2. Bioanalytik
Inhaltsverzeichnis:
Gebräuchliche Einheiten.................................................................................................................................... 4
Substanzquantität, Volumen und Konzentration......................................................................................................4
Verdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])...............................................................................5
Kohlenhydrate..................................................................................................................................................... 7
Die glycosidische Bindung.......................................................................................................................................... 7
Aminosäuren und Proteïne................................................................................................................................. 9
Biuret-Test..................................................................................................................................................................... 9
Molekularmasse von Proteïnen................................................................................................................................. 10
Denaturierung von Proteïnen.................................................................................................................................... 11
Lipide.................................................................................................................................................................. 13
Biologische Membranen................................................................................................................................... 15
Die 3 häufigsten Phospholipidtypen......................................................................................................................... 15
Nucleïnsäuren.................................................................................................................................................... 17
pH-Messung und Titration................................................................................................................................ 19
Berechnung des pH-Wertes einer schwachen Säure.............................................................................................19
Berechnung des pH-Wertes von Wasser..................................................................................................................19
Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base..........20
Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung......................................................................................................20
Ampholyte.................................................................................................................................................................... 21
Elektrophorese.................................................................................................................................................. 23
Chromatographie............................................................................................................................................... 25
Ionenaustauscher-Chromatographie........................................................................................................................ 25
Gelchromatographie................................................................................................................................................... 26
Photometrie........................................................................................................................................................ 29
Gesetz von Lambert-Beer.......................................................................................................................................... 29
Konzentrationsbestimmung durch Photometrie.....................................................................................................29
Photometer und Spektralphotometer....................................................................................................................... 29
Enzymreaktionen............................................................................................................................................... 31
Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration........................................................................31
Molekularbiologische Methoden...................................................................................................................... 39
Plasmide...................................................................................................................................................................... 39
Restriktionsenzyme.................................................................................................................................................... 39
Agarose-Gelelektrophorese....................................................................................................................................... 40
Restriktionskarten...................................................................................................................................................... 40
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus......................................................................................................41
Polymerase-Kettenreaktion....................................................................................................................................... 41
Radioaktive Isotope........................................................................................................................................... 43
In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope:......................................................................................43
Bestimmung der Radioaktivität................................................................................................................................ 43
Messmethodik............................................................................................................................................................. 43
„Background".............................................................................................................................................................. 44
Zählstatistik................................................................................................................................................................. 44
Einheiten der Radioaktivität...................................................................................................................................... 44
Spezifische Radioaktivität.......................................................................................................................................... 44
Wirkung radioaktiver Strahlung auf lebendes Gewebe - Radiodosimetrie..........................................................44
Richtlinien zum Arbeiten mit 3H- und 14C-markierten Substanzen.....................................................................45
Immunologische Bestimmungsmethoden...................................................................................................... 47
Anhang............................................................................................................................................................... 49
Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 49
Formelverzeichnis...................................................................................................................................................... 50
Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 51
Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 52
-3-

3. Bioanalytik
Gebräuchliche Einheiten
Substanzquantität, Volumen und Konzentration
Substanzquantität wird als Masse oder als Stoffmenge angegeben.
Masse: Basiseinheit ist das Kilogramm. Gebräuchliche Einheiten sind:
kg = 10 3 [g]
g = 10 0 [g]
mg ( milli) = 10 −3 [g]
μg ( mikro ) = 10 −6 [g]
ng (nano ) = 10 −9 [g]
pg (pico ) = 10 −12 [g]
fg ( femto ) = 10 −15 [g]
Gleichung 1 : Gebräuchliche Masse-Einheiten
Stoffmenge: Basiseinheit ist das mol. Ein mol ist die Stoffmenge, die der Molekularmasse einer Substanz in
Gramm entspricht. Gebräuchliche Einheiten sind:
mol = 10 0 [mol]
mm ( milli) = 10 −3 [mol]
μm ( mikro ) = 10 −6 [mol]
nm (nano ) = 10 −9 [mol]
pm (pico ) = 10 −12 [mol]
fm ( femto ) = 10 −15 [mol]
Gleichung 2 : Gebräuchliche Stoffmengen-Einheiten
Beispiel zur Umrechnung von Masse in Stoffmenge und umgekehrt:
 g 
Glucose = 180  
 mol 
45[ g]
45[ g] Glucose = = 0,25[mol]
 g 
180  
 mol 
 g 
0,05[mol] Glucose = 0,05[mol] ∗ 180   = 9[ g]
 mol 
Gleichung 3 : Umrechnung: Masse in Stoffmenge und vice versa
Volumen: Basiseinheit ist der Liter. Gebräuchliche Einheiten sind:
[
1[l] = 1 dm 3 ]
1[ml] = 10 −3 [l] = 1 cm 3 [ ]
1[μl] = 10 −6
[l] = 1[mm ]
3
Gleichung 4 : Gebräuchliche Volumen-Einheiten
Konzentration wird als Massenkonzentration oder Stoffmengenkonzentration angegeben.
Massenkonzentration: Basiseinheit ist Kilogramm gelöste Substanz pro Liter Lösung. Gebräuchliche Einheiten
sind:
-4-

4. Bioanalytik
 kg  g
1  = 1 
 l   ml 
g g  mg 
1  = 10 −3   = 1 
l   ml   ml 
 mg  −6  g   μg 
1  = 10  ml  = 1 ml 
 l     
 μg  g  ng 
1  = 10 −9   = 1 
 l   ml   ml 
 ng  g  pg 
1  = 10 −12   = 1 
 l   ml   ml 
Gleichung 5 : Gebräuchliche Massenkonzentrations-Einheiten
Stoffmengenkonzentration: Basiseinheit ist mol gelöste Substanz pro Liter Lösung.
Beispiel: 1 mol/l Glucose = 180 g Glucose gelöst in H2O und durch weitere Zugabe von H2O auf 1 Liter gebracht.
Gebräuchliche Einheiten und Symbole sind:
 mol   mmol 
1  = 1 ml  = 1[M] ( molar )
 l   
 mmol  −3  mol   μmol 
1  = 10  l  = 1 ml  = 1[mM] ( millimolar )
 l     
 μmol  −6  mol   nmol 
1  = 10  l  = 1 ml  = 1[μM] ( mikromolar )
 l     
 nmol  −9  mol   pmol 
1  = 10  l  = 1 ml  = 1[nM] ( nanomolar )
 l     
Gleichung 6 : Gebräuchliche Stoffmengenkonzentrations-Einheiten
Beispiele: Eine 1 M Lösung von Glucose enthält 1 mol/l bzw. 1 mmol/ml oder 1 µmol/µl. Eine 1 mM Lösung von
Glucose enthält 1 mmol/l bzw. 1 µmol/ml oder 1 nmol/µl.
Umrechnung von Massenkonzentration in Stoffmengenkonzentration
Eine Lösung von 9 g/l Glucose ist:
g
9 
l = 0,05M → 50mM
 g 
180  
 mol 
Eine 10 nM Lösung von Glucose hat eine Massenkonzentration von:
 nmol   ng  ng μg
10 
 l   ∗ 180  nmol  = 1.800 l → 1,8 l
 
Beachten Sie die verschiedene Bedeutung
Verdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])
Volumen des Ansatzes
Verdünnungsfaktor =
Volumen der Ausgangslösung
[S Ausgangslösung ]
= [ S verdünnt ] ∗ Verdünnungsfaktor
Beispiele:
Zur Bestimmung einer Enzymaktivität werde 1,9 ml einer Enzymlösung (11 µg/ml) zu 0,5 ml Pufferlösung und 0,1 ml
Substratlösung (5 mM) gegeben. Das Substrat wird 25-fach (2,5 ml Ansatz / 0,1 ml Substratlösung) verdünnt. Im
Messansatz ist die Substratkonzentration 0,2 mM und die Enzymkonzentration 8,4 µg/ml (Verdünnungsfaktor:
2,5 ml / 1,9 ml = 1,32). Wenn im Messansatz eine Enzymaktivität von 14,4 U/ml bestimmt wird, ist die Aktivität der
verwendeten Enzymlösung (14,4 U/ml x 1,32) = 19,0 U/ml.
-5-

5. Bioanalytik
Zu 0,5 ml Serum werde eine Substanz durch Zugabe einer bestimmten Menge Fällungsreagens quantitativ ausgefällt,
der Überstand nach Zentrifugation verworfen und das Präzipitat in 1,5 ml Puffer aufgelöst. Die gesamte Menge Substanz,
die in 0,5 ml Serum enthalten war, ist nun in 1,5 ml enthalten (Volumen des Präzipitats ist vernachlässigbar klein).
Verdünnung der Substanz: (1,5 ml/ 0,5 ml) = 3-fach.
-6-

