura 9. Reprezentarea schematică a unui proces biotehnologic
Modelul similitudinii
Etapa pilot Etapa industrială
Criterii
C i ii care permit calcularea mărimilor fi i ale sistemului
i l l i il fizice l i l i
la scară mare, pe baza rezultatelor obţinute în etapa pilot
- tipul de organism;
p g ;
În funcţie de: - sistemul de cultivare;
Alegerea bioreactorului
- caracteristicile biochimice ale
întregului proces
27. Sisteme de cultivare a microorganismelor
2 sisteme majore: - sistem submers
- culturi de sup
cu u suprafaţăţ
În sistem submers
mediul de cultură este lichid, agitat şi aerat
alimentarea cu energie se realizează continuu în scopul menţinerii
interfaţei
i t f ţ i gaz – li hid
lichid
trei moduri de operare: discontinuu,
semicontinuu şi
continuu
Operarea în sistem discontinuu
Cultivarea - în şarje (sistemul batch);
începe la t = 0 şi se termină la t = t’;
p ş
la început, creşterea celulelor are loc în condiţii nelimitate; în timp se atinge
densitatea maximă; începe creşterea în condiţii limitate de substrat şi acumularea
produsului final.
se notează DC şi este reprezentată
grafic astfel:
caracteristică - sistem de agitare performant omogenitatea ; uniformitatea
tuturor parametrilor
28. Sisteme de cultivare a microorganismelor
Operarea în sistem semicontinuu
reactorul este construit astfel încât concentraţia sustratului limitativ să fie
păstrată constantă prin aprovizionarea continuă („fed batch”)
se notează SC şi se reprezintă grafic
astfel:
Operarea în sistem continuu
reactorul este construit astfel î â să se realizeze o aprovizionarea continuă
l i f l încât ă li i i i ă
cu nutrienţi şi o evacuare permanentă a unei cantităţi echivalente de mediu
de cultură
două tipuri de bioreactoare ideale:
Figura 10. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor tip R (cu recirculare) şi tip D (cu
deplasare)
29. Sisteme de cultivare a microorganismelor
Figura 11. Prezentarea sistemelor de operare continuă. S – substrat, C – celule
Bioreactoarele submerse pot fi:
- cu agitare mecanică,
mecanică
- cu convecţie forţată (cu pompă de recirculare a lichidului),
- cu aer comprimat.
30. Sisteme de cultivare a microorganismelor
Culturi de suprafaţă
- au fost primele sisteme de fermentaţie folosite;
- mediul de cultură este solid, semisolid sau este reprezentat de starturi
lichide aflate în repaus;
- în sisteme omogene – compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă în
orice colţ al bioreactorului, în orice moment;
- în sisteme heterogene – gradiente de celule sau substrat; microorganismele
sunt expuse la diferite cond. de mediu;
t l dif it d d di
- nu depind de sistemul exterior decât în mică măsură;
- sunt utilizate mai mult în laboratoar pentru întreţinerea culturilor, decât
industrial pentru biosinteză.
31. Sisteme de cultivare a microorganismelor
microorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorul
mediului de cultură. În mediul nutritiv la care s-a adăugat un agent
gelifiant şi s-a usucat la 45 – 500C, se inoculează microorganismul
la temperatura ambiantă Coloniile formate după incubare permit
ambiantă.
selecţia microorganismelor dorite. Condiţiile de cultivare pot fi
stabilite prin schimbarea compoziţiei mediului. Aerarea se
realizează prin aprovizionarea cu aer steril. D obicei se l
li ă i i i t il De bi i lucrează î ă în
incubatoare cu CO2.
tipuri de bioreactoare : cu tăvi,
tip coloană cu umplutură,
în strat fluidizat şi cu strat fix
32. Configuraţia bioreactoarelor
Aspecte care trebuiesc urmărite la alegerea bioreactorului
configuraţia biorectorului;
mărimea bioreactorului;
condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului;
sistem de operare utilizat (sistem submers/de suprafaţă;
continuu/discontinuu);
cuplare/necuplare î serie cu alte bi
l / l în i lt bioreactoare.
t
În funcţie de natura procesului biotehnologic
bioreactoare biologice - un proces de fermentaţie (cu biomasă);
- pot fi: pentru fermentaţii anaerobe,
aerobe;
bioreactoare biochimice - procesele enzimatice.
- Pot fi: cu enzime libere,
cu enzime imobilizate şi
cu fază solidă
33. Configuraţia bioreactoarelor
Au forme constructive şi moduri de operare variate, funcţie de tipul procesului tehnologic
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Clasificare:
după modul de introducere a energiei necesare
amestecării fazei lichide (substrat şi microorganisme) şi
dispersării fazei gazoase (aer):
- cu amestecare mecanică;
- cu pompă de recirculare;
- cu aer comprimat
34. Figura 12. Bioreactoare cu agitare mecanică.
(a) cu motorul aşezat la baza vasului; (b) cu
motorul la baza vasului şi cu draft interior; (c)
bioreactor cu agitator cu turaţie mare
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
35. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 13 Bioreactoare
13.
cu agitare mecanică cu
barbotare cu aer (prin
axul agitatorului sau
separat).
(a,b) cu
barbotare prin axul
agitatorului; (c) cu
barbotator separat cu
agitare pe sus; (d) cu tub
de aspiraţie a aerului.
36. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 14.
Bioreactor cu Figura 15. Bioreactor cu pompă de recirculare a fazei lichide.
agitare la mai (a) cu recirculare externă; (b) cu buclă de recirculare; (c) cu
multe nivele recirculare cu jet; (d) cu recirculare internă, inversată
37. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 16.
Bioreactoare cu aer
comprimat.
comprimat (a)
bioreactor tip
coloană cu bule; (b)
bioreactor tip turn cu
site perforate; (c)
i f ( )
bioreactor tip „air –
lift”; (d) bioreactor
tip “air lift” cu
p
coloană cu bule
38. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 17. Bioreactoare
biochimice.
biochimice
(a) în sistem discontinuu,
cu enzime libere;
(b) în sistem continuu, cu
enzime libere;
i lib
(c) în pat fluidizat (cu
enzime libere;
(d) cu eenzime imobilizate
e ob ate
pe suport
39. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 18.