6. Bioanalytik
Kohlenhydrate
Kohlenhydrate sind primäre Oxidationsprodukte mehrwertiger Alkohole. Es sind entweder Polyhydroxyaldehyde
(Aldosen) oder Polyhydroxyketone (Ketosen). Sie werden eingeteilt in Monosaccharide, Oligosaccharide (Disaccharide,
Trisaccharide usw.) und hochmolekulare Polysaccharide.
Monosaccharide sind Aldehyde oder Ketone, die entsprechend der Anzahl ihrer C-Atome in Triosen, Pentosen,
Hexosen usw. unterteilt werden. Monosaccharide und Oligosaccharide mit gleicher Anzahl C-Atome werden aufgrund
der sterischen Anordnung (Konfiguration) der Substituënten an den C-Atomen unterschieden.
Monosaccharide und Oligosaccharide sind gut wasserlöslich. Gewisse Polysaccharide können in heißem Wasser gelöst
werden.
Zucker in Lösung haben vorwiegend zyklische Struktur
Viele Eigenschaften der Monosaccharide sind auf ihre Aldehyd- bzw. Ketogruppe zurückzuführen. Diese Gruppen
sind im Unterschied zu gewöhnlichen Aldehyd- und Keto-Funktionen nur zum kleineren Teil in freier Form vorhanden,
größtenteils liegen sie als Cyklohalbacetal (-ketal) vor. Die Ringe entstehen durch Kondensation der Aldehyd- oder
Ketogruppe mit einer alkoholischen OH-Gruppe desselben Monosaccharids. Zucker mit fünfgliedrigen Ringen werden
Furanosen, solche mit sechsgliedrigen Pyranosen genannt wegen ihrer Ähnlichkeit zu Furan und Pyran. Freie Pentosen
und Hexosen haben in der Regel Pyranosestruktur.
Dagegen liegt in Saccharose die Fructose und in Nukleïnsäuren die Ribose und Desoxyribose in der Furanoseform vor.
Bei der Ringbildung sind am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom 2 verschiedene räumliche Konfigurationen
möglich, die als α- und β-Formen bezeichnet werden (= anomere Formen). Beide gehen leicht ineinander über
(Mutarotation). Der Übergang erfolgt über die offenkettige Form.
Abbildung 1 : Ringbildung der Glucose (α- und β-Form)
Die glycosidische Bindung
Glycoside sind Zuckerderivate, bei welchen die OH-Gruppe am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom mit
einem organischen Rest (R) kondensiert ist. Je nach Konfiguration der dabei entstehenden Acetalgruppe unterscheidet
man anomere α- und β-Glycoside, je nach Art der R-Gruppe O- oder N-Glycoside.
Beispiel: Glycoside von Glucose.
Abbildung 2 : Glykoside von Glucose
-7-

7. Bioanalytik
Die wichtigsten Glycoside sind die Oligo- und Polysaccharide. Bei den einfachsten Oligosacchariden, den
Disacchariden, lassen sich 2 Bindungstypen unterscheiden. Bei der Saccharose erfolgt die glycosidische Bindung
zwischen den hemiacetalischen (bzw. hemiketalischen) OH-Gruppen beider Zuckerreste. Solche Zucker tragen deshalb
keine freie Halbacetalgruppe. Bei der Maltose erfolgt die Bindung zwischen einer hemiacetalischen und einer
alkoholischen OH-Gruppe. Disaccharide des Maltose-Typs besitzen noch eine freie Halbacetalgruppe (Pfeil in
untenstehenden Formeln).
Abbildung 3 : Disaccharide
Chemisch können glycosidische Bindungen mit Säure gespalten werden, gegen Basen sind sie stabil. Im Organismus
werden Polysaccharide und Oligosaccharide enzymatisch gespalten.
Zucker mit freier Aldehyd- oder Ketogruppe sind reduzierend
Freie Aldehyde und Ketone in Zuckern sowie die entsprechenden Hemiacetale und Hemiketale werden durch milde
Oxidationsmittel oxidiert. Weil bei dieser Reaktion das Oxidationsmittel durch den Zucker reduziert wird, spricht man
von reduzierenden Zuckern. Alle Monosaccharide sind reduzierend. Disaccharide und Oligosaccharide dagegen sind
nur reduzierend, wenn sie noch eine freie Hemiacetal- oder Hemiketalgruppe besitzen. Disaccharide vom Saccharose-Typ
sind demgemäss nicht reduzierend. Hochmolekulare Polysaccharide wie Stärke und Glycogen wirken nicht reduzierend,
weil in Polysaccharidlösungen die Konzentration der reduzierenden Molekülenden sehr niedrig ist.
In der Benedictschen Probe wird 2-wertiges Kupfer (alkalische Lösung von CuSO 4 in Natriumcarbonat und
Natriumcitrat) zur Oxidation von Zucker verwendet gemäss
Cu 2 + + Glucose → Cu + + Oxidationsprodukte von Glucose
Formel 1 : Benedict-Probe
Während der Reaktion entsteht aus dem blauen 2-wertigen Kupfer zuerst gelbes 1-wertiges Kupferhydroxid (CuOH)
und später schwerlösliches Kupfer-(I)-oxid (Cu 2O) als roter Niederschlag. Der Benedict-Test ist eine einfache
Nachweismethode für reduzierende Zucker. Neben reduzierenden Zuckern geben aber auch andere reduzierende
Substanzen eine positive Benedict-Reaktion. Für den spezifischen Nachweis einzelner reduzierender Zucker sind deshalb
enzymatische Methoden notwendig. Zum spezifischen Nachweis von Glucose wird Glucoseoxidase aus Schimmelpilz
verwendet, die folgende Reaktion katalysiert:
Glucose + O 2 + H2 O Glucoseoxi dase →Gluconsäure + H2 O 2
 
Formel 2 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 1
Das entstehende Wasserstoffperoxid wird in einer gekoppelten Reaktion dazu benutzt, eine farblose Verbindung
(Chromogen) zu einem Farbstoff zu oxidieren. Die Reaktion wird durch eine Peroxidase katalysiert.
Peroxidase
H2 O 2 + Chromogen  →Farbstoff + H2 O

Formel 3 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 2
Für den semiquantitativen Glucosenachweis z.B. im Urin dient ein Teststäbchen (Diabur-Test), das mit den beiden
Enzymen und dem Chromogen imprägniert ist. Für die quantitative Glucosebestimmung wird aus einer nicht
absorbierenden Verbindung eine im UV-Bereich absorbierende Indikatorverbindung gebildet, deren Konzentration
photometrisch gemessen wird.
-8-

8. Bioanalytik
Aminosäuren und Proteïne
Zwanzig verschiedene Aminosäuren sind die üblichen Bausteine der Proteïne. Man unterscheidet saure, neutrale und
basische Aminosäuren oder apolare (aliphatische, aromatische) und polare Aminosäuren. In den Proteïnen sind die
Aminosäuren durch Peptidbindungen miteinander verknüpft.
Formel 4 : Peptidbindung in Proteïnen
Die Aminosäurensequenz (Primärstruktur) bestimmt die 3-dimensionale Anordnung der Peptidkette im Raum
(Sekundär- und Tertiärstruktur). Häufig sind 2 und mehr Peptidketten mit ausgebildeter Sekundär- und Tertiärstruktur zu
stabilen oligomeren Molekülen zusammengelagert (Quartärstruktur).
Primäre Aminogruppen von Aminosäuren und Proteïnen werden mit der Ninhydrin-
Reaktion nachgewiesen
Ninhydrin reagiert mit Ammoniak und primären Aminogruppen zu einem blauen Farbstoff.
Formel 5 : Ninhydrin-Reaktion
α-Aminosäuren werden durch Ninhydrin oxidativ desaminiert und decarboxyliert. Auf analoge Weise reagiert auch
die ε-NH2-Gruppe der Lysin-Seitenkette. Deshalb geben auch Proteïne eine positive Ninhydrin-Reaktion. Zur
quantitativen Bestimmung von Aminosäuren wird die blaue Ninhydrin-Farbe photometrisch gemessen. Die Trennung
verschiedener Aminosäuren durch Ionenaustauscher-Chromatographie und die anschließende photometrische
Konzentrationsbestimmung mit Ninhydrin wird im sog. Aminosäurenanalysator vollautomatisch durchgeführt
Biuret-Test
Peptidbindungen bilden blau-violette Cu 2+-Komplexe
In stark alkalischer Lösung entstehen aus Proteïnen und Kupfersulfat Koordinationskomplexe zwischen Cu 2+-Ionen
und benachbarten Amid-Stickstoffatomen von Peptidbindungen. Biuret (H 2N-CO-NH-CO-NH2) ist die einfachste
Verbindung, welche einen derartigen blauvioletten Kupferkomplex bildet. Der Biuret-Test dient zur quantitativen
photometrischen Proteïnbestimmung. Die Farbe des Komplexes ist in der Regel unabhängig von der Art des Proteïns, so
dass eine für Serumalbumin bestimmte photometrische Kalibrierkurve auch für viele andere Proteïne benutzt werden
kann.
Tryptophan und Tyrosin geben den Proteïnen ein charakteristisches UV-Spektrum mit Absorptionsmaximum bei
280 nm. Wie die Spektren in Abb. 4 zeigen, trägt Tryptophan am meisten und Phenylalanin kaum zur Absorption der
Proteïne im nahen UV-Bereich bei.
Abbildung 4 : Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren
-9-

9. Bioanalytik
In Abb. 4 bedeutet εmM „millimolarer Extinktionskoëffiziënt“. Der millimolare Extinktionskoëffiziënt ist die
Absorption einer millimolaren Lösung der entsprechenden Aminosäure. Je nach dem Gehalt an aromatischen
Aminosäuren ändert die UV-Absorption von Proteïnen. In Abbildung 5 sind die UV-Spektren von Lösungen gleicher
Massenkonzentration (mg/ml) von Lysozym, γ-Globulin und Ribonuclease dargestellt. Alle Peptide und Proteïne
absorbieren sehr stark bei 220 nm aufgrund ihrer Peptidbindungen. Die 3 Proteïne enthalten unterschiedlich viel Tyrosin
und Tryptophan. Zur Konzentrationsbestimmung kann die UV-Absorption bei 280 nm benutzt werden, wegen des
variablen Gehalts an aromatischen Aminosäuren gilt jedoch eine Kalibrierkurve nur für ein bestimmtes Proteïn. Manche
Proteïne absorbieren sichtbares Licht. Für das sichtbare Absorptionsspektrum sind prosthetische Gruppen verantwortlich
(Häm, Flavin, etc.).
Abbildung 5 : Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehaltan aromatischen Aminosäuren
Die Spektren wurden mit Proteïnlösungen gleicher Konzentration (1 mg/ml) aufgenommen.
Proteïn Tryptophangehalt Tyrosingehalt
Lysozym (Hühnereiweiß) 8,6 4,0
Ovalbumin (Hühnereiweiß) 1,3 3,8
Ribonuclease (Rind) 0,0 7,9
Tabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g Proteïn
Großmolekulare Proteïne werden von kleinen Molekülen durch Dialyse oder
Gelchromatographie abgetrennt
Gewisse Cellophanmembranen sind für große Moleküle undurchlässig, für Wasser und andere kleine Moleküle
durchlässig. Wird eine Proteïn-Salzlösung in einem Cellophanschlauch für längere Zeit (Stunden) in Wasser eingetaucht,
so stellt sich für die frei passierbaren Moleküle durch Diffusion ein Konzentrations-Gleichgewicht über das gesamte
Flüssigkeitsvolumen ein. Die großen Proteïnmoleküle werden im Schlauch zurückgehalten. Der Vorgang wird Dialyse
genannt. Durch Dialyse können Proteïnlösungen entsalzt werden, oder ein Proteïn in einem Puffer A kann durch Dialyse
in einen neuen Puffer B gebracht werden. Die Hämodialyse (künstliche Niere) arbeitet nach demselben Prinzip. Mit der
Gelchromatographie ist eine feinere Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe möglich als mit der Dialyse.
Molekularmasse von Proteïnen
Die meisten Proteïne haben eine Molekularmasse (M r) im Bereich 10.000 bis 100.000.
Proteïn Molekularmasse
Glucagon (ein Peptid) 4.500
Ribonuclease 13.700
Myoglobin 17.000
Chymotrypsin 25.000
Hämoglobin 64.500
Serumalbumin 69.000
Aldolase 160.000
Phosphorylase a 390.000
Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne
- 10 -

10. Bioanalytik
Gebräuchliche Methoden zur Molekularmassebestimmung von Proteïnen sind Gelchromatographie, SDS-
Gelelektrophorese und Sedimentationsanalyse in der Ultrazentrifuge. Die heute gebräuchlichste Methode ist die SDS-
Gelelektrophorese. Bei dieser speziellen Elektrophoresemethode ist die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld
fast ausschließlich eine Funktion der Molekülgröße. Proteïne mit niedriger Molekularmasse wandern schneller als solche
mit hoher Molekularmasse. Die SDS-Gelelektrophorese ist nicht zu verwechseln mit der üblichen Proteïnelektrophorese,
bei der native Proteïne aufgrund ihrer Ladung getrennt werden.
Die Molekularmassebestimmung in der Ultrazentrifuge ist aufwendig. Sie gibt aber zusätzlich Information über die
Form und den Aggregationszustand von Proteïnmolekülen. Im künstlichen Schwerefeld der Ultrazentrifuge ist die
Sedimentationsgeschwindigkeit Vs der Partikel von ihrer Größe abhängig gemäss Vs = S@Γ. Die Zentrifugalfeldstärke Γ
wird bestimmt durch den Radius der Zentrifuge und die Tourenzahl. S ist die für die untersuchte Partikel
charakteristische Sedimentationskonstante, welche experimentell gemäss der obigen Gleichung bestimmt werden kann.
S ist unter anderem eine Funktion der Molekülmasse, und daher kann letzteres aus dem experimentell bestimmten S
berechnet werden. Die Beziehung lautet:
 ρ 
M ∗ D ∗ 1 − m 
 ρp 
S=  
R ∗T
Gleichung 7 : Berechnung der Sedimentationskonstanten
M = Molekularmasse, D = Diffusionskonstante, ρm und ρp = Dichte von Medium und Partikel, R = Gaskonstante,
T = Temperatur (absolut). Die Sedimentationskonstanten werden in Svedberg-Einheiten [S] (1 Svedberg = 10-13 sec)
ausgedrückt und auf ρm von Wasser und 20 °C normalisiert (S20,w). Typische Werte sind:
Myoglobin 2
Ribosomen- 40
Untereinheiten 60
Viren 200
Zellen (komplett) 1000
Tabelle 3 : Typische Werte für S
Denaturierung von Proteïnen
Die native Struktur von Proteïnen wird unter dem Einfluss verschiedenster Faktoren zerstört, dazu gehören Wärme,
Schaumbildung, Zusatz von organischen Lösungsmitteln, Säuren, Basen, Schwermetallionen oder hohe Konzentration
von Harnstoff. Die für die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur verantwortlichen, nicht-kovalenten Bindungen werden
teilweise oder ganz gelöst, während die für die Primärstruktur verantwortlichen kovalenten Bindungen erhalten bleiben.
Man bezeichnet diesen Prozess der partiellen oder vollständigen Entfaltung der Peptidkette als Denaturierung. Ein
denaturiertes Proteïn hat die gleiche Primärstruktur wie das native, hat aber keine einheitliche räumliche Struktur und
andere physikalisch-chemische Eigenschaften (Beispiel: Hartwerden von Eiern beim Kochen).
Bei der Denaturierung geht die biologische Aktivität verloren. (Beispiele: Hitze-Inaktivierung von Enzymen und
Proteïnhormonen). Denaturierung kann, muss aber nicht reversibel sein.
Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteïne. Denaturierte Proteïne werden von Proteasen
leichter gespalten als native: gekochtes Fleisch ist leichter verdaulich.
Proteïne sind an ihrem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich
Die Löslichkeit der Proteïne variiert stark. Globuläre Proteïne wie Serumalbumin und Globuline sind im allgemeinen
gut, Faserproteïne (Kollagen, Keratin) sehr schlecht löslich. Proteïne sind Polyelektrolyte. Elektrostatische Kräfte
zwischen Proteïnmolekülen einerseits und zwischen Proteïnmolekülen und Wasserdipolen andererseits beeinflussen die
Löslichkeit. Proteïne mit vielen geladenen Gruppen sind häufig gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteïns ist am
geringsten, wenn seine Gesamtladung gleich Null ist. Dies ist der Fall, wenn das Molekül gleich viele positive wie
negative Ladungen trägt. Man bezeichnet den pH-Wert der wässrigen Lösung, bei dem dies zutrifft, als isoelektrischen
Punkt (IEP) des Proteïns. Manche Proteïne fallen am IEP aus (= werden unlöslich). Bei pH-Werten über und unter dem
IEP bewirken negative bzw. positive Überschussladungen gegenseitige Abstoßung der Proteïnmoleküle und damit bessere
Löslichkeit.
- 11 -

11. Bioanalytik
Abbildung 6 : Löslichkeit von β-Lactoglobulin (IEP 5,2) in Abhängigkeit vom pH-Wert bei 25 °C.
Die Löslichkeit ist bei pH 6,0 mehr als 40 mal größer als bei pH 5,2.
Proteïne werden aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von Salz, organischen
Lösungsmitteln oder bestimmten Säuren ausgefällt
Zur Isolierung und Reinigung werden Proteïne häufig ausgefällt. Solche Fällungen müssen reversibel sein, soll das
Proteïn seine biologische Aktivität behalten: Ein isoliertes Enzym muss nach der Fällung wieder gelöst werden können
und unverminderte Aktivität besitzen. Bei manchen Analysemethoden stören anwesende Proteïne; sie werden deshalb
irreversibel ausgefällt (z.B. durch ein Fällungsreagens wie Perchlorsäure oder Trichloressigsäure) und durch
Zentrifugation abgetrennt. Eine solche "Deproteïnisierung" ist z.B. nötig bei der Bestimmung von Glucose im Serum.
Die meisten Fällungen beruhen auf der Änderung der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen
Proteïnmolekülen. So werden Proteïne aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln ausgefällt,
weil in organischen Lösungsmitteln die gegenseitige Anziehung der geladenen Proteïnmoleküle größer wird (Proteïne
haben ein unregelmäßiges Muster von positiven und negativen Ladungen auf ihrer Oberfläche). Gemäss dem
Coulombschen Gesetz über die Anziehung entgegengesetzt geladener Teilchen nimmt die elektrostatische Anziehung
mit abnehmender Diëlektrizitätskonstante des Mediums zu. Organische Lösungsmittel haben eine niedrigere
Diëlektrizitätskonstante als Wasser. Industriell bedeutungsvoll ist die Fällung von Blutplasmaproteïnen mit Alkohol und
Aceton (Cohn-Fraktionierung). Die Fällung geschieht bei tiefen Temperaturen, damit die Plasmaproteïne nicht
irreversibel denaturiert werden.
Zusatz eines Salzes in hoher Konzentration zu einer Proteïnlösung bewirkt die Erniedrigung der effektiven
Konzentration (Aktivität) des Wassers und dadurch eine Herabsetzung der für die Lösung des Proteïns verfügbaren
Wassermenge. Das Proteïn wird ausgefällt. Man bezeichnet die durch Salzzugabe bewirkte Ausfällung als Aussalzung.
Sie ist meist reversibel und deshalb zur Isolierung von Enzymen geeignet. Gewöhnlich wird für die Aussalzung
Ammoniumsulfat verwendet, weil es besonders gut löslich ist. Zur Ausfällung von verschiedenen Proteïnen werden
unterschiedliche Konzentrationen von Ammoniumsulfat benötigt. Ein Proteïngemisch kann deshalb durch schrittweises
Zufügen von Ammoniumsulfat aufgetrennt werden.
- 12 -