Alte tipuri
constructive de
bioreactoare.
bioreactoare
(a) cu film
lichid; (b)
pentru culturi
de suprafaţă
40. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare
Bioreactoare cu agitare mecanică
Figura 19. Bioreactor cu
agitare tip pentru culturi
g pp
aerobe
41. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 20. Tipurile de
20
rotoare utilizate la
realizarea agitatoarelor
pentru amestecarea
mediului de cultură din
bioreactor. (a) ancoră,
(b) elice, (c) turbină cu
palete plane, (d) cu
plane
palete tip zbatură, (e)
ancoră complexă, (f)
şurub elicoidal
42. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Ca acte isticile bio eacto ului:
Caracteristicile bioreactorului:
Amestecarea şi dispersia bulelor de aer – agitare mecanică;
Omogenizarea mediului – şicane;
g
Degajarea bulelor de aer – spărgător de spumă;
Transferul de căldură – prin agitare şi turbulenţă,
o în timpul sterilizării (când se realizează în bioreactor)
bioreactor),
o în timpul fermentaţiei (sterilizarea se realizează în alt vas);
Preluarea căldurii de reacţie degajată în timpul fermentaţiei
- sistem de răcire, cel mai des cu serpentine; dezavantaj – greu
de spălat şi sterilizat, incomodează sistemul de agitare;
- sistem de răcire cu schimbător de căldură exterior
Utilizare
- celule lib sau i bili t şi
l l libere imobilizate i
- reacţii enzimatice cu enzime libere sau imobilizate
43. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare
Bioreactoare cu agitare mecanică
şi cu draft interior
creşte coeficientul de transfer de masă
circulaţia lichidului este modificată prin
introducerea unui cilindru metalic axial
fără fund şi capac numit „draft
draft”
Figura 23. Circulaţia lichidului într-un
g ţ
bioreactor cu draft. (a) complet imersat în
lichidul de cultură, (b) cu revărsare
(adaptat după Keitel, 1978)
44. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare
Bioreactoare cu aer comprimat
Bioreactoare tip „coloană cu bule”.
variantă a bioreactoarelor cu agitare mecanică
i ă bi l i i ă
agitarea mediului de cultură se realizează
exclusiv prin barbotare de aer
Caracteristicile hidrodinamice şi transferul
de masă depind în totalitate de
comportamentul bulelor eliberate de
lb l l lib d
barbotor
utilizată în industria drojdii de bere, în
industria berii, a vinului şi în tratarea
apelor reziduale
Figura 24. Bioreactor tip coloană cu bule
45. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Sistem omogen - b l l urcă cu aceeaşi
Si t bulele ă i
viteză şi nu se amestecă între ele, iar
agitarea lichidului este limitată,
Sistem eterogen - viteza de barbotare
este mai mare; circulaţie haotică a
celulelor; bulele şi lichidul tind să se
ridice prin centrul coloanei, curentul de
lichid coboară pe lângă pereţii
bioreactorului, antrenează bulele,
amestecarea aerului cu mediul de
cultură.
avantaj - cost de construcţie mic,
transfer de masă şi căldură satisfăcător
probleme - de
d spumare a mediului
di l i
Figura 25. Circulaţia fluidului într-o coloană
cu bule aflată în regim eterogen
46. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Pentru îmbunătăţirea caracteristicilor de curgere şi amestecare se
construiesc bioreactoare tip coloană cu bule în mai multe
trepte. Astfel întâlnim:
- coloane cu bule divizate în câteva secţiuni prin site perforate şi
- coloane cu b l care sunt prevăzute cu agitatoare l l
l bule t ă t it t locale.
Introducerea sitei perforate sau a agitării locale reduce intensitatea
amestecării axiale a lichidului şi creşte coeficientul de transfer de
masă.
Datorită varietăţii mari de configuraţii de bioreactoare tip
coloană cu bule (diametrul găurilor, secţiunea transversală liberă,
numărul de site perforate, varietatea compoziţiei mediului) nu s-au
elaborat relaţii generale de calcul şi control a parametrilor.
47. Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare
Bioreactoare “air lift”
formă de turnuri cu buclă;
o „air lift” cu circulaţie internă
o „air lift” cu circulaţie externă
circulaţia lichidului se datorează
diferenţei de densitate a fazei aerate din
turn şi a zonelor nearerate;
utilizate culturi de celule vegetale,
culturi de celule animale,
culturi de celule imobilizate
biosinteza proteinelor microbiene
tratamentul biologic al nămolurilor
t t t l bi l i l ă l il
49. Bioreactoare membrană
Bioreactoare cu membrană de dializă
Motivaţii:
otivaţii: membranele de dializă sunt un mijloc eficient de îndepărtare
e ba ee d a ă su u j oc e c e depă a e
continuă a inhibitorilor sau a produşilor toxici rezultaţi în timpul
fermentaţiei
alimentarea cu substrat a culturii microbiane se realizează prin
membrană
se pot obţine concentraţii mari de microorganisme, deoarece
substratul este separat de microorganism şi nu poate exercita efecte
inhibitorii
i hibi ii
Utilizare: cultivarea sistemelor de două sau mai multe tipuri de microorganisme
cultivarea celulelor umane
Modele:
Primul tip două vase între care schimbul de substrat sau produs se realizează
prin pomparea conţinutului printr-un modul de dializă situat între
cele două vase.
l d ă
dezavantaje – sterilizarea sistemului (sistem multi-component);
- suspensia fermentată este pompată prin by-pas
by pas
51. Bioreactoare membrană
Bioreactoare cu membrană de dializă
Al doilea tip
două tuburi flexibile care sunt fixate în interiorul bioreactorului de oţel, de fund şi
de capac Tubul mare care formează peretele fermentatorului este confecţionat din
capac. mare, fermentatorului,
folie de poliamidă cu o grosime a porilor de 80µm, în timp ce tubul mic formează
un cilindru în interiorul bioreactorului. Tubul mic este o membrană de dializă a
căror pori au dimensiunea de 20µm. Bioreactorul este echipat cu două unităţi de
agitare cu motoare separate ceea ce face ca turaţia motorului să poată fi controlată
separat. Aeraţia se p
p ţ poate realiza în ambele incinte în acelaşi timp. Fermentatorul
ş p
poate fi sterilizat in situ ca un fermentator obişnuit, la 1210C, în timpul sterilizării
pereţii din folie de poiamidă putând fi protejaţi de o manta din cilindri de oţel.
53. Bioreactoare
Bioreactoare cu tăvi
Aplicaţiile sunt limitate la microorganismele care se dezvoltă la suprafaţă şi
formează peliculă
În industrie s-au construit bioreactoare cu mai multe tăvi, aşezate una deasupra
celeilalte, astfel încât sterilizarea şi inocularea să poată fi efectuate automat. În
interior se introduce aer steril. Bioreactorul este exploatat în regim discontinuu.