12. Bioanalytik
Lipide
Die Lipide sind eine heterogene Stoffklasse. Ein hoher Gehalt an hydrophoben Gruppen ist ihnen gemeinsam. Lipide
sind daher in organischen Lösungsmitteln gut, in Wasser schlecht löslich. Die Lipide können unterteilt werden in
einfache Lipide, komplexe Lipide und Isoprenoidlipide. Zu den einfachen Lipiden gehören die Neutralfette oder
Triacylglycerole. Es sind häufige Nahrungsbestandteile und Energiespeicher der Zelle. Zu den komplexen Lipiden werden
z.B. die Membranbestandteile Lecithin, Cerebroside und Cardiolipin gezählt. Die Isoprenoidlipide sind Abkömmlinge des
Isoprens und umfassen Verbindungen wie Cholesterin, Vitamin A, Steroidhormone und Gallensäuren. Cholesterin ist ein
universeller Membranbestandteil, aber auch Ausgangsprodukt für die Biosynthese von Gallensäuren, Steroidhormonen
und Vitamin D.
Die physikalischen Eigenschaften der Neutralfette werden durch die Struktur der
Fettsäuren bestimmt
Die Fette und Öle der Nahrung sind Gemische verschiedener Triacylglycerole. Triacylglycerole sind Verbindungen,
die aus einem Molekül Glycerol, verestert mit 3 Molekülen Fettsäure, bestehen. Sie tragen im Gegensatz zu den
komplexen Lipiden keine ionisierbaren Gruppen, daher auch der Name Neutralfette. Die physikalischen und chemischen
Eigenschaften der Neutralfette sind je nach Fettsäurenzusammensetzung verschieden. So ist der Schmelzpunkt von Fetten
um so niedriger, je kürzer die Fettsäuren und je größer die Zahl der ungesättigten Bindungen. Öle enthalten vorwiegend
Triacylglycerole mit ungesättigten Fettsäuren. Tierische Fette haben einen Schmelzpunkt, der etwas unter der
physiologischen Gewebstemperatur liegt. Fett aus dem Unterhautfettgewebe hat einen niedrigeren Schmelzpunkt als Fett
aus dem Innern des Körpers.
Fettsäuren und Lipide, die ungesättigte Fettsäuren enthalten, werden leichter oxidiert als gesättigte Fettsäuren. Das
Ranzigwerden von Fetten beruht zum Teil auf oxidativer Spaltung an den Doppelbindungen, wobei stark riechende
Aldehyde oder Säuren geringerer Kettenlänge entstehen.
Seifen, Detergentiën und Gallensäuren emulgieren wasserunlösliche Lipide
In Haushalt und Labor werden wasserunlösliche Lipide mit Seifen oder Detergentiën emulgiert. Im tierischen
Organismus haben die Gallensäuren eine ähnliche Aufgabe. Die 3 Verbindungen sind aus einem hydrophoben, apolaren
Kohlenwasserstoffgerüst und einem hydrophilen, polaren „Kopfteil“ aufgebaut. Solche Verbindungen lösen sich in
organischen Lösungsmitteln in der protonierten Form, im Wasser als Anionen. Sie sind amphiphil. In Öl-
Wasser Gemischen reichern sich amphiphile Verbindungen an der Grenzfläche zwischen Öl und Wasser an. Sie sind
oberflächenaktiv, d.h. sie erleichtern die Vergrößerung von Grenzflächen und ermöglichen so die Bildung
mikroskopisch kleiner Öltröpfchen im Wasser; das Öl wird emulgiert. Im Unterschied zu einer echten Lösung sind aber
die Lipidmoleküle in der Emulsion nicht direkt von Wassermolekülen umgeben, sondern von einer Hülle aus Seife,
Detergens- oder Gallensäuremolekülen.
Formel 6 : Unterschiede bei Seife, Detergens- und Gallensäuremolekülen
Nur emulgierte Neutralfette können durch Lipase hydrolysiert werden
Im Dünndarm werden Neutralfette durch die Pankreaslipase in Monoacylglycerole und freie Fettsäuren gespalten. Die
Lipase, ein Proteïnmolekül, ist nur in wässriger Phase löslich und aktiv. Die physiologische Funktion der Gallensäuren
besteht darin, die Neutralfette zu kleinen Tröpfchen zu emulgieren, so dass eine große Grenzfläche für den Angriff der
Lipase zur Verfügung steht.
Im Blut werden wasserunlösliche Lipide an Proteïne gebunden transportiert. Fettsäuren werden an Serumalbumin
gebunden, Neutralfette, Cholesterin und Phospholipide an spezielle Lipoproteïne. Low Density Lipoproteïne (LDL) als
hauptsächliche Träger von Cholesterin und Cholesterinestern sind besonders bedeutsam. Erhöhte Blutcholesterin-Werte
sind ein Risikofaktor für die Entstehung von Arteriosklerose. Die Chylomikronen sind lichtmikroskopisch sichtbare
Aggregate von Neutralfetten, umgeben von weniger hydrophoben Phospholipiden und hydrophilen Proteïnen. Es sind
Transportvehikel für schwerlösliche Lipide aus der Dünndarmmucosa via Lymphe in die Blutbahn.
- 13 -

13. Bioanalytik
Biologische Membranen
Biologische Membranen verschiedener Herkunft (Plasmamembran, ER 1, Mitochondriënmembran, Golgi-Apparat,
u.a.) können sich nicht nur in ihrer Proteïnzusammensetzung, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung stark
unterscheiden. Ebenso können sich je nach Zelltyp die Gesamtmenge und die Anteile der verschiedenen biologischen
Membranen unterscheiden. Die Erythrozytenmembran besteht wie andere biologische Membranen hauptsächlich aus
Lipiden und Proteïnen. Die Lipid-Doppelschicht ist 6-7 nm dick und enthält in einem Feld von 1 µm2 etwa 5 x 106
Lipidmoleküle. Die speziellen Eigenschaften der Membranlipide ermöglichen, dass sich die Lipidmoleküle spontan
aneinander lagern und durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Die Lipidfraktion umfasst
polare Lipide, vor allem Glycerolphosphatide, aber auch Sphingolipide sowie Cholesterin. Die Grundstruktur der
Glycerolphosphatide ist die mit einem Alkohol (R-OH) veresterte Phosphatidsäure.
Formel 7 : Grundstruktur der Glycerolphosphatide
R1 und R2 sind langkettige Fettsäuren. R2 ist meist eine ungesättigte Fettsäure, häufig die hochungesättigte
Arachidonsäure (20:4), die nach Abspaltung aus Phospholipiden als unmittelbare Vorstufe zur Synthese hormonähnlicher
Lipidsubstanzen dient (Prostaglandine, Thromboxane einerseits und Leukotriëne andererseits). Die polare Kopfgruppe X
bestimmt den Typ des Phospholipids.
Die 3 häufigsten Phospholipidtypen
Phospholipidtyp „Kopfgruppe“ (-X)
− CH2 CH2N( CH3 ) 3
+
Phosphatidylcholin PC
+
Phosphatidylethanolamin PE − CH2 CH2NH3
Phosphatidylserin PS (
− CH2 CH2 NH3 COO −
+
)
Phosphatidsäure −H
Tabelle 4 : Phospholipidtypen
Die Kohlenwasserstoffketten (Acylgruppen) der Membranlipide können entweder in starrem, geordnetem Verband
oder in relativ ungeordnetem, „flüssigem“ Zustand existieren. Der starre Zustand wird begünstigt durch gesättigte
Fettsäuren, während ungesättigte Fettsäuren infolge der cis-Doppelbindung(en) die geordnete Packung der Acylketten
stören. Biologische Membranen sind asymmetrisch aufgebaut. Während PC vorwiegend und Glycolipide fast
ausschließlich auf der extrazellulären Seite der Lipidmembran gefunden werden, befinden sich PE und PS hauptsächlich
auf der cytoplasmatischen Seite. Einige der neutralen Glycolipide sind für die Blutgruppenspezifität von roten Blutzellen
verantwortlich.
Abbildung 7 : Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht
Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht, die in der Darstellung eine flüssigkeitsähnliche Packungsdichte der Kohlenwasserstoffketten aufweist. Im dargestellten 30x30 Å großen
Schnitt befinden sich sechs Cholesterinmoleküle, fünf Glycerophospholipidmoleküle (3 Typen) und vier Sphingolipidmoleküle (2 Typen). Die OH-Gruppe des Cholesterinmoleküls
sitzt an der Oberfläche der Lipid-Doppelschicht, während das Steroid-Ringsystem sich im äußeren Anteil der Lipid-Doppelschicht befindet und mitverantwortlich ist für eine
Versteifung der Doppelschicht in diesem Bereich.
1
Endoplasmatisches Retikulum
- 15 -

14. Bioanalytik
Abbildung 8 : Diffusion von Phospholipidmolekülen in einer Lipid-Doppelschicht
Die spontane “Flip-Flop-Bewegung” ist ein äußerst seltenes Ereignis.
- 16 -

15. Bioanalytik
Nucleïnsäuren
Zur Reinigung und Trennung großmolekularer Nucleïnsäuren, deren Aufbau und Struktur hier nicht behandelt
werden soll, dienen ähnliche Methoden wie für Proteïne; die Gelchromatographie zur Trennung nach Molekülgröße und
die SDS-Gelelektrophorese zur Molekularmassebestimmung. Oligonucleotide können aufgrund ihres Gehalts an negativ
geladenen Phosphatgruppen durch Ionenaustauschchromatographie getrennt werden. Nucleïnsäuren sind gut
wasserlöslich, fallen aber in saurem Milieu aus. Gegen Wärme oder organische Lösungsmittel sind Nucleïnsäuren
wesentlich stabiler als Proteïne. Chemisch können Nucleïnsäuren durch Kochen in Säure in die Bausteine Phosphat,
Pentose und Nucleïnbasen zerlegt werden. Im Organismus werden sie durch Nucleasen verschiedener Spezifität zu Oligo-
und Mononucleotiden hydrolysiert. Pankreatische Ribonuclease spaltet die Esterbindung zwischen der Phosphatgruppe
eines Pyrimidinnucleotids und dem C 5 der Ribose des nächsten Nucleotids. Es entstehen freie Pyrimidin-3'-phosphate und
Oligonucleotide mit einem Pyrimidin-3'-phosphat am einen Ende.
Die Purine und Pyrimidine haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm
Das Absorptionsmaximum ist um rund 20 nm im kurzwelligeren Bereich des Spektrums als dasjenige der Proteïne.
Die Extinktionskoëffiziënten der Purine und Pyrimidine sind wesentlich höher als diejenigen von Tryptophan und
Tyrosin. Im allgemeinen sind die Spektren aller Nucleïnsäuren gleich, allerdings gibt es gewisse von Struktur und
Konformation abhängige Unterschiede. Zum Beispiel ändert sich das Spektrum von DNA bei der Denaturierung von
doppelsträngiger zu einsträngiger DNA.
Das unterschiedliche UV-Spektrum von reduzierten und oxidierten Pyridinnucleotiden
wird zur Messung vieler Enzymreaktionen benutzt
Pyridinnucleotide (NAD+↔NADP+) absorbieren ebenfalls maximal bei 260 nm, der Nicotinamidrest zeigt zusätzlich
eine vom Redoxzustand (NAD+↔NADH) abhängige Absorption im längerwelligen UV. Enzymreaktionen, die mit den
Reaktionen NAD+↔NADH oder NADP↔+NADPH gekoppelt sind, können daher bequem photometrisch verfolgt
werden. Die Methode, historisch als „Optischer Test nach Warburg" bekannt, wird im klinisch-chemischen Labor
außerordentlich häufig angewandt.
- 17 -

16. Bioanalytik
pH-Messung und Titration
Eine Säure kann nach Brönsted definiert werden als eine Substanz, die in Lösung in ein Wasserstoffion und die
konjugierte Base A- dissoziiert. Eine Base ist eine Substanz, die ein Wasserstoffion aufnehmen kann und dadurch zur
konjugierten Säure wird. Diese Beziehungen sind gegeben durch die folgenden Gleichgewichte:
AH ⇔ A + + H − ( Säure )
B + H + ⇔ BH + (Base )
Formel 8 : Brönstedsche Säure-Base-Definition
Je nach Lage des Gleichgewichts kann eine Säure in wässriger Lösung in der undissoziierten, der dissoziierten Form
oder einer Mischung der beiden vorliegen. Wasserstoffionen existieren in wässriger Lösung nur in hydratisierter Form als
H3O+. Aus Gründen der Vereinfachung wird aber im folgenden auf diese Schreibweise verzichtet.
Bei der acidimetrischen Titration von Säuren werden sowohl die freien wie auch alle potentiell dissoziierbaren
Wasserstoffionen (undissoziierte saure Äquivalenzen) erfasst. Bei der pH-Messung (pH = -log (H+)) wird nur die freie
H+-Konzentration (bzw. Aktivität) gemessen.
Starke Säuren sind in wässriger Lösung vollständig dissoziiert. Eine 0,1 M HCl-Lösung liegt beispielsweise
vollständig in Form von H+ und Cl--Ionen vor und ergibt daher eine H+-Konzentration von 0,1 M = 10-1 M, also einen pH-
Wert von 1. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern in diesem Fall das gleiche Resultat.
Bei einer schwachen Säure ist die Dissoziation unvollständig. Das Gleichgewicht zwischen der dissoziierten und
undissoziierten Form ist gegeben durch die Säuredissoziationskonstante Ka:
[ A ] + [H ] =K
− +
[ AH ] a
Gleichung 8 : Definition der Säuredissoziationskonstante
Je schwächer eine Säure, desto kleiner ist Ka. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern ungleiche Resultate.
Eine 0,1 M Essigsäurelösung ist z.B. nur zu 1,5 % dissoziiert. Ihr pH-Wert ist etwa 2,85. Gl. 8 gestattet die Berechnung
des pH-Wertes von wässrigen Lösungen schwacher Säuren, von Wasser, von wässrigen Lösungen von Salzen einer
schwachen Säure und einer starken Base und von Mischungen der Lösungen solcher Salze und der zugehörigen
schwachen Säure (Pufferlösungen).
Berechnung des pH-Wertes einer schwachen Säure
Wenn eine schwache Säure der Hauptlieferant von H+ ist, dann ist [H+] = [A-]. Gl. 8 wird somit umgeformt in:
[H ] + 2
= Ka
[ AH ]
[ H ] = K [ AH ]
+ 2
a
2 ∗ log[ H ] = log K + log[ AH ]
+
a
Gleichung 9 : Säuredissoziationskonstante einer schwachen Säure
Bei einer schwachen Säure in einer Konzentration > 10 * Ka entspricht [AH] fast der ursprünglichen
Gesamtkonzentration c [mol/l], somit
[ ]
log H + = ( log K a + log c ) / 2
pH = ( pK a − log c ) / 2
Gleichung 10 : pH-Wert einer schwachen Säure
wobei pKa = -log Ka. Damit lässt sich der pH-Wert einer schwachen Säure angenähert berechnen. Für 0,01 M
Essigsäure (pKa 4,7) ist der berechnete pH-Wert 3,35.
Berechnung des pH-Wertes von Wasser
Wasser ist eine sehr schwache Säure und die Konzentration der undissoziierten Form (H 2O) ist praktisch in allen
wässrigen Lösungen konstant (55 M). Das Dissoziationsgleichgewicht ist somit
[ H ] ∗ [OH ] = 1,7 ∗10
+ −
−16
= KA
55
Gleichung 11 : Dissoziationsgleichgewicht von Wasser
Daraus ergibt sich das Ionenprodukt, Kw, des Wassers
- 19 -

17. Bioanalytik
[H ] ∗ [OH ] = 10
+ − −14
= K W ( 25°C )
Gleichung 12 : Ionenprodukt des Wassers
In Abwesenheit anderer H -Donatoren ist [H+] = [OH-], und daher [H+]2 = l0-14, bzw. pH = 7. Dies ist der pH-Wert von
+
reinem Wasser. Wegen der Aufnahme von Kohlensäure aus der Luft ist der pH-Wert von destilliertem Wasser jedoch
meist niedriger (≈ pH 5).
Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen
Säure mit einer starken Base
Salze starker Säuren mit starken Basen sind in wässriger Lösung annähernd neutral; hingegen sind Salze schwacher
Säuren mit starken Basen leicht alkalisch. Ein solches Salz ist in wässriger Lösung vollständig dissoziiert: XA = X+ + A-.
A- reagiert mit H2O gemäss A- + HOH = AH + OH-. Da die Menge von AH gleich der Menge des gebildeten OH- ist, und
da [A-] praktisch gleich der Salz-Konzentration [Salz] ist, folgt aus Gl. 8
[ H ] = [ AHA] ∗]K
+ a
=
[OH ] ∗ K
−
a
[ −
[ Salz ]
[OH ] = [ K ]
−
H
W
+
[ H ] = [ HK ] ∗ [K ]
+ ∗
+
a
Salz
W
[ ]
log H + = log
KW K
+ log a − log
[ Salz ]
2 2 2
pH = 7 +
pK a
+ log
[ Salz ]
2 2
Gleichung 13 : pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base
Nach Gl. 13 ist der pH-Wert von 0,1 M Na-Acetat 8,85.
Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung
Lösungen, die eine schwache Säure (AH) und deren Salz (X+, A-) enthalten, werden Pufferlösungen genannt. Sie
können dank dem gleichzeitigen Vorhandensein der konjugierten Säure (AH) und Base (A-) Wasserstoffionen binden
oder abgeben. Sie vermögen deshalb Änderungen der H+-Konzentration bei Zugabe von Säuren oder Basen innerhalb
enger Grenzen abzudämpfen. Dieses als Pufferwirkung bezeichnete Verhalten spielt eine grundlegende Rolle bei der
Aufrechterhaltung des pH-Wertes in physiologischen Systemen und auch bei der Kontrolle des pH-Wertes in
Experimenten.
Pufferlösungen können durch partielle Neutralisierung einer schwachen Säure mit einer starken Base (z.B. NaOH),
oder praktischer durch Vermischen einer Lösung der Säure und der Lösung eines ihrer Alkalisalze hergestellt werden.
Der pH-Wert einer Pufferlösung bekannter Zusammensetzung lässt sich nach Gl. 8 berechnen. Unter der Annahme,
dass [AH] der zugegebenen totalen Säurekonzentration und [A-] der zugegebenen totalen Salzkonzentration entspricht
(diese Annahme ist nur gültig im Bereich, wo der Anteil von Säure oder Salz mehr als 5 % oder weniger als 95 % ihrer
Summe ausmacht), ergibt sich:
[ H ] = K [[AH]] = K [ Säure] ]
+
A
a −
[ Salz a
 [ Säure] 
log[ H ] = log K
+
 
[ Salz ] 

a

pH = pK a + log
[ Salz ] = pK + log A − [ ]
[ Säure] a
[ AH ]
Gleichung 14 : Henderson-Hasselbalch-Gleichung
Aus Gl. 14 folgt, dass pH = pKa, wenn [A-] = [AH]; d.h. der pH-Wert einer zur Hälfte neutralisierten schwachen
Säurelösung entspricht ihrem pK a-Wert.
Beispiele:
Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 5 ml 0,1 M NaOH zugefügt. Damit wird die Hälfte der Essigsäure in die Salzform
übergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 5/5 wird.
- 20 -