O variantă a acestui tip de bioreactor a fost descrisă de Kybal şi Vlcek (1976)
care au propus utilizarea unor perne gonflabile de plastic, care pot fi umplute
cu mediu nutritiv, inoculate şi aerate prin tubul de fixare.
55. Bioreactoare
Bioreactoare tip coloană cu umplutură
O coloană verticală, umplută cu granule de biocatalizator sau cu biocatalizator
imobilizat.
Alimentarea cu mediu se face prin partea de sus - se formează o fază de lichid
continuă printre particule. Datorită frecării particulelor, deteriorarea celulelor, este
minimă comparativ cu bi
i i ă i bioreactoarele cu agitare.
l i
Transferul de masă dintre faza lichidă şi catalizatorul solid se realizează relativ uşor
dacă viteza de trecere a acestuia prin coloană este mare, iar pentru a fi îmbunătăţit
mediul lichid este recirculat
recirculat.
Aerarea mediului este bine să fie realizată separat. Dacă aerul este barbotat direct se
produce coalescenţa bulelor, apar canale prin umplutură şi distribuţia nu este
uniformă.
uniformă Din acelaşi motiv bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentru
motiv,
bioprocesele din care rezultă CO2 sau alte gaze. De obicei, aerul circulă în
contracurent cu lichidul pentru a intensifica înlăturarea căldurii degajate în timpul
fermentaţiei sau a reacţiei enzimatice.
ţ ţ
Când se lucrează cu microorganisme acestea formează un „film biologic” în jurul
particulelor de umplutură.
Bioreactoarele cu umplutură se utilizează şi în cazul enzimelor sau celulelor
imobilizate.
57. Bioreactoare
Bioreactoare în strat fluidizat
Când bioreactorul cu umplutură este operat cu stratul în suspensie, atunci el
se numeşte „strat fluidizat”.
pentru prima oară, a fost descris de Moebus în 1981, şi a fost folosit la
fermentaţia glucozei la etanol folosind un strat fluidizat format din granule de
drojdie.
Gazul de fluidizare păstrează în acelaşi timp granulele în mişcare şi le usucă.
Aerul este introdus pe la partea inferioară a bioreactorului şi menţine în
suspensie cultura d celule sau enzime i bili t U
i lt de l l i imobilizate. Uneori se f l
i foloseşte nisip
t ii
sau un alt material care se amestecă cu celulele microbiene.
Procedeul este uneori folosit cu microorganisme floculate în fabricarea berii
floculate,
şi a oţetului.
59. Bioreactoare
Bioreactoare cu strat fix
Reprezintă o variantă a bioreactoarelor cu umplutură, deosebirea constând în
introducerea şi distribuirea mediului lichid prin partea superioară a bioreactorului
lichidul circulă în jos cu viteză mică, scurgându-se pe particulele de umplutură.
Acest tip de bioreactor este mult mai utilizat în tratamentelor apelor reziduale,
când configuraţia bioreactorului se modifică prin introducerea unor „biofiltre”
(figura ).
Aerul ăt d
A l pătrunde prin ferestrele de la partea inferioară a bi
i f t l d l t i f i ă bioreactorului, se
t l i
ridică prin convecţie naturală şi alimentează cultura de microorganisme cu
oxigen.
Dezavantaje: utilizarea volumului reactorului în scopul creării unei
interfeţe cât mai mari; repartizarea uniformă a lichidului peste umplutură pentru
ca întreaga suprafaţă de lichid să lucreze uniform.
60. Bioreactoare
Bioreactoare cu strat fix
Figura 33. Bioreactor cu flux fix
62. Bioreactoare
Bioreactoare cu enzime imobilizate
avantaje la transformarea subs ţe o în cataliză e e oge :
v je so e substanţelor c eterogenă
• permite utilizarea repetată a enzimei;
• permite lucrul în instalaţii semicontinue şi continue (volumul mic
p ţ ş (
ocupat de instalaţie permite automatizarea proceselor);
• se elimină faza de inactivare termică deoarece enzima nu se regăseşte
amestecată cu produsul;
• se pot trata soluţii diluate de substrat (ape reziduale, subproduse);
• scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse;
•nu se formează produşi secundari.
63. Bioreactoare
Bioreactoare cu enzime imobilizate
Avantaje faţă de procesul de transformare a substratului cu ajutorul
microorganismelor:
c oo g s e o :
• se elimină faza de inactivare termică
• se pot trata soluţii diluate de substrat
•Scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse
• nu se formează produţi secundari
•în procesul de transformare se utilizează întreaga cantitate de substrat (în cazul
proceselor fermentative 1% din cantitatea de substrat este utilizată la
dezvoltarea microorganismelor);
d l i i l )
•datorită existenţei unei singure enzime există posibilitatea efectuării unei
singure reacţii enzimatice specifice (în cazul proceselor fermentative
microorganismele produc un complex de enzime care pot duce la transformări
secundare);
•costurile sunt reduse deoarece este eliminată faza de cultivare a
microorganismelor.
microorganismelor
tehnici de imobilizare a enzimelor:
Procedee fizice: Procedee chimice:
- adsobţia pe suporturi solide; - reticularea i
i l intramoleculară;
l l
- includerea în structuri macromoleculare; - legarea covalentă pe suporturi
- microîncapsularea; insolubile reactive
64. Bioreactoare
Bioreactoare cu enzime imobilizate
Cantitatea de enzimă care se cuplează la suport variază de la 1mg – 1g
proteină/g preparat imobilizat
Reactivitatea preparatelor imobilizate este i fl
R i i l i bili influenţată d următorii factori:
ă de ă ii f i
• granulometria –;
• masa moleculară a substratului –
• pH mediului de reacţie –
• stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizate -
Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:
• Discontinue cu agitare;
• Continue cu agitare;
• C ti
Continue d ti coloană;
de tip l ă
• Continue în pat fluidizat
Alegerea tipului de bioreactor depinde de caracteristicile fizice ale
g p p
preparatului imobilizat, de capacitatea de producţie a instalaţiei şi de natura
substratului ce trebuie transformat.
65. ETAPE PRELIMINARE ÎNTR-UN
ÎNTR-
PROCES BIOTEHNOLOGIC
totalitatea paşilor necesari în vederea recuperării produsului final în orice
tip de industrie
Ex.: procesul de fermentatie clasic
La sfârşitul fermentaţiei
- separarea fazei solide (de obicei celule, dar şi celule împreună cu enzime pe un
anumit tip de suport, sau componente ale mediului de cultură) d cea li hid care
i i d l di l i d l ) de lichidă
în 90% din cazuri este apoasă.