18. Bioanalytik
5
pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 1 = 4 ,7( pH = pK a )
5
Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 0,2 ml 1 M NaOH zugefügt. Das entspricht der Addition von 2 ml 0,1 N NaOH.
Damit wird 1/5 der Essigsäure in die Salzform übergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 1/4 wird.
1
pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 0 ,25 = 4,7 + 0 ,4 − 1 = 4,1
4
Zu 10 ml 0,15 M Na2HPO4 werden 5 ml 0,15 M NaH2PO4 zugefügt (pKa2 = 7,2)
10
pH = 7 ,2 + log = 7 ,2 + 0,3 = 7 ,5
5
Aus je 0,3 M Na2HPO4 und NaH2PO4 soll eine 0,15 M Phosphatpufferlösung mit pH = 7,4 hergestellt werden.
7 ,4 = 7 ,2 + log
[ Salz ]
[ Säure]
log
[ Salz ] = 7 ,4 − 7 ,2 = 0,2 = [ Salz ] = 1,58
[ Säure] [ Säure]
Also müssen 1,58 Teile 0,3 M Na2HP04, 1 Teil 0,3 M NaH2P04 und 2,58 Teile H20 gemischt werden.
Ampholyte
Substanzen, welche sowohl saure wie basische Gruppen enthalten, nennt man Ampholyte, z.B. Aminosäuren sind
Ampholyte. Bei Säurezusatz verhalten sich Aminosäuren wie Basen, bei Basenzusatz wie Säuren (Zwitterionen):
Formel 9 : Ampholyt
Am isoelektrischen Punkt (IEP) liegen sie als Zwitterionen vor. Der isoelektrische Punkt ist derjenige pH-Wert, bei
welchem die Nettoladung der Aminosäure gleich Null ist. Bei diesem pH-Wert wandert die Aminosäure in einem
elektrischen Feld nicht. Da Proteïne aus Aminosäuren zusammengesetzt sind, sind Proteïne auch amphoter und weisen
auch einen IEP auf. Der IEP eines Proteïns wird durch Elektrophorese bestimmt: Der pH-Wert der Proteïnlösung wird so
lange variiert, bis keine Wanderung im elektrischen Feld mehr feststellbar ist.
Berechnung des isoelektrischen Punktes einer Aminosäure
Der pKa-Wert der Carboxylgruppe wird pK1 genannt, derjenige der Aminogruppe pK2. Am isoelektrischen Punkt ist
1
pH = ∗ ( pK 1 + pK 2 )
2
Glycin:
pK 1 = 2,34
pK 2 = 9 ,60
IEP = 5,97
Gleichung 15 : IEP einer Aminosäure
Saure und basische Aminosäuren haben 3 pKa-Werte:
Formel 10 : Dissoziation von sauren und basischen Aminosäuren (Aspartat)
pK1 = 1,88, pK2 = 3,65, pK3 = 9,60, IEP = 2,77
- 21 -

19. Bioanalytik
Aminosäure Carboxylgruppe Α-Aminogruppe Seitenkettengr.2 IEP
(protonierte Form)
Glycin 2,30 9,60 5,95
Asparaginsäure 1,90 9,60 3,70 (β-COOH) 2,80
Glutaminsäure 2,20 9,70 4,30 (α-COOH) 3,50
Tyrosin 2,20 9,10 10,10 (-OH) 5,65
Cysteïn 1,90 10,70 8,40 (-SH) 5,15
Histidin 1,80 9,20 6,0 (Imidazolium) 7,60
Lysin 2,20 9,00 10,5 (ε-NH3+) 9,75
Arginin 2,20 9,00 12,5 (Guanidinium) 10,75
Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger Aminosäuren
Titrationskurven zeigen die Abhängigkeit des pH-Wertes vom Verhältnis Base / Säure
Der Verlauf der Titrationskurve einer einzelnen protonierbaren Gruppe wird von der Henderson-Hasselbalchschen
Gleichung vorausgesagt. Die Titrationskurve eines Gemisches von Aminosäuren oder einer Proteïnlösung ist die Summe
der Titrationskurven der einzelnen ionisierbaren Gruppen. In der Praxis wird statt des Verhältnisses Base / Säure die
Menge der zugegebenen Base gegen den pH-Wert aufgetragen. Titrationskurven zeigen anschaulich, dass bei Zugabe
einer gleich großen Menge Base oder Säure die pH-Änderung im Bereich der pK-Werte gering, im Bereich der
Äquivalenzpunkte groß ist. Als Faustregel gilt: Aminosäuren (aber auch andere Säuren und Basen) puffern gut im pH-
Bereich von pK ±0,5.
pH-Indikatoren sind schwache Elektrolyte, bei denen die protonierte und die nicht-
protonierte Form verschiedenfarbig sind
Sie wechseln deshalb im Bereich ihres pK a über ein Intervall von 1-2 pH-Einheiten die Farbe. Statt eine Titration am
pH-Meter zu verfolgen, kann durch Zusatz eines geeigneten Indikators der Endpunkt der Titration am Farbwechsel des
Indikators erkannt werden.
2
In Proteïnen gelten oft andere pK-Werte, weil im Proteïnverband räumlich benachbarte Seitenketten sich gegenseitig beeinflussen können. Beispiel: -COO -,
NH3+-, pKNH2 steigt, pKCOO- sinkt.
- 22 -

20. Bioanalytik
Elektrophorese
Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von geladenen Partikeln in einem elektrischen Feld. Je nachdem,
ob die Nettoladung dieser Substanzen positiv oder negativ ist, wandern sie zur Kathode (negativer Pol) oder zur Anode
(positiver Pol). Unterschiede in der Nettoladung äußern sich in Unterschieden der Wanderungsgeschwindigkeit und
können so zur Trennung von Substanzgemischen verwendet werden. Die Elektrophorese ist eine wichtige Methode zur
Trennung von Aminosäuren, Peptiden und Proteïnen. Wegen ihres Ampholytcharakters wandern diese Verbindungen je
nach ihrem isoelektrischen Punkt (IEP) und je nach dem pH-Wert des Milieus zur Kathode oder zur Anode. Wenn der
pH-Wert dem IEP des Ampholyts entspricht, erfolgt keine Wanderung.
Die gebräuchlichste Methode zur Auftrennung von Gemischen ist die Zonenelektrophorese. Eine kleine Menge des
zu trennenden Gemisches wird als schmale Zone auf einem mit Puffer getränkten Träger aufgetragen. Übliche
Trägermaterialien sind Agarose-Gel und Polyacrylamid-Gel. An den Elektrophorese-Träger wird eine Gleichspannung
angelegt. Unter dem Einfluss des im Streifen wirksamen elektrischen Feldes kommt es zur räumlichen Auftrennung der
Komponenten, die durch geeignete Anfärbemethoden lokalisiert und auch quantitativ bestimmt werden können.
Abbildung 9 : Elektropherogramm von Serum eines Menschen
a) angefärbter Elektrophoresestreifen
b) die bei der photometrischen Auswertung der Farbbänder entstandene Extinktionskurve; die Zahlen geben die Anteile der Fraktionen in Prozenten an, die durch
Integration der Flächen unter den einzelnen Peaks der Extinktionskurve ermittelt werden.
Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel Moleküle aufgrund
ihrer Ladung und ihrer Größe aufgetrennt werden. Während auf Agarose die Serumproteïne nur in die größeren Gruppen
Albumin, α1- und α2-, β1- und β2-, und γ-Globuline aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Dutzende verschiedener Serumproteïne zu unterscheiden. Ausschließlich nach der Größe aufgetrennt werden Proteïne in
der SDS-Gelelektrophorese.
Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit geladener
Teilchen im elektrischen Feld
Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die Kraft Q*E, so dass die
Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q*E/f beträgt. Für den Idealfall einer Kugel ist der Reibungskoëffiziënt
f = 6*πηr (r = Stokes'scher Radius, η = Viskosität des Mediums). Gl. 8 zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeit
proportional zum Spannungsabfall (= Feldstärke = Spannung pro Längeneinheit des Elektrophoresestreifens, V/cm) und
proportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei Aminosäuren und Proteïnen vom pH-Wert
abhängig. Der Reibungskoeffizient f ist abhängig von Form und Größe der Teilchen und von der Viskosität des Mediums.
Bei der Elektrophorese entsteht Wärme. Die pro Zeiteinheit gebildete Wärme H beträgt R*I2 (R = elektrischer
Widerstand, I = Stromstärke). Bei der Hochspannungselektrophorese (Feldstärken bis einige 100 V/cm und Stromstärken
von gegen 1 Ampère) wird die entstehende Wärme mit einem Kühlsystem abgeführt.
- 23 -

21. Bioanalytik
Chromatographie
Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden Substanzen je nach
ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationären und einer mobilen Phase ungleich verteilen. Die
verschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden in Verteilungschromatographie (Papier-, Dünnschicht-,
Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, Affinitätschromatographie) und
Gelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zu
trennenden Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nicht-kovalente
Bindungskräfte zwischen den zu trennenden Substanzen und den Molekülen der einzelnen Phasen. In der
Gelchromatographie beruht die Trennung auf der räumlich begrenzten Zugänglichkeit der verschiedenen Phasen für
unterschiedlich große Moleküle. Während der chromatographischen Trennung werden die stationäre und die mobile
Phase gegeneinander verschoben. Verschiedene Kombinationen von festen, flüssigen und gasförmigen Phasen sind je
nach Chromatographietyp möglich. Eine Übersicht gibt die folgende Tabelle.
Phase 1 Phase 2
Typ
(stationär) (mobil)
H2O in Cellulosematrix des
Papierchromatographie organisches Lösungsmittel
Papiers
Dünnschichtchromatographie (TLC, organische Lösungsmittel (im Gemisch
Aluminiumoxid, Kieselgel etc.
HPTLC) mit Säuren oder Laugen)
Gaschromatographie (GC) Silikone auf inertem Träger H2, He, N2
Flüssigkeitschromatographie organische Lösungsmittel (im Gemisch
Modifizierte Kieselgele, etc.
(HPLC) mit Säuren oder Laugen)
Ionenaustauschchromatographie
Ladungen auf inertem Träger Elektrolyt (Puffer)
(IC)
Spezifischer Ligand auf
Affinitätschromatographie Puffer, Lösungsmittel
inertem Träger
Puffer im Raum innerhalb der
Gelchromatographie Puffer außerhalb der Partikel
Partikel
Tabelle 6 : Chromatographietypen
Die einzelnen Chromatographietypen können nicht immer eindeutig der Verteilungs-, Adsorptions- oder
Gelchromatographie zugeordnet werden. Beispielsweise beobachtet man bei der Papierchromatographie gelegentlich auch
Adsorption an das Papier. Oder im Falle der Gelchromatographie werden aromatische Verbindungen wegen Adsorption
an die Gelpartikel besonders langsam aus den Gelpartikeln eluiert.
Der Rf-Wert ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier-
und Dünnschichtchromatographie
Der Rf-Wert ist der Quotient aus der Wanderungsdistanz der Substanz und der Lösungsmittelfront.
Startpunkt bis Fleckenmitte
Rf =
Startpunkt bis Lösungsmittelfront
Gleichung 16 : Allgemeine Definition des Rf-Wertes
Der Rf-Wert ist für eine Substanz in einem bestimmten Lösungsmittelsystem und bei konstanter Temperatur
charakteristisch. Zur Identifikation ist aber der direkte Vergleich von unbekannter Substanz und Referenzsubstanz im
gleichen Chromatogramm zuverlässiger. In der Gelchromatographie ist der Verteilungskoeffizient K d eine dem Rf-Wert
entsprechende Größe.
Ionenaustauscher-Chromatographie
Bei dieser Art von Chromatographie werden gelöste Ionen gegen Ionen gleichen Vorzeichens, die an ein unlösliches
Gegenion auf einem festen Träger gebunden sind, ausgetauscht. Auf diesem Prinzip beruht die Enthärtung von Wasser,
bei der Ca2+ des „harten" Wassers gegen Na + von unlöslichem Zeolith (= Natrium-Aluminiumsilikat) ausgetauscht wird.
Der entstehende Ca-Zeolith kann durch Waschen mit einer konzentrierten NaCl-Lösung wieder zum Na-Zeolith
regeneriert werden.
Die meisten Ionenaustauscher sind synthetische Polymere (Kunstharze), welche saure oder basische Gruppen
enthalten. Austauscher-Harze kann man nach dem pK-Wert ihrer ionischen Gruppen einteilen. Ein stark saurer
Kationenaustauscher kann z.B. -S0 3 - Gruppen enthalten, ein schwach saurer z.B. -COO - Gruppen. Den Austausch kann
man sich folgendermaßen vorstellen:
Harz − SO3 Na + + R − NH 3 ⇒ Harz − SO3 H 3 N − R + Na +
− + −
Harz − NH 3 Cl − + R − COO − ⇒ Harz − NH 3 OOC − R + Cl −
+ +
Formel 11 : Ionen-Austausch am Austauscherharz
- 25 -