Tabelul 4. Proprietăţile celulelor cu referire la procesul de separare
Proprietăţi Bacterii Drojdii Fungi
formă baghete, sfere, sfere, elipsoidice, filamente
catene filamente
mărime 0.5µm – 3 µm 1 – 50 µm 5 –15 µm diametru
50 – 500 µm
lungime
greutate 1,05 –1,1 1,05 – 1,1 1,05 – 1.1
specifică
greutatea 10-12 g 10-11 g -
celulei
67. Filtrarea
- separarea filamentelor de fungi şi bacteriilor filamentoase de bulionul de fermentatie
- separarea floculelor de fungiîn toate cazurile se foloseşte vacuum sau suprapresiune.
Tipuri de filtrare:
filtrare de suprafaţă,
filtrare de adâncime, vacuum / suprapresiune
p p
filtrare prin centrifugare;
Parametri filtrarii:
1. Rata de filtrare –
2. Rezistenţa filtrelor –
Tipuri de filtre:
simple, plate,
ansamblu de filtre
Exemple:
1. Separarea microorganismelor din bulionul de fermentatie
- b t i de filtre rotative
baterie d filt t ti
2. filtrarea mediilor de biosinteza
- cu ajutorul adjuvantilor de filtrare:
- în strat subţire pe materialul filtrant;
- amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtrat;
- raclarea stratului de adjuvant - in cazul filtrelor rotative
68. variantă - filtrarea sterilizantă.
prefiltrare grosieră,
filtrarea sterilizantă propriu-zisă.
se montează în filtru plăci din acetat de celuloză,
azbest sau polimeri sintetici cu di
b li i i i i diametru redus al porilor,
d l il
Avantaj: temp. scăzută, consum mic de energie, integrarea
filtrării cu spălarea, îndepărtarea parţială a apei
Dezavantaj: contaminarea cu aer
Cel mai adesea pentru separarea microorganismelor de bulionul de
fermentaţie se utilizează o baterie de filtre rotative menţinute sub
presiunea exercitată din interiorul reactorului – presiune constantă
Filtrele sub formă de centură - potrivite pentru precipitatele deja filtrate
şi care necesită o spălare mai îndelungată. Dacă acest tip de filtrare se
realizează într-o presă îndepărtarea apei se va realiza mai rapid
într o rapid.
69. Filtrarea
Figura 34. Reprezentarea schematică a filtru rotativ menţinut sub vacuum
70. Filtrarea pe membrane
metodă versatilă - utilizată pentru separarea şi concentrarea diferitelor molecule sau
particule.
particule
În ultrafiltrare membranele pot fi considerate ca o „sită” (membrane microporoase) a
căror mărime a porilor guvernează separarea.
Tabelul 7. Aplicaţiile filtrării pe membrane
Tipul de Aplicaţia Masa moleculară
filtrare relativă a particulelor ce
pot fi separate
microfiltrare concentrarea bacteriilor şi >1 000 000
virusurilor (sau particule)
ultrafiltrarea fracţionare; >10 000
dializă; (macromolecule)
producerea de enzime;
producerea de proteine;
producerea zerului
osmoza inversă concentrarea produselor >200
farmaceutice; (compuşi organici)
producerea lactozei;
desalinizarea parţială a soluţiilor;
electrodializa purificarea şi fracţionarea >100
substanţelor ionice; (compuşi organici)
desalinizarea
microfiltrarea – sistem închis
- avantaj: se lucrează în condiţii sterile
- se separă celule şi metaboliţi specifici
ultrafiltrarea - apare fenomenul de “polarizare a concentrării”
71. Filtrarea pe membrane
Figura 39. Secţiune transversală printr-un modul de ultrafiltrare „plate and
frame” (The Danish Sugar Co). 1 – grătar central; 2 – fereastră; 3 – membrană; 4 –
hârtie de filtru; 5 – suport plat pentru membrană
72. Filtrarea pe membrane
Figura 40. Reprezentarea schematică
a unui modul de ultrafiltrare „hollow-
fibre” (romicon). 1 – hollow fibre; 2 –
( )
lagăr; 3 - suport pentru fibre.
73. Centrifugarea
Performanţa unei centrifugări poate fi caracterizată de expresia:
Q = d2∆ρgZF/18η
şi
Z = Rω2/ ≅ R 2/900
2/g Rn2/900
unde: Q – rata de încărcare volumetrică;
d – diametrul particulei;
∆ρ - dif
diferenţa de densitate;
ţ d d it t
g – acceleraţia gravitaţională;
F – volumul păstrat în centrifugă;
η - vâscozitatea;
R – radius;
ω - viteza unghiulară;
N – numărul de revoluţii/minut
ţ
Funcţia Σ = FZ, este utilizată în compararea diferitelor centrifugări. Deoarece F creşte
cu lungimea axială a rotorului şi Z cu diametrul şi viteza rotorului,
performanţele utilizării unor rotoare mai lungi (F), mai rapide sau mai largi
(Z) sunt superioare. Valorile lui Z sunt limitate de natura materialului din care
este construit rotorul.
74. Centrifugarea
Figura 35. Exemple de centrifugi solide: (1) scobitură tubulară, (2)
scobitură solidă multicamerală, (3) centrifugă cu scobitură în formă de disc
75. Tipul de centrifugă Avantaje Dezavantaje Detalii tehnice
Centrifugarea
coş perforat bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n – 500 – 2500 min-1
Tabelul 6.6 uşor de curăţat;
ş ţ ;
posibila spălare a filtrelor
solide;;
recuperare laborioasă a
Z – 300 - 1500
Σ - 900 – 1800
Proprietăţile solidelor;
forţă centrifugă mică;
diferitelor tipuri de funcţionare discontinuă
centrifugi centrifugă cu utilizată la separarea forţă centrifugă mică n – 500 – 1000 min-1
solidelor; Z - 300 – 1500
sită rotativă posibilă spălare a filtrelor;
funcţionare continuă
coş tubular bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n - 13000 – 18000 min-1
forţă centrifugă mare;
ţ g solide; d – 75 – 150 mm
uşor de curăţat; recuperare laborioasă a Z – 13000 - 17000
uşor de îndepărtat coşul solidelor; Σ - 1500 - 4000
funcţionare discontinuă
coş capacitate mare pentru recuperare laborioasă a n – 5000 – 10000 min-1
solide; solidelor; d – 125 – 530 mm
multicameral nu pierde eficienţă până l
i d fi i ţă â ă la funcţionare di
f ţi discontinuă
ti ă Z - 6000 - 11400
solid completa încărcare a
camerelor
centrifugă cu trecere rapidă simultan cu forţă centrifugă mică n – 700 – 2500 min-1
o concentrare mare; Z – 350 – 1400
descărcare funcţionare continuă
ţ Σ - 900 - 2300
rotativă
centrifugă cu funcţionare discontinuă; îndepărtare slabă a apei; n – 3000 – 10000 min-1
forţă centrifugă mare; funcţionează numai cu Z – 4000 - 7500
scobitură în eliminarea lichidului sub solide mici în suspensie Σ > 270000
formă de disc presiune;
curăţare ieftină
centrifugă cu funcţionare continuă; îndepărtare slabă a apei; n - > 10000 min-1
forţă centrifugă mare Z > 14000
tub de elimin.
elimin. Σ > 80000
a sol. apoase
sol.
76. Aducerea în suspensie
În cazul celulelor bacteriene cu dimensiuni mici
Metode: - formarea de floculi
- metoda de plutire
Dezintegrarea celulelor
Microorganisme:
Figura 36. Metode de rupere a microorganismelor
Celule animale şi vegetale – metode mecanice
- îngheţare rapidă şi tăiere – cel. anim.
- liză enzimatică – cu celulaze şi hemicelulaze- cel. Veg.
77. Metode de extracţie
termenul de extracţie se referă atât la separare cât şi la concentrare
Distribuţia substanţei între cele două faze este guvernată de un coeficient de
partiţie caracteristic, K:
Concentratia substantei in faza A
K=
Concentratia substantei in faza B
Figura 37. Procesul tehnologic de recuperare a antibioticelor
78. Metode de concentrare
- trebuie să nu afecteze structura şi activitatea produsului
- printr-o etapă de separare sau extracţie
-ca o ultimă etapă înainte de purificarea economică;
p p ;
-- tipuri:extracţia, evaporarea,
- procesarea pe membrane,
- cromatografia de schimb ionic,
- cromatografia de adsorbţie
79. Evaporarea
Se aplică la soluţiile obţinute în urma extracţiei cu solvenţi, caz în care evaporarea
ap că a so uţ e obţ u e u a e acţ e so ve ţ , ca ca e evapo a ea
solventului este obligatorie.
Evaporarea directă a mediului de cultură - în cazul produşilor secundari, de obicei
prin folosirea unui spray de uscare;
Evaporarea în timp scurt (min.) – este continuă; permite concentrarea produselor
instabile cu ajutorul unor filme de evaporare;
Evaporarea cu filme subţiri sub formă de peliculă – concentrarea amestecurilor
vâscoase, sau în ffaza fi l d uscare a produsului.
finală de d l i
Filtrarea pe membrane
80. Răşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţie
Răşini schimbătoare de ioni: - concentrarea puternică într-o singură etapă.
Tabelul 8. Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichizi
8
Schimbător de Matrix Grupări funcţionale
ioni
Răşini Stiren-divinil.benzen; Carboxil;
schimbătoare de Acrilat; Acid sulfonic;
ioni solide Metacrilat; Amine primare, secundare şi
Poliamina; terţiare;
Celuloză; Amine cuaternare
Dextran
Schimbători de ioni Solventul este folosit pentru Amine primare, secundare şi
primare
lichizi transportul grupelor terţiare;
funcţionale Monoesterul acidului fosforic;
Diesterul acidului fosforic
Răşini de adsorbţie: - sunt utilizate în locul procedeelor de extracţie
Tabelul 9. Proprietăţile răşinilor de adsorbţie
Suprafaţă 20 – 800 m2g-1
Volumul porilor 0,5 – 1,2 ml g-1
Proprietăţi fizice Mărimea medie a porilor 5 – 130 nm
Nepolar: stiren-divinil benzen;
i i i i
Semipolar: ester acrilic;
Proprietăţi chimice
Polar: sulfoxid, amide, grupările N-O
81. Purificarea şi stabilizarea amestecului
În fiecare din etape se realizează o purificare a produsului finit. În final se
ajunge cu un produs al cărui grad de puritate nu este întotdeauna satisfăcător
motiv pentru care este necesară introducerea unei etape finale de purificare şi
stabilizare. În prezent se utilizează două metode de purificare: cristalizarea şi
cromatografia.
fi
Cristalizarea
Este folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică cum sunt de
mică,
exemplu antibioticele.
La o scară mai mare cristalizarea este etapa finală de p
p purificare a unor p
produşi
ş
ca actinomiceina A, penicilina G, acidul citric, glutamatului de sodiu etc.
Cromatografia
purificarea compuşilor cu masă moleculară mică care într-adevăr necesită
parcurgerea unei astfel de etape (de exemplu antibioticele), a macromoleculelor, a
enzimelor atunci când sunt însoţite de compuşi de aceiaşi natură.
83. Purificarea şi stabilizarea
amestecului
Echipamentul constă
într-o b i d coloane
baterie de l
cu diferite matrixuri,
rezervoare, sisteme de
pompare a eluentului şi
o serie de colectoare de
fracţii.
Figura 42. C=PHARMACIA 1501
segment de coloană din oţel: P –
filtru,
filt S1, S2 - filt sterile, Fl – fl
filtre t il flow-
metru, UV – spectrofotometru UV
84. Purificarea şi
stabilizarea amestecului
Figura 43. Procesul
tehnologic de purificare a
proteinelor plasmatice umane
(Curling, 1980)
85. Purificarea şi stabilizarea amestecului
Prin cromatografie de afinitate se purifică în special enzimele dintr-un
amestec de proteine Folosindu-se o soluţie tampon cu pH diferit de cel al
proteine. Folosindu se
enzimei, enzima poate fi eluată selectiv de pe coloană. Astfel de efectori
specific sau molecule complementare care pot fi separate prin acest procedeu
sunt: enzime/inhibitori enzimatice (sau vice-versa);
anticorpi/antigene sau haptene (şi vice-versa);
lectine/glicoproteine sau polizaharide;
acizi nucleici/secvenţe de baze complementare;
ţ p ;
hormoni/receptori;
vitamine/proteine transportoare etc.
exemplu:
principiul de separare a dehidrogenazele se bazează pe interacţiile specifice
cu coenzima sa (NAD+). Ca matrix se foloseşte sepharoză la care este legat NAD+.