22. Bioanalytik
Abbildung 10 : Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz
Bei pH 1 liegen A1 und A2 als Kationen vor. Beide werden am Kationenaustauscher adsorbiert und wandern nur sehr
langsam. Bei pH 6 liegt A1 als Kation vor. A2 wird als ungeladenes Zwitterion nicht adsorbiert und wandert deshalb
schneller als A1.
Statt einen Puffer konstanter Zusammensetzung zur Elution zu verwenden, können z.B. bei einem
Kationenaustauscher der pH-Wert oder die Ionenstärke oder beide schrittweise (schrittweise Elution) oder kontinuierlich
(Gradientenelution) erhöht werden. Dadurch kann die Elution der aufgetrennten Komponenten beschleunigt werden. Die
Aminosäuren eines Proteïnhydrolysats werden im automatischen Aminosäuren-Analysator durch
Ionenaustauschchromatographie quantitativ aufgetrennt (s. Abb. 11).
Abbildung 11 : Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer HPLC an einem Kationenaustausscher-Harz
Die Fläche unter jedem Signal des Chromatograms ist der Menge jeder in der Mischung vorhandenen Aminosäure proportional.
Gelchromatographie
Vernetztes Dextran („Sephadex“) bildet in gequollenem Zustand ein poröses Gel. Das Flüssigkeitsvolumen innerhalb
der Gelpartikel ist bei einem gegebenen Grad der Vernetzung nur für gelöste Moleküle unterhalb einer bestimmten Größe
zugänglich. Die Verteilung von gelösten Molekülen innerhalb und außerhalb der Gelpartikel ist somit abhängig vom
zugänglichen Volumen innerhalb der Gelpartikel. Das Totalvolumen (Vt) einer Sephadex-Säule ist die Summe des
Volumens außerhalb der Gelpartikel (Vo), des Volumens innerhalb der Gelpartikel (Vi) und des Volumens der
Gelsubstanz selbst (Vg):
Vt = V0 + Vi +V g
Gleichung 17 : Volumenverteilung in einer "Sephadex"-Säule
Das Elutionsvolumen (Ve) einer Substanz ist abhängig von Vo und vom „Verteilungskoëffiziënten“ Kd, der den
Bruchteil des Vi angibt, der für die Substanz zugänglich ist.
Ve = V0 + K d ∗Vi
Gleichung 18 : Abhängigkeit des Elutionsvolumens einer Substanz
- 26 -

23. Bioanalytik
Für große Moleküle, die nicht in das Gel eindringen können, ist Kd = 0, somit Ve = Vo. Für kleine Moleküle, die
vollständig in das Gel eindringen können, ist Kd = 1, somit Ve = Vo+Vi. Für Moleküle mit einem Kd zwischen 0 und 1 gilt:
V0 < Ve < (V0 + Vi )
Je nach der Größe der Moleküle, die voneinander getrennt werden sollen, wird verschieden stark vernetztes Sephadex
verwendet. Die gebräuchlichsten Typen sind:
Ausschluss-
Sephadex
Molekularmasse
G- 25 > 5.000
G- 50 > 25.000
G- 75 > 50.000
G-200 >200.000
Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele
Sephadex G-25 eignet sich wie die Dialyse besonders zur Entsalzung von Makromolekülen. Sephadex G-50, G-75 und
G-200 werden zur Trennung verschieden großer Proteïne verwendet. Sie dienen auch zur Schätzung der molekularen
Größe und damit der Molekülmasse eines Proteïns. Als Referenzen braucht man die Elutionsvolumina von Proteïnen mit
bekannter Molekularmasse. Für globuläre Proteïne ist das Verhältnis Ve/Vo über einen weiten Bereich umgekehrt
proportional zum Logarithmus der Molekularmasse.
Abbildung 12 : log Molekularmasse gegen Elutionsvolumen
Die Abb. 12 zeigt solche Kurven für Sephadex G-50 und G-200. Die gesuchte Molekülmasse eines Proteïns erhält
man anhand der Kurven aus dem gemessenen Elutionsvolumen.
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24. Bioanalytik
Photometrie
Gesetz von Lambert-Beer
Wird Licht durch eine Farbstofflösung gestrahlt und dabei absorbiert, so ist die Intensität des austretenden Lichts ( I)
kleiner als diejenige des eintretenden Lichts (I0). Der Quotient I/I0 wird als Durchlässigkeit D oder Transmission T
bezeichnet und ist abhängig von der Konzentration c des Farbstoffs und der Schichtdicke d: D = I/I0 = l0-k@c@d. D wird oft
in % angegeben. %D = 100*I/I0.
Ein für photometrische Messungen gebräuchlicheres Maß ist die Extinktion E oder optische Dichte OD. Sie ist direkt
proportional zu c und d:
 I 
E = − log
I
 = − log D = k ∗ c ∗ d

 0 
Gleichung 19 : Definition der Extinktion E (optischen Dichte OD)
Der Extinktionskoëffiziënt k ist charakteristisch für die absorbierende Substanz und ist abhängig von der Wellenlänge.
Der numerische Wert von k ist ferner abhängig von den Einheiten von c und d. Wird der molare Extinktionskoëffiziënt ε
verwendet, wird d in cm und c in mol/Liter (M) angegeben. Die Dimension ist dann M-1*cm -1. Der molare
Extinktionskoëffiziënt entspricht also der Extinktion einer 1 M Lösung der betreffenden Substanz bei einer Schichtdicke
von 1 cm. Bei stark absorbierenden Substanzen ist der millimolare Extinktionskoëffiziënt gebräuchlicher ( εmM = ε/1000).
Für Tryptophan beträgt εmM = 6 [mM-1*cm-1] bei 280 nm, für ATP 15 mM-1*cm-1 bei 260 nm.
Zwischen % Durchlässigkeit und Extinktion besteht die Beziehung:
 I 
log %D = log 100 + log
I
 =2−E