Interferonul din leucocitele umane este recuperat prin cromatografie de
afinitate, de pe o coloană d d
fi i d l ă de dextran l care a fost legat anticorpul monoclonal
la f l i l l l
împotriva interferonului.
Dezavantaj: cost mare al efectorilor imobilizaţi
Cromatografia de afinitate de grup specific: î separarea glicoproteinelor şi
C t fi d fi it t d ifi în li t i l i
nucleotidelor
Cromatografia covalentă: separarea proteineor care contin grupări -SH
86. Uscarea
Este modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fi
manipulat, ambalat, transportat. Deoarece majoritatea produşilor biologici sunt
sensibili se descompun uşor sau îşi pierd activitatea atunci când se găsesc la
temperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creştere
minimă a temperaturii. În cazul enzimelor şi a produselor farmaceutice
termostabilitatea este asigurată prin adăugarea de zaharuri sau alţi stabilizatori inerţi.
Pentru a elimina apa sub formă de vapori, energia rezultată în urma încălzirii
trebuie transferată prin convecţie, radiaţie, sau ambele procedee combinate şi
controlată strict pentru a nu permite depăşirea pragului de temperatură. Cele mai
p p p ş p g p
utilizate tehnici sunt:
• uscare la vacuum
• uscare cu jet de gaz
• uscare prin îngheţare rapidă
87. BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ
DE OBŢINERE A PROTEINELOR
Introducere
„single cell protein” (SCP) - o singură proteină celulară - termen utilizat şi
protein
acceptat pentru materialul celular microbian folosit ca hrană şi furaj. Termenul
nu este în totalitate corect - proteina obţinută ca produs al unui proces
biotehnologic nu este 100% pur. Termenul a fost atribuit ţinând cont de faptul
că o proteină se poate obţine dintr-o varietate de microorganisme mono – şi
multicelulare, bacterii, drojdii, fungi filamentoase sau alge
Tabelul 10 Exemple de microorganisme care pot fi
10.
utilizate ca sursă de obţinere a SCP
Caracteristica Paecilomyces Fusarium Candida
varioti graminearum utilis
Material uscat (%) 96 94,2 91
Proteină crudă (% N x 6,25) 55 54,1 48
Grăsimi (%) 1,0 1,0 1,35
Cenuşă (%) 5 6,1 11,2
Lizină
Li ină (g/16g N) 6,5
65 3,5
35 7,2
72
Metionină (g/16g N) 1,9 1,23 1,0
Cistină şi cisteină (g/16g N) 1,0 0,75 1,0
88. Introducere
producerea microorganismelor la scară industrială în vederea obţinerii unor
produse alimentare - în Germania, în timpul Primului Război Mondial -
producerea de drojdie „Torula”.
SUA şi Marea Britanie -
Prima C f i ţă - 1967 l I tit t l d T h l i di M
Pi Conferinţă la Institutul de Tehnologie din Massachusetts;
h tt
majoritatea proiectelor prezentate au fost la nivel de cercetare. O singură
prezentare, cea a cercetătorilor de la „British Petroleum” (BP) a scos în evidenţă,
aplicaţiile fermentaţiei SCP la scară industrială
industrială.
De ce să producem SCP?
creşterea cerinţelor pieţei pentru hrană mai sănătoasă
furaje în compoziţia cărora intră proteine înalt purificate printr o tehnologie
printr-o
avansată
avantajele producerii la scară largă a biomasei microbiene:
rată mai mare de multiplicare
multiplicare,
conţinut proteic ridicat (30 – 80% proteine în masă uscată),
utilizarea unui număr mai mare de surse de carbon,
sitele de cernere se pot construi din materiale mai bune şi relativ uşor,
p ş ş ,
instalaţiile de producţie ocupă suprafeţe mici şi duc la creşterea randamentului
de producţie,
producţia microbiană este independentă de anotimp, variaţii climaterice.
89. Procesul de obţinere a SCP
Etapele procesului de obţinere a SCP se stabilesc în funcţie de substratul şi
organismul utilizat
Figura 44. Reprezentarea schematică a unui proces general de producere a SCP
90. Procesul de obţinere a SCP
Etape de b :
pe bază:
combinarea fizică şi tratamentul chimic al materiilor prime de bază;
prepararea mediului corespunzător care conţine surse de carbon, azot, fosfor, şi
alţi nutrienţi esenţiali;
prevenirea şi contaminarea mediului sau a plantelor;
cultivarea microorganismului necesar;
separarea biomasei microbiene de mediul consumat;
recuperarea biomasei –
spargerea celulelor –
tratamentul final al biomasei cu sau fără etape de purificare finală,
îndepărtarea excesului de substrat sau a componentelor acestuia –,
reducerea concentraţiei ARN –
tratarea reziduurilor –
se recuperează între 18 şi 45 x 106 litri funcţie de substrat şi microorganism la o
p
producţie de 100.000 t SCP/an
ţ
91. Selectarea microorganismelor
C ce s c
Caracteristici de bază ale microorganismul utilizat pentru obţinerea unei
b a e c oo ga s u u a pe u obţ e ea u e
anumite proteine:
să nu fie patogenic pentru instalaţie, animal sau om;
să aibă o valoare nutriţională bună;
să fie acceptat pentru hrană şi furaje;
să nu conţină compuşi toxici;
producerea la scară largă să necesite costuri minime.
De reţinut: costul de producţie depinde de:
viteza şi randamentul de creştere,
conţinutul în proteina ţintă
ţintă,
necesarul de nutrienţi suplimentari,
utilizarea unui mediu avantajos,
p p
proprietăţile de uscare şi separare
ţ ş p
92. Selectarea microorganismelor
Tabelul 11. Compoziţia în aminoacizi a drojdiilor şi a unor alimente selectate
Conţinutul de aminoacizi (g/16g N) în:
Proteine tradiţionale
Proteine
SCP din componente
Aminoacid alimentare
furajere
Toprina
T i Pekilo
P kil Sacharomic
S h i Făină
Făi ă Extract din
E t t di Ou
O Referinţe
R f i ţ
es cerevisiae de fasole de soia FAO
peşte
izoleucină 5,1 4,8 4,6 4,6 5,4 6,7 4,2
leucină 7,4
, 7,4
, 7,0
, 7,3
, 7,7
, 8,9
, 4,8
,
fenilalanină 4,3 4,0 4,1 4,0 5,1 5,8 2,8
tirozină 3,6 3,5 - 2,9 2,7 4,2 2,8
treonină 4,9 4,1 4,8 4,2 4,0 5,1 2,8
triptofan 1,4 1,1 1,0 1,2 1,5 1,6 1,4
valină 5,9 5,1 5,3 5,2 5,0 7,3 4,2
arginină 5,1 5,3 - 5,0 7,7 - -
histidină 2,1 1,9 - 2,3 2,4 - -
lizină 7,4 6,5 7,7 7,0 6,5 6,5 4,2
cisteină 1,1 1,0 - 1,0 1,4 2,4 2,0
metionină 1,8 1,9 1,7 2,6 1,4 5,1 2,8
aminoacizi cu 2,9 2,9 - 3,6 2,8 7,5 4,8
sulf
93. Selectarea microorganismelor
Algele –genurile Chlorella, Scenedesmua sau Spirulina
genurile Scenedesmua, Spirulina.
cresc prin procedee fotosintetice şi autotrofice sau heterotrofic
cultivare la scară largă - în eleştee deschise, la lumina soarelui.
Probleme:
Risc crescut de contaminare,
densitate celulară mică,
alge unicelulare → costuri ridicate pentru procedeele de recoltare
compoziţia în proteine
conţinutul total de proteine native (ntotal x 6,25) ≥60% → profilul în
aminoacizi al SCP este în general bunbun.
algele cu un conţinut bogat de pigmenţi fotosensibili → la producerea de SCP
pentru furaje, dar nu şi pentru alimente.
microalgele- utilizate pentru obţinerea d proteine aditive, d nu î concentraţie
i l l tili t t bţi de t i diti dar în t ţi
mare şi în anumite condiţii de calitate.
incorporarea algelor Chlorella şi Scenedesmus în dieta umană → numeroase
probleme; S i li este f
bl Spirulina foarte d utilizată
des ili ă
94. Selectarea microorganismelor
Bacteriile –
rată mare de creştere,
numărul de bacterii utilizate în producerea de SCP este în continuă creştere
standard ridicat de sterilitate în întreg procesul tehnologic
recuperarea bacteriilor prin centrifugare este o problemă - noi metode care să
p p g p
permită omorârea acestora şi nu deversarea în mediu
conţinut proteic de aproximativ 80%,
conţinut ridicat de ARN care trebuie îndepărtat
ţ p
profilul în aminoacizi al SCP este în general bun; câteodată prezintă un
conţinut mic de aminoacizi cu sulf
95. Selectarea microorganismelor
Drojdiile –genurile Saccharomyces, Torulopis şi Candida
viteza mare de creştere a culturilor
risc redus de contaminare cu agenţi patogeni
recuperare – din reziduuri, uşor, prin centrifugare continuă.
conţinutul în proteine este de aproximativ 55 60%
55-60%,
conţinutul în acizi nucleici este >15% din greutatea de bază (este necesară o
etapă de reducere a concentraţiei acestora)
profilul aminoacizilor di structura SC - î general b
fil l i i il din t t SCp în l bun
96. Selectarea microorganismelor
Fungii filamentoşi –
sistem de cultivare - culturi în suspensie sub formă de filamente sau de pelete,
viteză de creştere mai mică decât a bacteriilor şi drojdiilor; microfungii pot
atinge o viteză de creştere apropiată de cea a drojdiilor
g ş p p j
risc redus de contaminare cu agenţi patogeni (cresc la un domeniu de ph mai
larg, între 3 şi 8 ceea ce permite cultivarea lor la ph 5)
risc de contaminare cu drojdii
j
recuperarea fungilor - filtrare.
conţinutul în proteine variabil; 50 – 55% din total substanţă uscată.
conţinut în ARN - până la aproximativ 15% din masa uscată,
conţinut în chitină - până la aproximativ 15% din masa uscată
profilul aminoacizilor din structura SCP – bună (săracă în aminoacizi cu sulf)
Alegerea substratului
Sursele de compuşi cu conc. mici de carbon
două
d ă grupuri:i - “f il ”
“fosile”
- “reînnoite”
97. Alegerea substratului
Hidrocarburi lichide –n-alcanii ( (saturaţi, cu catenă liniară) C9 - C18
)
0 -30 % în uleiurile naturale şi în kerosen
benzina - numai 10% fermentează, restul trebuie recuperat, separat de SCP, şi
returnat la rafinărie pentru o procesare ulterioară
- posibilă contaminare cu policicluri aromatice
transferul n-alcanilor C10 – C18 în celulă –
macro – emulsia care este transformată într-o micro – emulsie →
obţinerea agenţilor de emulsionare - surfactanţi
sursă de energie şi carbon -
Compania „Britisch Petroleum” (BP) - două procese de producţie:
benzina
n-alcanii puri.
„Toprina” - produs omologat de BP şi comercializat
Instalaţie de cultivare a Candida utilizând ca substrat benzina
98. Alegerea substratului
Hidrocarburile gazoase –cel mai des utilizat este metanul
avantaje:
•disponibil la puritate mare;
• uşor îndepărtat în urma procesului de fermentaţie
• nu lasă reziduuri;
• cultivare continuă → randament bun, productivitate ridicată
probleme de producţie
transferarea a două gaze – metan şi oxigen
formarea în mediu a unor produşi de inhibiţie
explozie dacă concentraţia de oxigen depăşeşte 12% (v/v)
foarte costisitor
microorganisme capabile să utilizeze metanul ca substrat - bacteriile
Pseudomonas methanica, Methanomonas methanica, bacteriile termofile
Methylococus capsulatus şi Pseudomonas methanitrificans.
y p f
99. Alegerea substratului
Metanol - alternativă a producerii de biomasă din metan
se fabrică din metan prin conversie salvându-se astfel surplusul de gaz
natural, dar şi din alte surse cum ar fi cărbunele, motorina, lemnul şi naftalina
este utilizat de bacteriile metanifere şi de Methylomonas methanolica,
Pseudemonas utilis, Pseudomonas extorquens, hydromicrobium sp;
actinomicite: Streptomyces sp, drojdii Hansenula polymorpha, Candida
boidinii, Torulopsis glabatra.
avantaje:
j
perfect solubil în apă,
puţine posibilităţi de explozie,
numărul de microorganisme care poate fi cultivat este mare
g p
produs de Imperial Chemical Industries Ltd (ICI) (UK) → bacteria
Methylophilus methylotrophus
100. Alegerea substratului
Polizaharide hidrolizate – celuloza şi amidonul
P li h id hid li l l i id l
hidoliza se poate realiza enzimatic sau prin tratament acid
celuloza - hidroliza se realizează sub acţiunea celulazei din fungi, ca de exemplu
Trichoderma viride
- proces scump
amidonul - procesul tehnologic este prea scump
- Rank Hovis McDougall (RHM) → proces bazat pe hidroliza amidonului;
ca microorganism a fost selectat mucegaiul Fusarium graminearum
- pus în fabricaţie sub denumirea de „Mycoprotein”
- dezavantaj - se transformă în gelatină
- se preferă creşterea microorganismului pe materiale solide, în absenţa
lichidelor - „fermentaţie semi-solidă”
101. DIGESTIA ANAEROBĂ
1.