 0 
Gleichung 20 : Bezeihung zwischen %D und E
Durchlässigkeiten von 100 %, 10 %, 1 % entsprechen die Extinktionen 0, 1,0 und 2,0. Die meisten Photometer sind
mit einer %D-Skala (linear) und einer E-Skala (logarithmisch) ausgerüstet.
Konzentrationsbestimmung durch Photometrie
Nach dem Gesetz von Lambert-Beer kann eine unbekannte Konzentration graphisch bestimmt werden. Zuerst werden
die Extinktionen (E1, E2, E3, E4) von Standardlösungen bekannter Konzentrationen (c1, c2, c3, c4) als Kalibrierkurve
aufgezeichnet. Die Werte sollen auf einer Geraden liegen, die durch den Nullpunkt geht. Abweichungen von der
Linearität können bei höheren Konzentrationen auftreten. Die unbekannte Konzentration cx kann aus der gemessenen
Extinktion Ex auf der Kalibriergeraden abgelesen werden.
Bereich, in dem das Lambert-Beer
Gesetz nicht mehr erfüllt ist
Abbildung 13 : Gültigkeitsbereich des Lambert-Beer Gesetzes
Photometer und Spektralphotometer
Das Lambert-Beer Gesetz gilt nur für monochromatisches Licht. Um eine möglichst große Extinktion zu erhalten,
wird monochromatisches Licht gewählt, das zur Farbe der absorbierenden Substanz komplementär ist.
Monochromatisches Licht wird beim Photometer durch die Verwendung eines Filters erzeugt, beim Spektralphotometer
durch ein Prisma oder ein Diffraktionsgitter.
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25. Bioanalytik
Schematische Darstellung eines Spektralphotometers
Lichtquelle Monochromator Probenraum Photoelektrischer Empfänger
mit Anzeigegerät
Abbildung 14 : Schematische Darstellung eines Spektralphotometers
1 Lichtquelle 2 Eintrittsspalt 3 Prisma oder Diffraktionsgitter 4 Drehmechanismus für Prisma
5 Skala mit Angabe der Wellenlänge 6 Austrittsspalt 7 Küvette mit Lösung 8 Photozelle, wandelt Lichtimpulse in Strom um
9 Elektronischer Verstärker 10 Regulier-Potentiometer 11 Ampèremeter mit %D- und E-Skala
Praktisches Vorgehen bei der Photometrie
Extinktionswerte sind keine absoluten Größen, sondern Relativwerte bezogen auf eine Blindprobe. Als Blindwert dient
gewöhnlich der verwendete Puffer. Vor der Messung der Extinktion E muss das Photometer mit dem Blindwert wie folgt
kalibriert werden:
1. Lichtweg schließen, Photometeranzeige auf %D = 0 einstellen durch Kompensation des sogenannten
Dunkelstroms (geschieht bei neueren Geräten automatisch).
2. Lichtweg öffnen, Blindprobe in den Lichtweg bringen, auf Photometeranzeige E = 0 einstellen durch
Veränderung der Verstärkung des Photostroms (Nullpunkt-Abgleichung, "zero adjustment").
3. Probe in den Lichtweg bringen und E ablesen.
Wird die Wellenlänge verändert, so muss das Photometer wieder neu kalibriert werden, weil sich die Intensität der
Lichtquelle und die Empfindlichkeit der Photozelle mit der Wellenlänge ändert.
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26. Bioanalytik
Enzymreaktionen
An fast allen chemischen Umsetzungen im Organismus sind Enzyme beteiligt. Enzyme sind Katalysatoren, welche die
Stoffwechselprozesse unter den milden Bedingungen in der Zelle (niedrige Metabolitkonzentrationen, niedrige
Temperatur, neutraler pH-Wert) ermöglichen.
Die wesentliche Eigenschaft eines Enzyms ist sein Vermögen, eine spezifische Reaktion ganz enorm zu beschleunigen
(= katalysieren). Dabei werden die Geschwindigkeiten der Vorwärts- und der Rückwärts-Reaktion proportional erhöht,
d.h. das chemische Gleichgewicht der Reaktion wird nicht verändert. Die im Reaktionsablauf verbrauchte
Verbindung bezeichnet man als Substrat, die neugebildete als Produkt. Bei der Rückwärtsreaktion sind die Begriffe
vertauscht (z.B. Acetaldehyd und Ethylalkohol sind je nach Reaktionsablauf entweder Substrat oder Produkt der Alkohol-
Dehydrogenase). Enzymreaktionen lassen sich durch Bestimmung der Menge des in der Zeiteinheit gebildeten Produkts
oder des verbrauchten Substrats messen. Die reaktionsbeschleunigende Wirkung von Enzymen wird als Enzymaktivität
bezeichnet.
Enzyme sind Proteïne und als solche empfindlich gegen denaturierende Einflüsse (Wärme, Säuren, Basen etc.). Die
Aminosäurensequenz und die räumliche Struktur verschiedener Enzyme sind heute bekannt. Die Molekularmassen Mr
liegen zwischen 104 und 106 (Beispiele: Lysozym 14.400, Phosphorylase a 390.000). Viele, aber nicht alle Enzyme
bestehen aus mehreren Peptidketten (Quartärstruktur). Denjenigen Teil eines Enzymmoleküls, an den das Substrat (bzw.
Produkt) bindet und wo die katalytische Umsetzung stattfindet, bezeichnet man als aktive Stelle. Sie umfasst u.a. die an
diesen Prozessen direkt beteiligten Aminosäurereste. Bei gewissen Enzymen enthält die aktive Stelle auch nicht-
proteïnartige Bestandteile (prosthetische Gruppen).
Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hängt von folgenden Reaktionsbedingungen ab.
1. Substratkonzentration
2. Enzymkonzentration und Enzymaktivität
3. pH-Wert
4. Temperatur
5. Konzentration von Inhibitoren und Aktivatoren
Die Untersuchung der Abhängigkeit der Enzymaktivität von diesen Faktoren ist das Gebiet der Enzymkinetik.
Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration
Im Laufe einer durch ein Enzym E katalysierten Umwandlung von Substrat S in Produkt P entstehen ein Enzym-
Substrat-Komplex ES und ein Enzym-Produkt-Komplex EP als Zwischenformen. Die Reaktionssequenz ist entsprechend:
E + S ⇔ ES ⇔ EP ⇔ E + P
Formel 12 : Formaler Ablauf einer enzymatischen Reaktion
Es ist schwierig, aus diesem allgemein gültigen Schema (6 Teilreaktionen) eine experimentell leicht nachprüfbare
Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration abzuleiten. Zur Vereinfachung
beschränkt man sich deshalb auf Bedingungen, unter denen die Reaktion nur in einer Richtung abläuft, d.h. die
Rückwärts-Reaktion P ⇒ S vernachlässigt werden kann. Dies ist der Fall am Anfang der Reaktion, solange die
Konzentration von P verschwindend klein ist im Vergleich zur Konzentration von S, oder unter Bedingungen, unter
denen das Produkt laufend abgefangen wird. Das Reaktionsschema ist dann:
E + S ⇒ ES ⇒ EP ⇒ E + P
Formel 13 : Reaktionsschema einer "normalen" enzymatischen Reaktion
Wenn man weiter darauf verzichtet, den ES- und EP-Komplex gesondert zu betrachten (nur die Geschwindigkeit der
ersten Teilreaktion, der Bildung des ES-Komplexes, ist abhängig von der Substratkonzentration), ergibt sich als
einfachste Formulierung:
E + S k11 ⇒ ES ⇒ E + P
k−
Formel 14 : Einfachste Formulierung einer enzymatischen Reaktion
wobei k1, k-1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten der Teilreaktionen sind. Aus diesem Schema lässt sich eine
quantitative Beziehung zwischen der Anfangsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion und der
Substratkonzentration ableiten (Henry, 1903; Michaelis und Menten, 1913; Briggs und Haldane, 1925).
Die Herleitung ist wie folgt: Die Geschwindigkeit, mit der die Konzentration des Produkts P zunimmt, ist
d [ P]
v= = k 2 [ ES ]
dt
Gleichung 21 : Geschwindigkeit der Produktentstehung
Da v am Anfang der Reaktion, (d.h. solange die Substratkonzentration sich nicht merkbar verändert hat) konstant
bleibt, folgt aus Gl. 21, dass ES ebenfalls konstant ist. Dies bedeutet, dass die Bildungs- und Zerfallsgeschwindigkeiten
von ES gleich groß sind (= Fliessgleichgewichtszustand). Daraus folgt:
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27. Bioanalytik
k1 [ E ][ S ] = ( k −1 + k 2 )[ ES ]
Gleichung 22 : Fliessgleichgewicht einer enzymatischen Reaktion
Wir setzen für [E] = [Et]-[ES] ein, wobei [Et] die messbare Gesamtkonzentration des Enzyms darstellt. Eingesetzt in
Gl. 22 erhalten wir für [ES]
k1 [ Et ][ S ]
[ ES ] =
k −1 + k 2 + k1 [ S ]
Gleichung 23 : Umformung der Gl. 22
Gl. 23 können wir jetzt in Gl. 21 einsetzen, d.h. wir drücken die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion als
Funktion der gesamten Enzymkonzentration und der Konzentration des freien Substrats aus:
k 2 k1 [ E t ][ S ]
v = k 2 [ ES ] =
k −1 + k 2 + k1 [ S ]
Gleichung 24 : Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion
Gl. 24 ist bereits die gesuchte Geschwindigkeitsgleichung für unsere Enzymreaktion, wenn auch noch nicht in der
üblichen Form. Diese erhalten wir, indem wir Zähler und Nenner durch k 1 teilen:
k 2 [ Et ][ S ] V [S]
v= = max
k −1 + k 2 Km + [S]
+ [S]
k1
Gleichung 25 : Michaelis-Menten-Gleichung
Dieses ist die Michaelis-Menten-Gleichung. Sie beschreibt die Anfangsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion unter
der Annahme des Fliessgleichgewichts. Die Konstanten Km und Vmax sind definiert als
k −1 + k 2
Km =
k1
Vmax = k 2 [ Et ]
Gleichung 26 : Definition der Konstanten der Michaelis-Menten-Gleichung
Km wird Michaeliskonstante genannt. Vmax ist die maximale Geschwindigkeit, die bei der Konzentration [Et] erreicht
werden kann. Sie entspricht dem Zustand, wo alle Enzymmoleküle als ES vorliegen, also [ES] = [Et]. Weil bei
Enzymreaktionen [Et] << [St], kann man in Gl. 25 für [S] die Gesamtkonzentration des Substrats einsetzen.
Nach Gl. 25 ist v eine hyperbolische Funktion von [S].
Abbildung 15 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration (v gegen [S]-Darstellung)
Bedeutung von Km und Vmax
Die Michaelis-Menten-Gleichung liefert eine Arbeitsdefinition von Km. Km hat die Dimension einer Konzentration und
entspricht numerisch derjenigen Substratkonzentration, bei welcher bei gegebener Enzymkonzentration die halbmaximale
Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird (Substitution von v = Vmax/2 in Gl. 25 ergibt Km = [S]). Km kann als reziprokes
Maß der „Affinität" von S zu E aufgefasst werden. Je größer die Affinität eines Substrats zum Enzym ist, desto kleiner ist
die zum Erreichen der halbmaximalen Umsatzgeschwindigkeit benötigte Substratkonzentration, d.h. ein kleines Km
entspricht einer großen „Affinität" und umgekehrt. Es muss allerdings betont werden, dass Km nicht die
Dissoziationskonstante Kd = k-1/k1 des Enzym-Substrat-Komplexes darstellt. Wie der obere Teil der Gl. 26 zeigt, ist Km
durch drei Geschwindigkeitskonstanten bestimmt. Lediglich im Spezialfall k2 << k-1 wird der numerische Wert von Km
etwa gleich demjenigen von Kd der Reaktion E + S → ES. In allen andern Fällen ist Km > Kd.
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