1. Introducere
Definiţie: procesul anaerob de producere a metanului şi a dioxidului de carbon
din t i l
di materiale organice prin utilizarea unui amestec d microorganisme.
i i tili i t de i i
Fermentaţia - proces catabolic anaerob în care energia se obţine în urma
degradării compuşilor organici care pot fi atât donori cât şi acceptori de
electroni.
- microorganisme anaerobe şi facultativ anaerobe,
- substraturi: polizaharidele (celuloză, amidon, chitină),
dizaharidele (zaharoză, lactoză, manoză), hexozele (glucoză, fructoză,
galactoză), pentozele, polialcoolii (glicerol, manitol), aminoacizi, acizi
organici, purine şi pirimidine.
- produşi: alcooli, acizi, esteri şi diferiţi compuşi în stare
gazoasă (H2, CH4, CO2).
- beneficii comerciale: producerea de energie, reducerea
poluării şi controlul diferitelor mirosuri
102. 2.Caracteristici
2.Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe
2.1.
2 1 Interacţii specifice
realizarea unui complex omogen interdependent de culturi bacteriene;
formarea metanului, acetatului, H2 şi CO2:
• b t ii utilizează un număr li it t de substraturi
bacterii tili ă ă limitat d bt t i
• acţiunea bacteriile fermentative şi hidrolitice asupra deşeurilor organice →
substratele metanogene;
• producerea H2:
- bacterii fermentative
- bacterii acetogenice → acetat + H2
- bacterii metanogene → CH4 + CO2
• avantajele metodei:
- organismul introdus în bioreactor poate utiliza protonii sau acceptorii
de electroni generând H2
- H2 poate fi utilizat de bacteriile metanogene
• presiunea parţială scăzută a H2 permite creşterea bacteriilor pe substrate
reduse
-Bryant (anii ’60) → cultură pură de methanobacillus omelianskii
• probleme: dificil de identificat speciile de microorganisme din bioreactor
103. 2.Caracteristici
2.Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe
Concept: în toate procesele de digestie care utilizează ca substrat deşeuri complexe
întâlnim toate grupurile de microorganisme trofice
anii ’60: o cultură pură de metanogene
poate utiliza ca sursă de energie un
număr limitat de compuşi;
anii ’80: McInerney şi col. -clasificarea
taxonomică a metanogenelor - toate
g
speciile pot obţine energie în urma
reacţiei:
4H2 + CO2→CH4 + 2H2O ∆G0’ = - 139
kJmol-1
Figura 47. Populaţia microbiană
47
prezentă în bioreactorul de
digestie
104. 3. Tipuri de bioreactoare de digestie
deşeurile produse într-o fermă obişnuită;
instalaţii b t
i t l ţii robuste, construite di materiale l l care pot f ţi
t it din t i l locale, t funcţiona
Bioreactoare în sistem batch sau continuu, prin alimentare cu deşeuri o dată pe zi;
clasice: nu sunt încălzite, sunt amestecate manual şi sunt izolate cu materiale
locale
Bioreactoare batch:
bioreactor ce funcţionează în sistem continuu, cu agitare (CSTR –
CSTR
„continuously stirred tank reactor”)
reactor”
este un sistem continuu în bioreactor va exista în permanenţă un amestec
format din deşeuri noi care se adaugă, material nedigerat şi câteva populaţii
microbiene active;
există:
i tă
bioreactoare tubulare numite „plug flow”
bioreactoare în care are loc reţinerea microorganismelor
este necesar un vas de stocare a gazului;
întâlnit în tratamentul noroiurilor
105. 4.Tipuri
4.Tipuri de deşeuri utilizate ca substrat
în funcţie de consistenţă: deşeuri de consistenţă joasă,
Clasificare medie şi
crescută şi
deşeuri solide.
d i lid
în funcţie de conţinutul în masă uscată de substanţe solide (TS):
0,2 –1%,
1-5%, 5-12%
1 5% 5 12%
20-40% substanţă solidă.
Metode
determinare volatilităţii solidului (VS) care implică încălzirea materialului uscat
la 500 0C pentru a îndepărta materialul organic ca CO2 şi
determinarea necesarului de oxigen (COD „chemical oxigen demand”) care în
mod uzual se aplică deşeurilor cu o consistenţă mare şi implică o oxidare chimică
cantitativă a materialului organic.
BOD5 „biochemical oxygen demand measused over a 5-day period”,
TOC „total organic carbon” – utilizată pentru materialele solubile.
t t l i b ” tili tă t t i l l l bil
106. 4.Tipuri
4.Tipuri de deşeuri utilizate ca substrat
Caracteristici: un mediu d creştere b pentru populaţie şi nutrienţi - d obicei
di de t bun t l ţi i t i ţi de bi i
se utilizează un raport între atomii de C şi N de 40:1;
un pH care să varieze în jurul lui 7;
trebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitori
industriale şi alimentare –
Surse de bălegarul animal –
deşeuri: biomasa agricolă –
deşeu e d pe e e du e o şe eş
deşeurile din apele reziduale orăşeneşti
107. 5. Parametri digestiei
bacteriile mezofile : 20 – 250C şi 40 – 450C
bacterii termofile 50 – 550C şi 60 – 650C pentru,
trecerea de la temperatura mezofilă la cea termofilă care poate fi
Temperatura: accidentală şi pentru o scurtă perioadă de timp poate duce la
prelungirea timpului d producere a gazului cu câteva săptămâni.
l i i l i de d l i â ă ă â i
similar în cazul adaptării populaţiilor mezofile la condiţiile de
temperatură termofile.
digestia termofilă este mai puţin stabilă;
avantaj - distrugerea patogenilor şi a animalelor parazite
Timpul de reţinere a apei
Timpul de reţinere hidraulică (HRT) = perioada de timp cât lichidul rămâne în
bioreactor;
Volumul bioreactorului
HRT =
Volumul de deşeuri adăugate zilnic
Indicele de încărcare a bioreactorului -
Acizii graşi volatili -
Digestia în două etape -
